冉倩 梁鴿 張翠涵 程澤芳 沈長虹 程芳 姚子晴 張若琪

摘要：目的 基于高分辨質(zhì)譜儀、靶向定量代謝組學(xué)技術(shù)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討附子理中湯（FZLZD）治療潰瘍性結(jié)腸炎（UC）的活性成分及作用機(jī)制。方法 首先，通過高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)附子理中湯進(jìn)行定性檢測(cè)，將其測(cè)定的成分進(jìn)行驗(yàn)證并結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道篩選出可能活性化合物；然后利用靶向定量代謝組學(xué)技術(shù)、結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法，對(duì)篩選出的化合物進(jìn)行靶向定量；最后運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)附子理中湯治療潰瘍性結(jié)腸炎可能的機(jī)制。結(jié)果 本研究共獲得苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、黨參炔苷、8-姜酚、10-姜酚、甘草苷、甘草素、甘草酸、6-姜烯酚、苯甲酰次烏頭原堿、烏頭原堿、6-姜酚、次烏頭堿、腺苷、異甘草苷、異甘草素和甘草次酸20個(gè)活性成分，各不同來源的附子和甘草的活性成分含量差異較大，附子理中湯治療潰瘍性結(jié)腸炎與癌癥通路、癌癥中的蛋白聚糖、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、AGE-RAGE信號(hào)通路，以及IL-6、IL-8等炎癥通路有關(guān)。結(jié)論 雖然各來源都選用合格中藥，但質(zhì)量標(biāo)志物的含量范圍會(huì)影響其臨床效果；將附子、甘草含量差異較大的活性成分：甘草酸、異甘草素、甘草素、苯甲酰次烏頭原堿、甘草苷、甘草次酸作為主要篩選中的Q-marker；此研究有助于對(duì)中藥不同來源及其主要活性成分含量進(jìn)行質(zhì)量控制，對(duì)中藥-疾病可能的通路靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，為后續(xù)進(jìn)一步的藥理作用及機(jī)制研究提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：附子理中湯；潰瘍性結(jié)腸炎；質(zhì)量控制；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；Q-marker；靶點(diǎn)；通路

中圖分類號(hào)：R285文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Study on the active ingredients and mechanism of Fuzi lizhong decoction in the intervention of ulcerative colitis based on UPLC-MS and network pharmacology

Ran Qian1， Liang Ge2， Zhang Cuihan1， Cheng Zefang1， Sheng Changhong1，

Cheng fang， Yao Ziqing1 and Zhang Ruoqi1

（1 College of Pharmacy，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources， Chengdu 611137; 2 Metabolomics and Proteomics Technology Platform， West China Hospital， Sichuan University， Chengdu 610041）

Abstract Objective High-resolution mass spectrometry， targeted quantitative metabolomics and network pharmacology were used to explore the active ingredients and mechanism of action of Fuzi lizhong decoction （FZLZD） in the treatment of ulcerative colitis （UC）.? Methods First of all， the qualitative detection of FZLZD was carried out by high-resolution liquid chromatography， the components determined were verified， and the possible active compounds were screened out in combination with relevant literature reports. Thereafter， targeted quantitative metabolomics techniques， combined with multivariate statistical analysis， were used to quantify the targeted compounds. Finally， network pharmacology was applied to predict the possible mechanisms of the treatment of UC with FZLZD. Results A total of 20 active ingredients were obtained in this study，including benzoylmesaconine， benzoylaconitine， atractylenolide Ⅰ， atractylenolide Ⅱ， atractylenolide III， lobetyolin， 8-gingerol， 10-gingerol， liquiritin， liquiritigenin， glycyrrhizic acid， 6-shogaol， benzoylhypacoitine， aconine， 6-gingerol， hypaconitine， adenosine， isoliquiritin， isoliquiritigenin， β-glycyrrhetinic acid. The content of the active ingredients of the various sources of monkshood and liquorice varied considerably. FZLZD for the treatment of collapse and cancer pathway， proteoglycans in cancer， EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance and AGE-RAGE signaling pathway， and inflammatory pathways such as IL-6 and IL-8 are related. Conclusion Although qualified herbs are used in all sources， the range of quality markers can affect their clinical effects. The active ingredients with widely varying contents of monkshood and liquorice： glycyrrhizic acid， isoliquiritigenin， liquiritigenin， benzoylhypacoitine， liquiritin， glycyrrhetinic acid were used as Q-markers in the primary screening. This study is useful for quality control of different sources of Chinese medicines and their main active ingredient contents， and for prediction of possible pathway targets of Chinese medicines-diseases， providing a basis for further pharmacological action and mechanism studies to follow.

