韓品盛， 楊 龍， 崔 濤， 張雅敏

1 天津醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院， 天津 300070； 2 天津市第一中心醫(yī)院 肝膽外科， 天津 300192； 3 天津藥物研究院 釋藥技術(shù)與藥代動力學(xué)國家重點實驗室， 天津 300000； 4 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥物代謝新技術(shù)創(chuàng)新單元， 北京 100730

膽管細胞癌(cholangiocarcinoma，CCA)是一種侵襲性高、預(yù)后極差的膽道惡性腫瘤，5年存活率<10%[1],可發(fā)生于膽道樹的任何分支，按解剖位置可分為肝內(nèi)膽管細胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，iCCA)、肝門周圍膽管細胞癌(perihilar cholangiocarcinoma,pCCA)或遠端膽管細胞癌(distal cholangiocarcinoma,dCCA)，其中pCCA和dCCA統(tǒng)稱為肝外膽管細胞癌(extrahepatic cholangiocarcinoma,eCCA)。手術(shù)切除是所有亞型CCA的首選治療方案，但其早期診斷困難，周圍組織解剖關(guān)系復(fù)雜，患者往往喪失手術(shù)機會。吉西他濱和順鉑聯(lián)合化療方案常用于不能手術(shù)的CCA患者，然而有報道稱其中位總生存期不足1年[2]。因此，對CCA發(fā)生發(fā)展機制的探索和臨床治療轉(zhuǎn)化具有重要的現(xiàn)實意義。

在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，從外周血遷移到腫瘤組織中的巨噬細胞被稱為腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumor-associated macrophage,TAM) ，在腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成等方面發(fā)揮著重要的作用[3]。TAM一般分為兩種，一種是殺傷腫瘤的M1型巨噬細胞(經(jīng)典活化型巨噬細胞)，可以通過細胞表面抗原識別出不同于正常組織的腫瘤細胞，并產(chǎn)生一氧化氮、活性氧簇等腫瘤殺傷因子殺傷腫瘤細胞，另一種是促進腫瘤進展的M2型巨噬細胞(替代活化型巨噬細胞)，可以分泌白細胞介素(IL)-10、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)等細胞因子，在腫瘤的血管生成及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[4]。M1和M2型巨噬細胞受腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)的影響會不斷發(fā)生動態(tài)轉(zhuǎn)化，這一過程稱為“巨噬細胞極化”。研究[5]表明在大多數(shù)腫瘤中，TAM的特征與M2型巨噬細胞更為相近。

TAM參與了CCA的免疫逃逸、細胞增殖、血管生成、腫瘤轉(zhuǎn)移、免疫耐藥等過程，并且在CCA免疫治療中具有重要意義。因此，本文對TAM促進CCA進展的機制和靶向TAM的免疫治療作一綜述。

1 TAM在CCA腫瘤部位的募集

CCA細胞通過分泌細胞因子，包括單核細胞趨化蛋白(monocyte chemotactic protein，MCP)1、集落刺激因子(colony-stimulating factor，CSF)1和VEGF-A[6]，將外周血中的單核細胞募集到腫瘤組織中，并誘導(dǎo)TAM向M2型巨噬細胞方向極化，大量的M2型TAM在腫瘤周圍聚集，促進腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移。在另一項研究中，Raggi等[7]構(gòu)建了一種CCA干細胞樣微球體模型，該模型通過釋放IL-13、IL-34和骨活素等細胞因子，將血液中的單核細胞募集到腫瘤組織，也可以促進其向M2型TAM方向極化。此外，在缺氧環(huán)境中的腫瘤細胞通過分泌嗜酸性粒細胞趨化因子和抑瘤素M將TAM募集到腫瘤部位并促使其向M2型TAM極化[8]。

腫瘤相關(guān)成纖維細胞(cancer-associated fibroblast，CAF)是TME中的一種重要組成成分，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著必不可少的作用，近年來的研究[9]顯示，CAF也與腫瘤細胞的免疫逃逸密切相關(guān)。CAF通過分泌趨化因子 CXCL12、CSF-1、IL-6和CC類趨化因子配體(C-C motif ligand,CCL)2等細胞因子，促進單核細胞向腫瘤微環(huán)境募集并分化為TAM[10]，介導(dǎo)腫瘤的免疫逃逸。

綜上所述，CCA細胞或TME中的其他細胞可以通過釋放細胞因子的方式，將TAM募集到腫瘤組織中，并將其極化為M2型TAM，之后M2型TAM通過多種方式促進膽管癌的進展。

2 TAM對CCA的作用和影響

2.1 TAM介導(dǎo)CCA的免疫逃逸 近年來，隨著對CCA免疫治療研究的深入，越來越多的研究表明CCA免疫治療的臨床效果較差，這主要是由于TME中免疫抑制相關(guān)細胞的作用，其中M2型TAM對CCA逃避宿主的免疫監(jiān)視起到了重要作用。M2型TAM分泌大量的精氨酸酶1(Arginase 1，Arg1)，Arg1可以耗盡CCA組織中的精氨酸并產(chǎn)生多胺，多胺具有較強的免疫抑制作用，促進CCA的免疫逃逸[11-12]。

