王晨，劉傲蕾，吳和珍，楊艷芳，吳松濤

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430065；2.中藥資源與中藥化學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430065；3.現(xiàn)代中藥與民族藥湖北省工程研究中心，武漢 430065)

延胡索(Corydalis Rhizoma)為罌粟科植物延胡索CorydalisyanhusuoW.T.Wang的干燥塊莖，別名元胡、玄胡索、延胡；性溫，味辛、苦；歸肝、脾經(jīng)；具有活血，行氣，止痛之功效；常用于胸脅、脘腹疼痛，胸痹心痛，經(jīng)閉痛經(jīng)等[1]。川楝子(Toosendan Fructus)為楝科植物川楝MeliatoosendanSieb.et Zucc.的干燥成熟果實(shí)，別名楝實(shí)、金鈴子、苦楝子等；性寒，味苦；歸肝、小腸、膀胱經(jīng)；具有疏肝泄熱，行氣止痛，殺蟲(chóng)之功效；常用于肝郁化火，胸脅、脘腹脹痛，疝氣疼痛等[2]。金鈴子散為延胡索與川楝子等比組成的中藥復(fù)方，為理氣劑，具有疏肝泄熱，活血止痛的功效，臨床上常用于抗炎、鎮(zhèn)痛等[3-5]。

延胡索與金鈴子散同為鎮(zhèn)痛藥，但兩者只有一味藥川楝子的差異。文獻(xiàn)[6-7]對(duì)金鈴子散及其單味藥的抗炎鎮(zhèn)痛作用和血清內(nèi)源性代謝物進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)金鈴子散具有明顯且相比單味藥更優(yōu)異的抗炎鎮(zhèn)痛效果，金鈴子散及延胡索給藥后，能夠降低神經(jīng)元的興奮性，從而達(dá)到抗炎鎮(zhèn)痛的目的。焦苗苗等[8]對(duì)延胡索、烏藥、金鈴子散及小活絡(luò)丹的神經(jīng)病理性鎮(zhèn)痛作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)金鈴子散的鎮(zhèn)痛作用最強(qiáng)且見(jiàn)效快，其次為延胡索。以上學(xué)者均對(duì)金鈴子散及延胡索的鎮(zhèn)痛作用進(jìn)行了研究，其研究結(jié)果意義重大，然而其僅探索了金鈴子散及延胡索鎮(zhèn)痛的藥效作用，未對(duì)金鈴子散及延胡索鎮(zhèn)痛的作用機(jī)制差異進(jìn)行研究，存在很大的局限性。為此，通過(guò)動(dòng)物藥理實(shí)驗(yàn)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)對(duì)延胡索及金鈴子散鎮(zhèn)痛的藥效作用和作用機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)的比對(duì)研究，以期為經(jīng)典名方金鈴子散的現(xiàn)代化和臨床上鎮(zhèn)痛藥的選擇與推廣提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試動(dòng)物

體質(zhì)量為(20±2)g的SPF級(jí)BALB/c雄性小鼠40只，購(gòu)自三峽大學(xué)，許可證號(hào)：SCXK(鄂)2017-0012。小鼠自由進(jìn)食進(jìn)水，于恒溫恒濕的屏障環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。

1.2 儀器

HH-4恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司)，Milli-Q Advantage超純水儀(美國(guó)Milipore公司)，500 mL燒杯(四川蜀玻集團(tuán)有限責(zé)任公司)。

1.3 藥物與試劑

延胡索水煎醇沉液2 g/mL及金鈴子散水煎醇沉液2 g/mL均由湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)中心提供，0.6%醋酸溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配，冰醋酸購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：10000218)，0.9%生理鹽水(四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：L121071404)。