Key words Fuzi lizhong decoction（FZLZD）; Ulcerative colitis（UC）; Quality control; Network pharmacology; Q-marker; target; Pathway

附子理中湯出自《三因極—病證方論》卷二，其由附子、人參、干姜、白術(shù)以及甘草5味中藥，按1：1：1：1：1組成[1]，后因黨參和人參功效類似，價(jià)格更為便宜，現(xiàn)在多以黨參入藥，該方有補(bǔ)虛回陽，溫中散寒之效，據(jù)報(bào)道其對(duì)于胃腸道疾病如潰瘍性結(jié)腸炎[2]、腹瀉[3]和胃潰瘍[4]等有較好療效。其中君藥附子具有抗炎鎮(zhèn)痛[5]作用，但附子多用會(huì)引起毒性反應(yīng)[6]，發(fā)揮效用和毒性作用都是由于附子含有多種類型且活性和毒性不同的烏頭堿，其中包含活性和毒性都強(qiáng)的雙酯型生物堿、毒性較弱而活性較強(qiáng)的單酯型生物堿，以及活性和毒性都較弱的醇胺型生物堿，因此有必要建立一種可測(cè)定單、雙酯型生物堿的方法，從而控制附子的毒性，并確保臨床療效[7]。

附子理中湯作為經(jīng)典中藥方劑，為了其更好地發(fā)揮療效，藥材來源及質(zhì)量必須得到保證，中藥復(fù)方有多成分多靶點(diǎn)的特點(diǎn)[8]。中藥的活性成分和差異標(biāo)記物是中藥質(zhì)量控制的常用方法，對(duì)于復(fù)方來說往往是多種中藥的多種成分協(xié)同發(fā)揮藥效，所以不同中藥及其不同成分的含量控制及其重要[9]。劉昌孝院士在2016年首次提出中藥質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker， Q-Marker）的概念[10]，其由“屬性-效應(yīng)-成分”理論衍生而來的，將中藥的活性化合物，治療疾病的成分、靶點(diǎn)聯(lián)合，是一種有效體現(xiàn)中藥治療疾病的成分、及其穩(wěn)定性、特異性的策略[11]。

高分辨質(zhì)譜具有高分辨率和高特異性運(yùn)用廣泛[12]，三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀有方便快捷、靈敏度高[13]等特點(diǎn)，先用高分辨質(zhì)譜儀進(jìn)行定性，再用三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀進(jìn)行靶向定量，二者結(jié)合可以更好地找到發(fā)揮藥效的活性物質(zhì)作為Q-Marker。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)（network pharmacology）從系統(tǒng)生物學(xué)和生物網(wǎng)絡(luò)平衡的角度闡釋疾病的發(fā)生發(fā)展過程、從改善或恢復(fù)生物網(wǎng)絡(luò)平衡的整體觀角度認(rèn)識(shí)藥物與機(jī)體的相互作用，以研究方藥、疾病之間的關(guān)聯(lián)，其核心是“網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)”，交叉多學(xué)科、利用多角度，探索藥物與治療對(duì)象之間的分子關(guān)聯(lián)，從而揭示藥物的系統(tǒng)性藥理機(jī)制[14-15]。

本文通過高分辨質(zhì)譜儀對(duì)附子理中湯的凍干粉進(jìn)行定性，將檢測(cè)到的化合物結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的活性成分進(jìn)行定量，再結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，對(duì)附子理中湯治療潰瘍性結(jié)腸炎的活性成分進(jìn)行預(yù)測(cè)，以期為附子理中湯系統(tǒng)性地質(zhì)量評(píng)價(jià)，為附子理中湯治療潰瘍性結(jié)腸炎的后續(xù)研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物