此外，TAM分泌的CCL2可以刺激腫瘤浸潤淋巴細胞分化為CD4+/CD25+的調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(Treg)[13]，Treg通過分泌IL-10和TGFβ，抑制細胞毒性 T 淋巴細胞 (CTL)和自然殺傷細胞的活化，介導(dǎo)腫瘤的免疫逃逸，Treg還可結(jié)合IL-2，使其在TME中失活，抑制免疫應(yīng)答反應(yīng)[14]。TAM自身還可以吸引免疫抑制細胞(如Treg)進入CCA組織中，抑制機體免疫應(yīng)答，介導(dǎo)腫瘤的免疫逃逸[15]。

因此，TAM可以通過產(chǎn)生Arg1、CCL2等細胞因子的方式介導(dǎo)CCA的免疫逃逸。

2.2 TAM促進CCA細胞的增殖 Wnt/β-catenin通路是參與腫瘤增殖的重要通路，Wnt激活后與細胞膜上的受體蛋白Frizzled蛋白相結(jié)合，引起細胞質(zhì)中β-catenin蛋白增多，使得細胞質(zhì)中游離的β-catenin蛋白進入細胞核，調(diào)節(jié)基因表達，該通路的過度激活可引起CCA的發(fā)生[16]。Loilome等[17]使用TAM的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)CCA細胞，結(jié)果顯示β-catenin表達水平升高，證實TAM可以激活了Wnt/β-catenin 通路，進而促進CCA細胞增殖。Boulter等[18]發(fā)現(xiàn)Wnt7b和Wnt10a在人CCA組織以及小鼠CCA異種移植模型中高度表達，進一步實驗發(fā)現(xiàn)TAM高表達Wnt7b, 并激活Wnt/β-catenin 通路，促進CCA細胞增殖。

此外，另有研究[19]發(fā)現(xiàn)TAM可以分泌內(nèi)含環(huán)狀RNA的外泌體，與CCA細胞內(nèi)的微小RNA靶點相互作用，促進CCA細胞的增殖和遷移，這也說明TAM分泌的外泌體可能是TAM和CCA細胞之間的信息傳遞媒介。

總之，TAM細胞通過Wnt/β-catenin通路和分泌外泌體的方式促進CCA細胞的增殖。

2.3 TAM促進CCA的血管生成 腫瘤血管生成在CCA的惡性轉(zhuǎn)化過程中起到了關(guān)鍵作用，新生的血管為CCA組織提供營養(yǎng)，并促進CCA的轉(zhuǎn)移。TAM在腫瘤血管周圍部位聚集，TAM的聚集引起血管生成因子相關(guān)基因(表皮調(diào)節(jié)素、VEGFA和CXCL3)的高表達，從而增加CCA新生血管的生成[15,20]。此外，在CCA腫瘤組織中，TAM通過分泌促血管生成因子，如VEGF-A、血管生成素、IL-8和炎癥相關(guān)細胞因子，如環(huán)氧合酶-2和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶，來促進腫瘤新生血管的生成，從而加劇CCA的進展[21]。在CCA中，TAM通過上調(diào)血管生成因子相關(guān)基因和分泌促血管生成因子促進CCA的血管生成。

2.4 TAM促進CCA的轉(zhuǎn)移 上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 (epithelial-mesenchymal transition, EMT)在惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用，可增強腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。Sun等[22]將iCCA與TAM共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其上皮標志物N-鈣黏蛋白和緊密連接蛋白表達減少,而間充質(zhì)標志物E-鈣黏蛋白、α-平滑肌肌動蛋白和波形蛋白增多，說明TAM可以促進iCCA細胞的EMT，進一步研究發(fā)現(xiàn)TAM通過激活A(yù)KT3/PRAS40信號通路促進iCCA細胞的EMT，增強iCCA的轉(zhuǎn)移。Techasen等[23]證明TAM通過分泌IL-4、IL-6、IL-10、TNFα和TGFβ1，使上皮標志物E-鈣黏蛋白和細胞角蛋白19表達減少，而間充質(zhì)標志物鈣結(jié)合蛋白S100A9和MMP9表達增多，從而促進CCA的EMT。因此，TAM通過AKT3/PRAS40信號通路和分泌細胞因子的方式使上皮標志物的表達減少，間充質(zhì)標志物的表達增多，促進了CCA的EMT。

2.5 TAM促進CCA的免疫耐藥 吉西他濱是治療CCA的關(guān)鍵藥物，對于局部晚期或轉(zhuǎn)移性CCA，順鉑加吉西他濱是最有效的化療方案[2]。在eCCA中，選取26例腫瘤復(fù)發(fā)患者接受以吉西他濱為基礎(chǔ)的化療，結(jié)果證明TAM、TAN和Treg免疫細胞高表達的患者疾病進展率高于TAM、TAN和Treg低表達組 ，說明TAM等免疫細胞的浸潤與患者的不良預(yù)后以及吉西他濱耐藥有關(guān)[24]。