1.4 延胡索及金鈴子散的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.4.1 熱板法

調(diào)節(jié)恒溫水浴鍋至水溫恒定在(55±0.5)℃，將500 mL燒杯放入其中，燒杯底部接觸水面。每次取1只小鼠，放入燒杯內(nèi)，記錄自放入燒杯至出現(xiàn)舔后足所需時(shí)間(單位：s)，作為該鼠的痛閾值。30 s內(nèi)不出現(xiàn)舔后足者，棄之不用。依次測(cè)量各小鼠的痛閾值，取預(yù)選合格的小鼠24只，隨機(jī)分為純水對(duì)照組、生理鹽水組、延胡索液給藥組及金鈴子散液給藥組，每組6只，稱重后編號(hào)。各給藥組小鼠分別以0.2 mL/10 g的劑量灌胃，分別在給藥后15、30、60、90 min測(cè)定各小鼠的痛閾值，若小鼠在熱板上60 s仍無(wú)舔后足現(xiàn)象，取出并按60 s計(jì)。

取不同時(shí)間測(cè)定的各小鼠痛閾平均值，計(jì)算用藥后痛閾提高的百分率，計(jì)算公式為

(1)

1.4.2 扭體法

小鼠稱重，標(biāo)記后隨機(jī)分組。40只小鼠分設(shè)純水對(duì)照組、生理鹽水組、延胡索液給藥組及金鈴子散液給藥組。各組小鼠分別以0.2 mL/10 g的劑量灌胃，30 min后，各小鼠腹腔注射0.2 mL 0.6%醋酸溶液。觀察小鼠并記錄15 min內(nèi)出現(xiàn)扭體反應(yīng)的次數(shù)，計(jì)算用藥后各組的鎮(zhèn)痛百分率，計(jì)算公式為

(2)

1.5 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

為進(jìn)一步研究延胡索與金鈴子散間的差異，展開(kāi)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)對(duì)兩者的作用機(jī)制進(jìn)行比較分析。

1.5.1 活性成分的檢索和篩選

通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP, https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)、中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(TCMID, http://119.3.41.228:8000/tcmid/)、中醫(yī)藥分子機(jī)制生物信息學(xué)分析工具(BATMAN-TCM, http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)等多個(gè)中藥專項(xiàng)數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)對(duì)川楝子和延胡索的所有成分進(jìn)行檢索。通過(guò)設(shè)置閾值口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18，篩選出潛在的活性成分[9]。通過(guò)PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)逐一驗(yàn)證這些活性成分的分子質(zhì)量、化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)等，并下載其3D結(jié)構(gòu)(.SDF格式)留以檢索藥物靶點(diǎn)以及進(jìn)行分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)[10]。

1.5.2 交集靶點(diǎn)的獲取

將1.4.1節(jié)中獲得的3D結(jié)構(gòu)導(dǎo)入SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)和PharmMapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)數(shù)據(jù)庫(kù)中，當(dāng)Probability≥0時(shí)，被認(rèn)為是潛在靶點(diǎn), 綜合兩數(shù)據(jù)庫(kù)獲取藥物作用靶點(diǎn)[11-12]。通過(guò)GeneCards(https://www.genecards.org/)和MalaCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索關(guān)鍵詞“Analgesic”和“Pain”，獲取疾病相關(guān)靶點(diǎn)[13]。用Venny在線繪圖工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)表示疾病和藥物的交集靶點(diǎn)，這些交集靶點(diǎn)即可視為延胡索及金鈴子散鎮(zhèn)痛的潛在靶點(diǎn)。

1.5.3 交集靶點(diǎn)的富集分析

DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)在線平臺(tái)能夠?qū)蜻M(jìn)行注釋、可視化，并綜合發(fā)現(xiàn)基因的生物學(xué)功能和參與調(diào)控的信號(hào)通路[14]。因此，將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行富集分析。結(jié)果以GO(gene ontology)和KEGG(Kyoto encyclopedia of Genes and Genomes pathway)形式呈現(xiàn)，其中GO功能由生物過(guò)程(biological process, BP)、細(xì)胞成分(cellular component, CC)、分子功能(molecular function, MF)組成。通過(guò)GO功能富集分析，可以判斷被作用交集靶點(diǎn)的變化是否具有生物學(xué)意義，通過(guò)KEGG信號(hào)通路富集分析，可以預(yù)測(cè)這些交集靶點(diǎn)主要參與并調(diào)控的信號(hào)通路。