1.1.1 原料藥

附子理中湯由白附片（9 g）、黨參（9 g）、麩炒白術(shù)（9 g）、干姜（9 g）、炙甘草（9 g）組成。這5種藥材的植物來源分別為附子、黨參、白術(shù)、干姜、甘草。16批藥用植物材料購北京同仁堂（本文縮寫為TRT，后文同）、杏林藥房（XLYF）、四川新荷花中藥飲片股份有限公司（XHH）和成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院（ZYD）。中藥材來源的詳細(xì)信息列于下表1。

1.1.2 試劑

苯甲酰新烏頭原堿（批號(hào)MUST-22031710）、苯甲酰烏頭原堿（批號(hào)MUST-22042014）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ（批號(hào)MUST-21051010）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ（批號(hào)MUST-21111614）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ（批號(hào)MUST-21110617）、黨參炔苷（批號(hào)MUST-22061005）、8-姜酚（批號(hào)MUST-21032804）、10-姜酚（批號(hào)MUST-21063004）、甘草苷（批號(hào)MUST-22042114）、甘草素（批號(hào)MUST-22041602）、甘草酸（批號(hào)MUST-21120305）、6-姜烯酚（批號(hào)MUST-21060810）、苯甲酰次烏頭原堿（批號(hào)MUST-22030911）、烏頭原堿（批號(hào)MUST-21060306）、6-姜酚（批號(hào)MUST-22011411）、次烏頭堿（批號(hào)MUST-22032212）、腺苷（批號(hào)MUST-21070613）、異甘草苷（批號(hào)MUST-21051501）、異甘草素（批號(hào)MUST-21081312）和甘草次酸（批號(hào)MUST-22031710），均購自成都曼思特生物科技有限公司，以上所有對(duì)照品的純度均大于98%。甲醇、乙腈為色譜純，均購自美國Fisher公司。水為超純水。

1.1.3 儀器

Exion LC-X500R高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（美國AB Sciex公司）；UPLC - QTRAP 6500+（美國AB Sciex公司）；電子天平（Sartorius，SQP）。

1.2 湯劑提取及凍干粉制備

取附子（白附片）9 g、黨參9 g、白術(shù)（麩炒白術(shù)）9 g、干姜9 g、甘草（炙甘草）9 g剪碎（小顆粒狀），全部藥物先用潔凈水浸泡30 min，附子先煎1 h。第1次煎煮加入1：8的潔凈水，武火煮沸，文火煮30 min，過濾濾液；第2次煎煮加入1：5的潔凈水武火煮沸，文火煮20 min，過濾濾液；第3次煎煮加入1：3的潔凈水武火煮沸，文火煮15 min，過濾濾液，合并3次濾液。在減壓濃縮（溫度40 ℃，壓力-0.09 MPa）至濃度約

1 g/mL的濃縮液，然后將濃縮液先放置于冰箱冷凍，再放入凍干機(jī)制得附子理中湯凍干粉[1 g附子理中湯凍干粉相當(dāng)于2～4 g（2.75～3.93 g）生藥量]。

2 方法與結(jié)果

2.1 AB SCIEX QTOF系統(tǒng)測(cè)定附子理中湯的成分

2.1.1 色譜及質(zhì)譜條件

液相條件：SCIEX Exion LC，色譜柱Waters Acquity UPLC HSS T3（100 mm × 2.1 mm，1.8 ?m）；流動(dòng)相：A相為水相（含 2 mmol/L甲酸胺和 0.1%甲酸水），B相為乙腈，梯度洗脫程序見表2，體積流量0.3 mL/min；進(jìn)樣體積：1 μL。

質(zhì)譜條件：SCIEX Triple TOF System X500；MS mode （pos/neg）：00～1000 m/z；MS/MS mode-10 MS/MS，each 50～1000 m/z；數(shù)據(jù)采集 （IDA+DBS pos & neg）：在SCIEX QTOF 100HZ 的掃描速度下，信息依賴采集方式（IDA）結(jié)合獨(dú)有的動(dòng)態(tài)背景扣除（DBS）。鑒定：SCIEX OS軟件&天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫。