圖1 TAM對CCA的作用

3 TAM在CCA免疫治療中的作用

有報道[25]稱CSF-1的過度表達與腫瘤組織中TAM的募集和極化密切相關(guān)。集落刺激因子-1受體(CSF-1R) 是表達于巨噬細胞表面的受體酪氨酸激酶，其配體CSF-1與之結(jié)合后可以促進巨噬細胞的增殖、分化和趨化活性增加[26]。在腫瘤的臨床前模型中，大量研究[27-28]表明CSF-1R抑制劑可以減少腫瘤組織中TAM的數(shù)量，延緩腫瘤進展，延長實驗動物生存時間。在小鼠CCA異種移植模型中，CSF-1R抑制劑可以抑制小鼠模型中TAM的募集和極化，使用CSF-1R抑制劑后小鼠移植瘤中CD68+巨噬細胞的數(shù)量明顯減少，小鼠移植瘤體積和質(zhì)量也均有減小，說明CCA的CSF-1R靶向治療效果顯著[18]。

MCP-1又被稱為CCL2,也是一種很強的TAM趨化激活劑，盡管 MCP-1 的產(chǎn)生曾經(jīng)被認為是宿主抵御腫瘤的一種表現(xiàn)，但現(xiàn)在認為它可以將TAM募集到腫瘤組織中，從而促進腫瘤的進展[29]。TWAKE與其受體Fn14結(jié)合后可激活NF-κB通路分泌MCP-1、IL-6、IL-8、CSF-1和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子，增加TAM在CCA組織中的募集。進一步實驗阻斷了TWAKE/Fn14通路， MCP-1表達減少，使TAM在CCA組織中的募集減少。此外，向小鼠CCA異種移植模型中多次注射抗MCP-1抗體，小鼠CCA異種移植模型中的移植瘤明顯減小且TAM的數(shù)量與對照組相比減少了56.5%，說明CCA的MCP-1靶向治療效果較好[30]。

CD47是一種表達在正常細胞表面的抗吞噬蛋白，屬于免疫球蛋白超家族，通過和巨噬細胞表面的信號調(diào)節(jié)蛋白α(signal regulatory protein α，SIRPα)結(jié)合來抑制巨噬細胞的吞噬作用，從而保護正常細胞不被清除。當(dāng)細胞老化或病變時，細胞表面就會逐漸喪失CD47，以幫助巨噬細胞識別并吞噬這些細胞[31]。有報道稱CCA細胞比HCC細胞有著更高的CD47表達，從而通過與巨噬細胞SIRPα結(jié)合來“欺騙”巨噬細胞，使巨噬細胞不將其吞噬。抗CD47抗體可以阻斷CD47-SIRPA的相互作用導(dǎo)致巨噬細胞吞噬功能增強，從而減輕了小鼠CCA異種移植模型中的腫瘤負荷[32]。

細胞程序性死亡受體(programmed cell death-1，PD-1)和細胞程序性死亡-配體1(programmed cell death ligand 1，PD-L1)的表達是導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸的重要機制[33]，CCA細胞上的 PD-L1 和T淋巴細胞上的 PD-1 結(jié)合后可以抑制CTL的正常免疫活性，減弱機體的免疫應(yīng)答反應(yīng)。此外，CCA中的TAM也可以表達PD-L1，介導(dǎo)CCA的免疫逃逸[34]。免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint blockade，ICB)采用抗原抗體相結(jié)合的方式阻斷PD-1和 PD-L1的結(jié)合，用于CCA的免疫治療，但由于CCA腫瘤免疫微環(huán)境中的免疫抑制細胞TAM和骨髓來源的抑制性細胞抑制了CTL的活性，介導(dǎo)了CAA的免疫逃逸，導(dǎo)致ICB單藥治療效果較差，但Loeuillard等[34]發(fā)現(xiàn)將ICB與TAM阻斷劑和骨髓來源的抑制性細胞阻斷劑聯(lián)合應(yīng)用，治療CCA效果明顯提高。

4 小結(jié)

總之，TAM在CCA的免疫逃逸、細胞增殖、血管生成、腫瘤轉(zhuǎn)移、免疫耐藥等方面起到重要作用，并作為一種免疫治療的新型靶點在CCA的臨床治療研究中具有廣闊的應(yīng)用前景，但是TAM靶向治療的安全性還有待進一步驗證。雖然CCA惡性程度高，起病隱匿，但隨著近年來研究人員對TME的深入研究，發(fā)現(xiàn)了許多例如TAM的特異性靶點，相信隨著各種靶向藥物的問世，CCA的精準治療時代即將到來。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：韓品盛負責(zé)文獻查閱，論文撰寫；楊龍、崔濤負責(zé)論文修改，研究指導(dǎo)；張雅敏負責(zé)研究指導(dǎo)，經(jīng)費支持。