1.5.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction, PPI)及其衍生網(wǎng)絡(luò)在大多數(shù)生物學(xué)功能中發(fā)揮著重要作用，并且大多數(shù)蛋白質(zhì)能夠通過(guò)相互作用來(lái)激活自身的功能[15]。對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)的分析有助于從系統(tǒng)的角度研究疾病的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點(diǎn)。將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING(https://www.string-db.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并探索蛋白質(zhì)相互作用之間的聯(lián)系或潛在聯(lián)系，從而遴選出相互作用最密切，或者最為可能的潛在靶點(diǎn)基因[16]。

1.5.5 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將潛在活性成分、交集靶點(diǎn)和高度相關(guān)的信號(hào)通路導(dǎo)入Cytoscape3.9.1軟件，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”(compound-target-pathway，C-T-P)以將所有數(shù)據(jù)可視化便于分析。通過(guò)對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析，篩選出關(guān)鍵成分與核心靶點(diǎn)。

1.6 分子對(duì)接

綜合PPI和C-T-P結(jié)果，選取核心靶點(diǎn)與關(guān)鍵成分進(jìn)行虛擬分子對(duì)接。在RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www1.rcsb.org/)中檢索這些核心靶點(diǎn)，獲取該靶點(diǎn)與疼痛病癥密切相關(guān)的蛋白結(jié)構(gòu)[17]。利用Discovery Studio 2019 Client軟件對(duì)這些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行前處理，包括去除小分子配體、氫離子和清理蛋白質(zhì)等，然后將其與關(guān)鍵成分進(jìn)行虛擬對(duì)接。一般認(rèn)為，當(dāng)LibDock Score≥90時(shí)，小分子配體與蛋白質(zhì)受體間的親和力更強(qiáng)，更易結(jié)合[18]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ± SD)表示。單因素方差分析P<0.05時(shí)，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥效學(xué)研究結(jié)果

2.1.1 熱板法

通過(guò)小鼠熱板法探索并比對(duì)延胡索及金鈴子散的鎮(zhèn)痛效果，結(jié)果如表1、圖1所示。結(jié)果表明，延胡索組與金鈴子散組給藥后，各時(shí)長(zhǎng)內(nèi)痛閾值均有顯著性提高(P<0.005)。其中，延胡索組在給藥后60 min時(shí)能夠最大限度提高痛閾值，在60 min后鎮(zhèn)痛能力逐漸衰減。金鈴子散組在給藥后60 min時(shí)能夠最大限度提高痛閾值，在60 min后鎮(zhèn)痛能力趨于穩(wěn)定。在給藥60 min內(nèi)，延胡索與金鈴子散的鎮(zhèn)痛作用相似；在給藥60 min后，金鈴子散的鎮(zhèn)痛能力比延胡索更強(qiáng)(P<0.001)。

表1 給藥后各時(shí)長(zhǎng)內(nèi)痛閾平均值和平均提高率

***表示P<0.005；****表示P < 0.001

2.1.2 扭體法

通過(guò)小鼠扭體法探索并比對(duì)延胡索及金鈴子散的鎮(zhèn)痛效果，結(jié)果如表2、圖2所示。結(jié)果表明，延胡索組與金鈴子散組給藥30 min后，均能大幅降低小鼠扭體次數(shù)，有顯著的鎮(zhèn)痛率(P<0.001)。在給藥30 min后，延胡索與金鈴子散的鎮(zhèn)痛作用差異并不明顯。

表2 扭體平均次數(shù)和鎮(zhèn)痛率

*P<0.05, ****P表示<0.001

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果

2.2.1 活性成分的檢索和篩選

通過(guò)篩選，共得到47個(gè)延胡索活性成分，55個(gè)金鈴子散活性成分。通過(guò)已發(fā)表文獻(xiàn)對(duì)川楝子的報(bào)道，雖然川楝素(Toosendanin)的OB值沒(méi)有達(dá)到閾值，但它仍然是川楝子中活性很強(qiáng)的成分，因此納入結(jié)果。篩選結(jié)果如表3所示。