2.1.2 樣品的制備

取2 g凍干粉，加入 10 mL的70%甲醇，渦旋至膏狀樣溶解，超聲1 h，13000 r/min離心10 min后取上清進(jìn)樣。

2.1.3 質(zhì)譜鑒定結(jié)果

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道附子理中湯主要的活性化合物為苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、黨參炔苷、8-姜酚、10-姜酚、甘草苷、甘草素、大黃素、甘草酸、6-姜烯酚、苯甲酰次烏頭原堿、烏頭堿、新烏頭堿、烏頭原堿、6-姜酚、次烏頭堿、腺苷、異甘草苷、異甘草素、甘草次酸等23種化合物[16-18]，根據(jù)其結(jié)果對(duì)高分辨檢測(cè)到的化合物依次進(jìn)行鑒定，質(zhì)量偏差范圍設(shè)定為5 ppm，通過一級(jí)質(zhì)量偏差，同位素比例偏差，二級(jí)譜圖及標(biāo)品保留時(shí)間進(jìn)行確認(rèn)，鑒定到了除大黃素、烏頭堿和新烏頭堿以外的20種化合物，見表3。鑒定結(jié)果確信度高，且質(zhì)量偏差均在2 ppm以內(nèi)，表明儀器精度高。其中 N/A 表示該化合物在該樣品中未檢出。根據(jù)甘草苷和異甘草苷，甘草素和異甘草素的單標(biāo)確認(rèn)，兩對(duì)同分異構(gòu)體實(shí)現(xiàn)分離。

2.2 AB SCIEX QTRAP 6500+系統(tǒng)靶向定量附子理中湯的20種活性成分

2.2.1 色譜及質(zhì)譜條件

液相條件：色譜柱Shimadzu （100 mm × 2.1 mm， 2 ?m）；流動(dòng)相為水（含 0.1% 甲酸）（A）-乙腈（含 0.1% 甲酸）（B）；梯度洗脫，洗脫程序見表4；體積流量0.3? mL/min；進(jìn)樣體積1 μL。

質(zhì)譜條件：QTRAP 6500+，采用正負(fù)模式同時(shí)監(jiān)測(cè)，離子源溫度450 ℃，噴霧氣（Gas 1）為50 psi，輔助氣（Gas 2）為50 psi。離子噴霧電壓為5500 V，-4500 V。質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）用于定量。對(duì)每個(gè)離子對(duì)的碎裂電壓、碰撞能量值和停留時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，以獲得最高豐度。

2.2.2 樣品制備

待測(cè)樣品溶液：精密稱量S1～S16這16個(gè)批次的樣品，加入甲醇依次稀釋成100 mg/mL的樣品溶液儲(chǔ)備液，再加入50%乙腈分別稀釋成5和1 mg/mL的待測(cè)液。對(duì)照品溶液：精密稱量苯甲酰新烏頭原堿1.57 mg、苯甲酰烏頭原堿1.58 mg、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ1.74 mg、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ1.42 mg、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ1.28 mg、黨參炔苷1.79 mg、8-姜酚1.33 mg、10-姜酚1.66 mg、甘草苷1.10 mg、甘草素1.31 mg、甘草酸1.47 mg、6-姜烯酚1.53 mg、苯甲酰次烏頭原堿1.65 mg、烏頭原堿1.03mg、6-姜酚1.94mg、次烏頭堿 2.54 mg、腺苷1.58mg、異甘草苷1.51 mg、異甘草素1.63 mg、甘草次酸1.54 mg，通過用甲醇溶解，并用50%乙腈水適當(dāng)稀釋混合儲(chǔ)備溶液來制備一組標(biāo)準(zhǔn)溶液，以獲得校準(zhǔn)曲線。

2.2.3 線性關(guān)系考察

將制備的系列濃度混合對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下條件檢測(cè)，獲得各對(duì)照品的XIC提取離子流色譜圖，以各對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積值為縱坐標(biāo)（Y），計(jì)算線性回歸方程，以R2＞0.995 作為線性關(guān)系良好的考察依據(jù)，見表5。

2.2.4 精密度試驗(yàn)

