胡海峰, 張弦, 王水俐

尿毒癥是腎功能喪失后, 機(jī)體內(nèi)部產(chǎn)生的一系列臨床綜合征[1］。血液透析是治療慢性腎衰竭、尿毒癥的常用手段, 然而長(zhǎng)期血液透析會(huì)導(dǎo)致病人出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化等各種并發(fā)癥[2-3］。因此, 如何有效預(yù)防尿毒癥血液透析病人并發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化是臨床醫(yī)師關(guān)注的重難點(diǎn)。高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein box-1, HMGB1）是一種具有免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子[4］。中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps, NETs）是中性粒細(xì)胞活化過(guò)程中釋放的一種胞外網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[5］。目前關(guān)于HMGB1、NETs與尿毒癥血液透析病人并發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系有待進(jìn)一步探究。因此, 本研究通過(guò)探討HMGB1、NETs與225例尿毒癥血液透析病人并發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)性, 以期為臨床防治動(dòng)脈粥樣硬化提供一定的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2019年1月至2020年1月上海楊思醫(yī)院收治的225例尿毒癥血液透析病人為研究對(duì)象。根據(jù)是否并發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化將病人分為非動(dòng)脈粥樣硬化組119例、動(dòng)脈粥樣硬化組106例。其中非動(dòng)脈粥樣硬化組年齡（47.14±13.07）歲, 透析時(shí)間（52.94±12.83）月；動(dòng)脈粥樣硬化組年齡（67.24±13.64）歲, 透析時(shí)間（54.36±13.24）月。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①病人依據(jù)《慢性腎臟病及透析的臨床實(shí)踐指南》[6］診斷為慢性腎衰竭, 且血肌酐水平超過(guò)707 μmol/L, 符合尿毒癥臨床診斷標(biāo)準(zhǔn), 血液透析≥6個(gè)月者, 動(dòng)脈粥樣硬化病人經(jīng)血液檢查、超聲檢查、X線等一系列檢查確診；②病人臨床資料及影像學(xué)資料齊全, 研究經(jīng)上海楊思醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)（批號(hào)190002）, 病人均知情且同意參加；③入組前2周內(nèi)未使用免疫抑制劑、抗炎、維生素、干擾素、血液制品等藥物治療者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往有先天性心血管疾病者；②有惡性腫瘤、自身免疫性疾病及肝臟疾病者；③妊娠或哺乳期婦女；④存在精神障礙疾病者。

1.2 主要試劑與儀器HMGB1 ELISA試劑盒（貨號(hào)CK-E11683）購(gòu)自武漢益普生物科技有限公司。全自動(dòng)生化分析儀（型號(hào)Cobas 6000）購(gòu)自瑞士羅氏公司；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（型號(hào)Multiskan GO）購(gòu)自北京賽百奧科技有限公司；熒光酶標(biāo)儀（型號(hào)SpectraMax Gemini XPS）購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司；彩色多普勒超聲診斷儀（型號(hào)Technos MPX DU6）購(gòu)自意大利百勝公司。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品采集及保存 采集尿毒癥血液透析病人透析6個(gè)月后清晨空腹靜脈血, 3 000 r/min離心15 min后收集血清, 置于-80 ℃保存待測(cè)。

1.3.2 一般資料收集 查閱門(mén)診及住院病歷, 收集病人一般資料, 主要包括年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、透析時(shí)間、收縮壓、舒張壓及吸煙、高血壓、糖尿病。

1.3.3 血清HMGB1水平及生化指標(biāo)水平測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）檢測(cè)血清HMGB1水平, 采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)鈣、磷、三酰甘油、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平, 操作嚴(yán)格按照試劑盒及儀器說(shuō)明書(shū)進(jìn)行, 并計(jì)算鈣磷乘積。

1.3.4 血清NETs水平測(cè)定 采用熒光染色法檢測(cè)血清NETs水平。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的熒光值作直線回歸方程制備標(biāo)準(zhǔn)曲線；血清中加入PicoGreen染料后避光孵育10～20 min, 采用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)樣品熒光值；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品NETs水平。

1.3.5 內(nèi)膜中層厚度（intima-media thickness, IMT）檢測(cè) 采用彩色多普勒超聲診斷儀檢測(cè)病人IMT值, 探頭10 MHz。受檢者取仰臥位, 從頸根部向上連續(xù)觀察雙側(cè)頸總動(dòng)脈, 測(cè)量長(zhǎng)軸后壁內(nèi)膜到中膜之間的垂直距離, 即為頸總動(dòng)脈IMT, 測(cè)量3次取平均值為IMT值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用SPSS 23.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料經(jīng)檢驗(yàn)符合正態(tài)分布, 以±s表示, 兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例（%）表示, 組間比較行χ2檢驗(yàn)；采用Pearson法分析尿毒癥血液透析合并動(dòng)脈粥樣硬化病人血清HMGB1、NETs與IMT及生化指標(biāo)的相關(guān)性；采用多因素logistic回歸分析影響尿毒癥血液透析病人動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的因素, 采用向前法篩選自變量, 入選α=0.05, 剔除α=0.10。P＜0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 非動(dòng)脈粥樣硬化組、動(dòng)脈粥樣硬化組一般資料比較非動(dòng)脈粥樣硬化組、動(dòng)脈粥樣硬化組性別、BMI、透析時(shí)間、收縮壓、舒張壓及吸煙、高血壓、糖尿病病人比例比較, 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；動(dòng)脈粥樣硬化組年齡高于非動(dòng)脈粥樣硬化組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組尿毒癥血液透析病人一般資料比較