表3 金鈴子散中活性成分基本信息

2.2.2 交集靶點(diǎn)的獲取

通過(guò)篩選，分別獲取659個(gè)延胡索作用靶點(diǎn)、746個(gè)金鈴子散作用靶點(diǎn)以及346個(gè)鎮(zhèn)痛疾病靶點(diǎn)。利用Venny圖對(duì)藥物作用靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)進(jìn)行分析和比較，如圖3所示。藥物作用靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)即為該藥物鎮(zhèn)痛的潛在作用靶點(diǎn)。其中，延胡索鎮(zhèn)痛的潛在靶點(diǎn)有103個(gè)，金鈴子散鎮(zhèn)痛的潛在靶點(diǎn)有110個(gè)。

圖3 Venny圖

2.2.3 KEGG通路與GO功能富集分析

分別將延胡索和金鈴子散鎮(zhèn)痛的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中，對(duì)其進(jìn)行KEGG信號(hào)通路與GO功能富集注釋分析，結(jié)果如圖4、圖5所示。KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果顯示，延胡索103個(gè)潛在作用靶點(diǎn)中有99個(gè)靶點(diǎn)基因被富集(96.12%)，涉及56條信號(hào)通路，其中47條信號(hào)通路與靶點(diǎn)基因顯著相關(guān)(P≤0.05)。以下通路涉及靶點(diǎn)基因參與程度最高：神經(jīng)活性配體-受體相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction, 42個(gè)靶點(diǎn), 40.78%)、鈣離子信號(hào)通路(calcium signaling pathway, 26個(gè)靶點(diǎn), 25.24%)、5-羥色胺能突觸(serotonergic synapse, 17個(gè)靶點(diǎn), 16.50%)。金鈴子散110個(gè)潛在作用靶點(diǎn)中有106個(gè)靶點(diǎn)基因被富集(96.36%)，涉及64條信號(hào)通路，其中47條信號(hào)通路與靶點(diǎn)基因顯著相關(guān)(P≤0.05)。以下通路涉及的靶點(diǎn)基因參與程度最高：neuroactive ligand-receptor interaction(46個(gè)靶點(diǎn), 41.82%)、calcium signaling pathway(27個(gè)靶點(diǎn), 25.55%)和serotonergic synapse(17個(gè)靶點(diǎn), 15.45%)。

P越小，說(shuō)明結(jié)果與鎮(zhèn)痛越相關(guān)，結(jié)果更可靠；代表信號(hào)通路的點(diǎn)越大，說(shuō)明該通路富集的交集靶點(diǎn)數(shù)量越多

antioxidant activity為抗氧化活性；behavior為行為；binding為結(jié)合；biological adhesion為生物黏附；biological regulation為生物調(diào)節(jié)；catalytic activity為催化活性；cell為細(xì)胞；cell aggregation為細(xì)胞聚集；cell junction為細(xì)胞連接；cell killing為細(xì)胞殺傷；cellpart為細(xì)胞部分；cell proliferation為細(xì)胞增殖；cellular component organization or biogenesis為細(xì)胞成分組織或生物成因；cellular process為細(xì)胞過(guò)程；detoxification為解毒；developmental process為發(fā)展過(guò)程；extracellular region為細(xì)胞外區(qū)域；extracellular region part為細(xì)胞外區(qū)域部分；growth為生長(zhǎng)；hijacked molecular function為劫持分子功能；immune system process為免疫系統(tǒng)過(guò)程；localization為局部化；locomotion為運(yùn)動(dòng)；membrane為膜；membrane part為膜部分；membrane-enclosed lumen為膜封閉腔；metabolic process為代謝過(guò)程；molecular function regulator為分子功能調(diào)節(jié)劑；molecular transducer activity為分子換能器活性；multicellular organismal process為多細(xì)胞生物過(guò)程；multi-organism process為多生物體過(guò)程；negative regulation of biological process為生物過(guò)程負(fù)調(diào)節(jié)；nucleoid為擬核；organelle為細(xì)胞器；organelle part為細(xì)胞器部分；pigmentation為著色；positive regulation of biological process為生物過(guò)程正調(diào)節(jié)；protein-containing complex為含蛋白質(zhì)的復(fù)合物；regulation of biological process為生物過(guò)程的調(diào)節(jié)；reproduction為繁殖；reproductive process為繁殖過(guò)程；response to stimulus為對(duì)刺激的反應(yīng)；rhythmic process為節(jié)奏過(guò)程；signaling為信號(hào)；structural molecule activity為結(jié)構(gòu)分子活性；supramolecular complex為超分子復(fù)合物；synapse為突觸；synapse part為突觸部分；transcription regulator activity為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性；transporter activity為轉(zhuǎn)錄體活性；紅色為BP；綠色為CC；藍(lán)色為MF;柱形圖越高，表明該項(xiàng)目富集的交集靶點(diǎn)數(shù)量越多