取同一份樣品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣

1 μL，計(jì)算6次進(jìn)樣中各對(duì)照品的XIC提取離子流色譜圖峰面積值的 RSD 值，見表5。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批附子理中湯樣品溶液1份，分別于 0、2、4、6和8 h進(jìn)樣檢測(cè)，每次進(jìn)樣1 μL，計(jì)算5次進(jìn)樣中各對(duì)照品的XIC提取離子流色譜圖峰面積值的 RSD 值，見表5。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

平行制備6份同一批次附子理中湯樣品溶液，分別進(jìn)樣1 μL，計(jì)算6份樣品中各成分XIC提取離子流色譜圖峰面積值的RSD值，見表5。

2.2.7 樣品測(cè)定

取各藥材制備16個(gè)批次附子理中湯（S1～S16）樣品溶液，按優(yōu)化的檢測(cè)條件測(cè)定，計(jì)算各成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，見表6。

2.2.8 多元統(tǒng)計(jì)分析

（1） 聚類分析（cluster analysis）

將樣品進(jìn)行聚類分析，如圖1所示，來源于新荷花（XHH）的S13、S11、S12相差較遠(yuǎn)，其余3個(gè)來源聚類較好。說明新荷花的3個(gè)批次含量差異較大，同仁堂（TRT）、杏林藥房（XLYF） 和中醫(yī)大（ZYD）的3個(gè)來源各自批次的含量差異較小。

（2）差異化合物的篩選

為了更好地評(píng)價(jià)樣品質(zhì)量一致性，20種分析物（16×20）的含量數(shù)據(jù)導(dǎo)入（https：//www.metaboanalyst.ca），通過方差分析方法（ANOVA）和偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）進(jìn)行分析。首先采用ANOVA對(duì)樣品進(jìn)行方差分析。再采用運(yùn)用PLS-DA方法，即是一種用于優(yōu)化不同組樣品之間的分離的監(jiān)督統(tǒng)計(jì)模型，獲得了4個(gè)來源的16個(gè)樣品之間的分離趨勢(shì)，見圖2，其中R2＞Q2，且均大于0.5，說明模型可靠；為了防止模型過擬合，采用了100次的置換檢驗(yàn)，P＜0.02，說明模型沒有過擬合。

為了篩選主要差異化合物，以P＜0.05和VIP值＞1作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，獲得的差異化合物分別為：甘草酸、異甘草素、甘草素、苯甲酰次烏頭原堿、甘草苷、甘草次酸，見表7。苯甲酰次烏頭原堿為該經(jīng)典方中的君藥附子的單酯二萜生物堿類成分，這也是《中國藥典》含量測(cè)定的規(guī)定成分。

2.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

2.3.1 藥物活性成分的潛在靶點(diǎn)篩選

將20個(gè)成分分別在PubChem網(wǎng)站獲得Smiles號(hào)，導(dǎo)入ShwissTarget Prediction網(wǎng)站（http：//www.swisstargetprediction.ch/）得到預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)后共計(jì)489個(gè)。

2.3.2 潰瘍性結(jié)腸炎靶點(diǎn)篩選

通過GeneCards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫分別獲得潰瘍性結(jié)腸炎的作用靶點(diǎn)，去除重復(fù)值后得到4896個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)，根據(jù)Revelance score 值大于10篩選得潛在靶點(diǎn)374個(gè)。

2.3.3 藥物和疾病靶點(diǎn)的交集

將得到的藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)通過Venny2.1.0軟件作圖工具平臺(tái)取交集，得到附子理中方和潰瘍性結(jié)腸炎的共同作用靶點(diǎn)36個(gè)，圖3。

2.3.4 PPI（protein-protein interaction）蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

按照交集靶點(diǎn)和交集靶點(diǎn)經(jīng)KEGG富集分析所得通路的相互關(guān)系構(gòu)建network文件和type文件，導(dǎo)入Cytoscape3.9.1中，以構(gòu)建靶點(diǎn)-通路圖。經(jīng)Aanyze Network分析各節(jié)點(diǎn)Degree值。節(jié)點(diǎn)越大，Degree值越大，表示該節(jié)點(diǎn)連接其他節(jié)點(diǎn)越多，該節(jié)點(diǎn)則越重要。綠色四邊形節(jié)點(diǎn)表示成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，藍(lán)色圓形表示36個(gè)靶點(diǎn)形成的KEGG通路。靶點(diǎn)PIK3CA顯著，見圖4。