GO功能富集分析結(jié)果顯示，延胡索103個(gè)潛在作用靶點(diǎn)全部被富集(100%)。其中BP富集主要涉及cellular process(103個(gè)靶點(diǎn), 100%)、biological regulation(101個(gè)靶點(diǎn), 98.06%)和response to stimulus(98個(gè)靶點(diǎn), 95.15%)。CC富集主要涉及membrane(94個(gè)靶點(diǎn), 91.26%)、organelle(83個(gè)靶點(diǎn), 80.58%)和synapse(51個(gè)靶點(diǎn), 49.51%)。MF富集主要涉及binding(100個(gè)靶點(diǎn), 97.09%)、molecular transducer activity(55個(gè)靶點(diǎn), 53.40%)和catalytic activity(46個(gè)靶點(diǎn), 44.66%)。金鈴子散110個(gè)潛在作用靶點(diǎn)全部被富集(100%)。其中BP富集主要涉及cellular process(110個(gè)靶點(diǎn), 100%)、biological regulation(108個(gè)靶點(diǎn), 98.18%)和response to stimulus(104個(gè)靶點(diǎn), 94.55%)。CC富集主要涉及membrane(101個(gè)靶點(diǎn), 91.82%)、organelle(88個(gè)靶點(diǎn), 80.00%)和synapse(54個(gè)靶點(diǎn), 49.09%)。MF富集主要涉及binding(107個(gè)靶點(diǎn), 97.27%)、molecular transducer activity(59個(gè)靶點(diǎn), 53.64%)和catalytic activity(48個(gè)靶點(diǎn), 43.64%)。

由KEGG信號(hào)通路和GO功能富集分析結(jié)果即可預(yù)測(cè)延胡索及金鈴子散鎮(zhèn)痛的可能機(jī)制。

2.2.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

分別將延胡索和金鈴子散鎮(zhèn)痛的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入到STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并使用Cytoscape3.9.1軟件對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，結(jié)果如表4、圖6所示。顯然，SLC6A4、COMT、CNR1、PTGS2和TH等在延胡索和金鈴子散的PPI網(wǎng)絡(luò)中都占據(jù)著重要地位。

當(dāng)兩蛋白質(zhì)間有相互作用時(shí)，以連線表示，連線越多，表明該蛋白質(zhì)相互作用能力越強(qiáng)，Degree數(shù)值越高

2.2.5 “C-T-P”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

分別將獲取的延胡索和金鈴子散的所有數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.9.1軟件中，構(gòu)建“C-T-P”網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果如表4和圖7所示。在圖7(a)中，共有166個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中1個(gè)黃色節(jié)點(diǎn)代表延胡索，47個(gè)藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表活性成分，103個(gè)紅色節(jié)點(diǎn)代表交集靶點(diǎn)，15個(gè)綠色節(jié)點(diǎn)代表信號(hào)通路，且有1 409條邊。在圖7(b)中，共有182個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中2個(gè)黃色節(jié)點(diǎn)代表川楝子和延胡索，55個(gè)藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表活性成分，110個(gè)紅色節(jié)點(diǎn)代表交集靶點(diǎn)，15個(gè)綠色節(jié)點(diǎn)代表信號(hào)通路，且有1 452條邊。

節(jié)點(diǎn)越大，包圍的邊越密集，表明其Degree數(shù)值越高；綠色為信號(hào)通路；紅色為靶點(diǎn)；藍(lán)色為成分；黃色為藥物

表4 PPI和“C-T-P”網(wǎng)絡(luò)中排名較高的靶點(diǎn)基因與成分的數(shù)值

網(wǎng)絡(luò)顯示了節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的聯(lián)系，并以連線表示，即邊。節(jié)點(diǎn)的相關(guān)度越高，節(jié)點(diǎn)的邊收斂越集中，節(jié)點(diǎn)的Degree數(shù)值越大。同時(shí)，同一節(jié)點(diǎn)與不同節(jié)點(diǎn)間均有聯(lián)系，體現(xiàn)了中藥多成分，多基因相互作用的特點(diǎn)。根據(jù)表2中節(jié)點(diǎn)的Degree數(shù)值選出排名靠前的關(guān)鍵基因：Drd2、Drd4、Drd1、Adra1d和Adra2c，以及排名靠前的關(guān)鍵成分：四氫小檗堿(Canadine)、唐松草坡芬堿(Thaliporphine)、延胡索甲素(Corydaline)、延胡索堿(Capaurine)和延胡索乙素(Rotundine)。根據(jù)對(duì)網(wǎng)絡(luò)的分析，延胡索和金鈴子散中的多成分能夠通過(guò)多靶點(diǎn)，作用于多途徑，從而達(dá)到鎮(zhèn)痛的目的。

2.3 分子對(duì)接

圖8中，左側(cè)為小分子配體與蛋白質(zhì)PTGS2受體結(jié)合的3D效果圖，右側(cè)為配體與受體具體結(jié)合位點(diǎn)的2D效果圖。

一般認(rèn)為，小分子配體與蛋白質(zhì)受體間親和力越強(qiáng)，結(jié)合程度越高，LibDockScore越大，成分的潛在活性越強(qiáng)。根據(jù)PPI和“C-T-P”網(wǎng)絡(luò)的分析結(jié)果，選擇Degree數(shù)值較高的9個(gè)靶點(diǎn)：SLC6A4、COMT、CNR1、PTGS2、TH、DRD2、DRD4、DRD1和ADRA2C，以及5個(gè)活性成分：四氫小檗堿、唐松草坡芬堿、延胡索甲素、延胡索堿和延胡索乙素。對(duì)接結(jié)果以LibDock Score(對(duì)接分?jǐn)?shù))作為篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析，結(jié)果如表5和圖8所示。結(jié)果表明，所選擇的核心靶點(diǎn)與關(guān)鍵成分的對(duì)接分?jǐn)?shù)均大于閾值90，顯示出良好的結(jié)合活性，表明這5個(gè)關(guān)鍵成分在鎮(zhèn)痛的過(guò)程中起著重要作用，這9個(gè)核心靶點(diǎn)為延胡索及金鈴子散鎮(zhèn)痛的潛在作用靶點(diǎn)。

表5 分子對(duì)接結(jié)果

圖8 部分分子對(duì)接結(jié)果

3 討論

熱板法和扭體法是篩選鎮(zhèn)痛藥的經(jīng)典方法[19]。小鼠的足部受熱板刺激而產(chǎn)生疼痛時(shí)，會(huì)發(fā)生舔舐后足(后足為身體重量支撐點(diǎn))的特殊反應(yīng)，以接觸熱板到舔舐后足所需的時(shí)間作為痛閾值，以此作為觀測(cè)指標(biāo)，比對(duì)藥物的鎮(zhèn)痛藥效作用。當(dāng)小鼠腹腔受化學(xué)藥物刺激而產(chǎn)生疼痛時(shí)，表現(xiàn)為扭體反應(yīng)(腹部收縮內(nèi)凹，伸展后肢，臀部抬高，蠕行)，以此作為指標(biāo)，比對(duì)藥物的鎮(zhèn)痛藥效作用。藥效學(xué)結(jié)果顯示，延胡索與金鈴子散均能在一定時(shí)間內(nèi)提高小鼠的痛閾值和減輕外部刺激給小鼠帶來(lái)的痛感，表明兩者均具有良好的鎮(zhèn)痛效果。但相比延胡索，金鈴子散的鎮(zhèn)痛作用更持久。延胡索本身便為鎮(zhèn)痛藥，在與川楝子配伍組成金鈴子散后，鎮(zhèn)痛作用更好更持久，這與中醫(yī)方劑配伍理論中協(xié)同增效相吻合。