2.3.5 核心靶點(diǎn)的篩選

將36個(gè)交集靶標(biāo)導(dǎo)入Cytoscape3.9.1的String APP插件中，之后通過Largest Subnetwork APP隱藏一些斷開連接的節(jié)點(diǎn)，形成PPI網(wǎng)絡(luò)。并在Cytoscape3.9.1中對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)圖使用Analyze Network工具進(jìn)行拓?fù)浞治?，利用EXCEL獲取拓?fù)鋮?shù)度值、介數(shù)中心性和中心接近度的中位數(shù)分別是15、0.006453821、0.636363636，篩選出大于其中位數(shù)的靶點(diǎn)構(gòu)成Hhb集，得CCND1、ERBB2、IL-1β、IL-2、IL-6、JAK2、MMP2、MMP9、MPO、MTOR、PIK3CA、PPARG、PTGS2、STAT3、TNF、VEGFA。 在Cytohuba插件拓?fù)浞治鲋杏?2種算法，選擇MCC為最優(yōu)算法，篩選出排名前20的靶點(diǎn)構(gòu)成MCC集，得CCND1、ERBB2、HMOX1、IL-1β、IL-2、IL-6、JAK2、MET、MMP1、MMP2、MMP9、MPO、MTOR、NOS2、NTRK1、PPARG、PTGS2、STAT3、TNF、VEGFA同樣利用MCODE插件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類分析，默認(rèn)參數(shù)設(shè)置識(shí)別出2個(gè)蛋白質(zhì)模塊，同一蛋白質(zhì)模塊中的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)相互作用更緊密且功能特征相近，共涉及關(guān)鍵靶點(diǎn)21個(gè)，得IL-1β、IL-2、ERBB2、CCND1、MET、MTOR、MPO、JAK2、VEGFA、PTGS2、TNF、IL-6、MMP2、HMOX1、STAT3、MMP9、PPARG、NOS2、NTRK1、PIK3CA、PTPN11以上3種方法篩選出的核心靶點(diǎn)取交集，篩選出交集靶點(diǎn)共15個(gè)，分別為：CCND1、ERBB2、IL-1β、IL-2、IL-6、JAK2、MMP2、MMP9、MPO、MTOR、PPARG、PTGS2、STAT3、TNF、VEGFA該交集靶點(diǎn)為附子理中方治療潰瘍性結(jié)腸炎的核心靶點(diǎn)。

2.3.6 GO功能富集分析與KEGG通路富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)附子理中方治療潰瘍性結(jié)腸炎的36個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析（P<0.05），共得到270條信號(hào)通路，其中生物過程217條、 細(xì)胞成分19條、分子功能34條（下圖5列出了生物過程前5、細(xì)胞成分前5和分子功能中的前5個(gè)條目），發(fā)現(xiàn)附子理中方治療潰瘍性結(jié)腸炎核心靶點(diǎn)GO功能富集分析主要涉及炎癥反應(yīng)、白細(xì)胞介素-6產(chǎn)生的正調(diào)節(jié)、白細(xì)胞介素-8產(chǎn)生的正調(diào)節(jié)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)的生物過程；細(xì)胞成分主要為：分泌顆粒、細(xì)胞外區(qū)、細(xì)胞外間隙、質(zhì)膜、受體復(fù)合物；分子功能涉及：蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白酪氨酸、酶活性、血紅素結(jié)合、蛋白激酶活性、同一蛋白結(jié)合。對(duì)附子理中方治療潰瘍性結(jié)腸炎的核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析（P<0.05），得到103條信號(hào)通路，其中前20條富集結(jié)果利用微生信在線作圖進(jìn)行可視化。富集基因數(shù)和P值決定節(jié)點(diǎn)的顏色與大小，顏色從紅色到綠色代表P值從小到大，節(jié)點(diǎn)從大到小代表富集基因數(shù)從多到少。篩選出用于研究?jī)?nèi)容相關(guān)的信號(hào)通路，結(jié)果顯示，附子理中方主要通過Pathways in cancer、Proteoglycans in cancer、EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications等多條通路對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎起作用，通路上涉及的靶點(diǎn)越多則代表該通路在附子理中方治療潰瘍性結(jié)腸炎過程中發(fā)揮作用的可能性越大，見圖5～6。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)考察了水、50%甲醇、甲醇3種溶劑對(duì)樣品進(jìn)行溶解，超聲30min和50min，經(jīng)測(cè)定分析，純甲醇溶解超聲50min的樣品中的部分化合物可以得到更高的響應(yīng)，這可能是有些化合物極性較小，在甲醇中能溶解地更充分；為了獲得最佳的洗脫條件，本實(shí)驗(yàn)測(cè)試了各種流動(dòng)相，如不含甲酸、含0.025%、0.05%和0.1%的甲酸水溶液與乙腈搭配，以及0.1%的甲酸水溶液和0.1%甲酸的乙腈溶液，從含有0.1%甲酸的乙腈和0.1%甲酸水溶液的混合物中獲得最佳的峰形和分離度，這是因?yàn)榧尤爰姿峥梢允沟肹M+H]+離子的豐度；此外，對(duì)流動(dòng)相梯度進(jìn)行了研究，最后經(jīng)過條件摸索將梯度運(yùn)行時(shí)間優(yōu)化至18 min。建立的液相色譜－質(zhì)譜檢測(cè)方法方便、快速、穩(wěn)定性好，可為附子理中湯更多化學(xué)成分的含量測(cè)定提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對(duì)中藥復(fù)方的多成分測(cè)定提供參考。