活性成分和靶點(diǎn)基因一直是中醫(yī)藥現(xiàn)代化的重點(diǎn)問(wèn)題。現(xiàn)有方法主要關(guān)注藥物指標(biāo)性成分及其潛在藥理作用，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究由于與中藥的多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)相契合，成為一種能夠更有效識(shí)別中藥活性化合物和靶點(diǎn)基因的方法[20-22]。以系統(tǒng)生物學(xué)理論為基礎(chǔ)，通過(guò)對(duì)藥物和疾病進(jìn)行多平臺(tái)、多軟件、多途徑的分析和探索，共獲得47個(gè)延胡索活性成分和55個(gè)金鈴子散活性成分以及103個(gè)延胡索潛在作用靶點(diǎn)和110個(gè)金鈴子散潛在作用靶點(diǎn)，這些可能是延胡索和金鈴子散鎮(zhèn)痛過(guò)程中的可能信息。GO功能和KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果顯示，延胡索和金鈴子散的交集靶點(diǎn)共同涉及細(xì)胞膜、細(xì)胞器、突觸等，在分子水平上，交集靶點(diǎn)涉及結(jié)合，分子換能器活性，催化活性等，與神經(jīng)活性配體受體相互作用、鈣離子信號(hào)通路、5-羥色胺能突觸等相關(guān)通路有關(guān)。通過(guò)對(duì)構(gòu)建的“成分-靶點(diǎn)-通路”拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，關(guān)鍵活性成分四氫小檗堿、唐松草坡芬堿、延胡索甲素、延胡索堿和延胡索乙素，以及核心靶點(diǎn)SLC6A4、COMT、CNR1、PTGS2、TH、DRD2、DRD4、DRD1和ADRA2C在網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)著核心位置，推測(cè)為延胡索和金鈴子散鎮(zhèn)痛的關(guān)鍵成分和核心靶點(diǎn)。分子對(duì)接結(jié)果表明，5個(gè)關(guān)鍵成分與9個(gè)核心靶點(diǎn)間均存在非常強(qiáng)的對(duì)接能力，提示這5個(gè)關(guān)鍵成分可能為延胡索和金鈴子散鎮(zhèn)痛的藥效物質(zhì)，而這9個(gè)蛋白可能為延胡索和金鈴子散的作用靶點(diǎn)。

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，推測(cè)延胡索和金鈴子散中的四氫小檗堿、唐松草坡芬堿、延胡索甲素、延胡索堿和延胡索乙素可能通過(guò)與細(xì)胞膜及細(xì)胞器結(jié)合，調(diào)控SLC6A4、COMT、CNR1、PTGS2、TH、DRD2、DRD4、DRD1和ADRA2C的表達(dá)，作用于神經(jīng)活性配體受體相互作用、鈣離子信號(hào)通路、5-羥色胺能突觸等相關(guān)通路，影響Ca2+釋放，從而影響神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放，達(dá)到鎮(zhèn)痛的目的，并且這5個(gè)關(guān)鍵成分均歸屬于延胡索，而被大量報(bào)道的具有較強(qiáng)鎮(zhèn)痛活性的川楝素[23-24]并沒(méi)有被篩選出，說(shuō)明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)仍舊有較大的局限性，需要進(jìn)一步完善。對(duì)延胡索和金鈴子散的作用機(jī)制進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)藥效物質(zhì)，作用靶點(diǎn)及信號(hào)通路均沒(méi)有明顯差異，而藥效物質(zhì)均為臣藥延胡索成分，作為君藥的川楝子卻沒(méi)有關(guān)聯(lián)度較高的成分，推測(cè)金鈴子散中臣藥延胡索的藥效作用優(yōu)于君藥川楝子。

4 結(jié)論

延胡索與金鈴子散均具有良好的鎮(zhèn)痛作用，金鈴子散的鎮(zhèn)痛效果相比延胡索要更加持久；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果表明，延胡索與金鈴子散均能夠通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路達(dá)到鎮(zhèn)痛的目的，且作用機(jī)制沒(méi)有明顯差異。但同時(shí)，由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法本身的局限性，作用機(jī)制預(yù)測(cè)結(jié)果與臨床前實(shí)際研究結(jié)果可能存在一定的差異性，因此有待體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。