活性物質(zhì)的含量范圍會(huì)對(duì)其臨床效果產(chǎn)生影響，本研究將獲得的6個(gè)差異化合物，即來源于附子的苯甲酰次烏頭原堿和干姜的甘草酸、異甘草素、甘草素、甘草苷、甘草次酸作為主要篩選中的Q-marker，對(duì)今后生產(chǎn)高一致性批次的附子理中湯提供參考。附子理中湯是治療潰瘍性結(jié)腸炎等胃腸道疾病的經(jīng)典方劑[16]，本研究結(jié)果表明，附子理中湯的20個(gè)活性成分與潰瘍性結(jié)腸炎構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，獲得PIK3CA靶點(diǎn)最為顯著顯著；根據(jù)GO功能富集分析與KEGG通路富集分析，影響白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）等炎癥通路的調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)和脂多糖反應(yīng)，與癌癥通路、蛋白聚糖、EGFR酪氨酸激酶、AGE-RAGE信號(hào)等多條信號(hào)通路等緊密相關(guān)。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3KCA）是mTOR通路的正調(diào)節(jié)因子，PI3KCA 通路的激活可能會(huì)通過影響自噬細(xì)胞產(chǎn)生腸道炎癥[19]。IL-1β、IL-6、TNF、IL-2等作為附子理中湯治療潰瘍性結(jié)腸炎的核心靶點(diǎn)，均受到核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）經(jīng)典炎癥通路的調(diào)控[20]，PI3KCA 通路可調(diào)節(jié)IL-6的分泌而減輕炎癥[21]。

據(jù)報(bào)道IL-6是潰瘍性結(jié)腸炎癌變的重要促炎因子[22]，據(jù)報(bào)道潰結(jié)患者的血清和結(jié)腸組織中的IL-6水平均高于正常對(duì)照組[23]；IL-8是一種促使黏膜炎癥的中性粒細(xì)胞[24]，其可作為潰瘍性結(jié)腸炎患者鑒別診斷和疾病活動(dòng)的潛在標(biāo)志物，IL-8水平的高低放映了UC患者的嚴(yán)重程度[25]；IL-6和IL-8都會(huì)影響腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生黏膜炎癥，影響結(jié)腸炎的發(fā)生和發(fā)展[26]。參與AGE-RAGE信號(hào)的激活可以使得PI3K-Akt信號(hào)通路和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路激活而影響炎癥[27]，所以FZLZD可能能通過調(diào)節(jié)AGE-RAGE信號(hào)通路和IL-6、IL-8等炎癥通路而治療UC，為后續(xù)附子理中湯治療潰瘍性結(jié)腸炎的機(jī)制研究提供參考。

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