2.2 非動(dòng)脈粥樣硬化組、動(dòng)脈粥樣硬化組生化指標(biāo)水平比較非動(dòng)脈粥樣硬化組、動(dòng)脈粥樣硬化組鈣、磷、鈣磷乘積比較, 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；動(dòng)脈粥樣硬化組三酰甘油、總膽固醇、LDL-C水平高于非動(dòng)脈粥樣硬化組, HDL-C水平低于非動(dòng)脈粥樣硬化組, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 兩組尿毒癥血液透析病人血液生化指標(biāo)水平比較/±s

表2 兩組尿毒癥血液透析病人血液生化指標(biāo)水平比較/±s

注：LDL-C為低密度脂蛋白膽固醇, HDL-C為高密度脂蛋白膽固醇。

組別非動(dòng)脈粥樣硬化組動(dòng)脈粥樣硬化組t值P值例數(shù)119 106鈣/（mol/L）2.06±0.32 2.05±0.31 0.24 0.813磷/（mol/L）1.42±0.58 1.35±0.54 0.93 0.352鈣磷乘積34.86±13.92 33.42±13.75 0.78 0.437三酰甘油/（mmol/L）2.02±0.42 2.53±0.51 8.22＜0.001總膽固醇/（mmol/L）4.20±1.16 5.48±1.21 8.10＜0.001 LDL-C/（mmol/L）2.42±0.61 3.20±0.64 9.36＜0.001 HDL-C/（mmol/L）1.24±0.11 1.10±0.12 9.13＜0.001

2.3 非動(dòng)脈粥樣硬化組、動(dòng)脈粥樣硬化組血清HMGB1、NETs水平及IMT比較動(dòng)脈粥樣硬化組血清HMGB1、NETs水平及IMT高于非動(dòng)脈粥樣硬化組（P＜0.05）, 詳情見(jiàn)表3。

表3 兩組尿毒癥血液透析病人血清HMGB1、NETs水平及IMT比較/±s

表3 兩組尿毒癥血液透析病人血清HMGB1、NETs水平及IMT比較/±s

注：HMGB1為高遷移率族蛋白B1, NETs為中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng), IMT為內(nèi)膜中層厚度。

組別非動(dòng)脈粥樣硬化組動(dòng)脈粥樣硬化組t值P值例數(shù)119 106 HMGB1/（μg/L）6.21±1.16 8.94±2.33 11.31＜0.001 NETs/（μg/L）194.58±20.23 416.82±45.61 48.12＜0.001 IMT/mm 0.89±0.19 1.10±0.24 7.31＜0.001

2.4 尿毒癥血液透析合并動(dòng)脈粥樣硬化病人血清HMGB1、NETs與IMT及生化指標(biāo)的相關(guān)性Pearson法分析結(jié)果顯示, 尿毒癥血液透析合并動(dòng)脈粥樣硬化病人血清HMGB1與NETs 呈正相關(guān)（r=0.54,P＜0.001）。此外, 尿毒癥血液透析合并動(dòng)脈粥樣硬化病人血清HMGB1、NETs與IMT、三酰甘油、總膽固醇、LDL-C呈正相關(guān), 與HDL-C呈負(fù)相關(guān)（P＜0.001）, 見(jiàn)表4。

表4 尿毒癥血液透析合并動(dòng)脈粥樣硬化106例血清HMGB1、NETs與生化指標(biāo)的Pearson相關(guān)性分析

2.5 影響尿毒癥血液透析病人并發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的多因素logistic回歸分析將尿毒癥血液透析病人是否發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化作為因變量, 矯正IMT、三酰甘油、總膽固醇、LDL-C、HDL-C、年齡等混雜因素后, 以HMGB1、NETs為自變量（按兩組總均值轉(zhuǎn)化成兩分類(lèi)變量）進(jìn)行多因素logistic回歸分析（逐步向前法）, 結(jié)果顯示HMGB1、NETs均是影響尿毒癥血液透析病人并發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見(jiàn)表5。

表5 影響尿毒癥血液透析病人225例動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的多因素logistic回歸分析

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是血液透析病人常見(jiàn)并發(fā)癥, 病人確診已較為嚴(yán)重[7-8］。研究表明, 頸動(dòng)脈粥樣硬化與腦動(dòng)脈、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化均有密切關(guān)系, 可預(yù)測(cè)心腦血管疾病發(fā)生的危險(xiǎn)性及嚴(yán)重程度, 頸動(dòng)脈粥樣硬化同時(shí)也是尿毒癥病人致殘、致死主要原因之一[9-10］。動(dòng)脈粥樣硬化可能與高同型半胱氨酸血癥、脂代謝異常、慢性炎癥等有關(guān)[11-12］。臨床早期診斷、早期預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化, 對(duì)降低尿毒癥血液透析病人心血管事件發(fā)生率可能有重要意義。

NETs主要有促凝、抗炎、促炎等生物學(xué)作用, 其自身獨(dú)特的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)既可以發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)的作用, 同時(shí)也具有促炎的效果[13-14］。研究表明, NETs中自體DNA復(fù)合物及中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的抗菌肽等顆粒蛋白能刺激血管壁中血漿樹(shù)突細(xì)胞活化, 自體免疫被激活, 進(jìn)而導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的形成[15］。本研究結(jié)果顯示, 尿毒癥血液透析并發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化病人血清NETs呈高表達(dá), 與劉娜娜、姜文[16］研究基本一致。提示NETs的高表達(dá)可能與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)?；诩韧芯考癗ETs的作用機(jī)制推測(cè)其可能機(jī)制是NETs被激活后, 產(chǎn)生的游離DNA形成復(fù)合物, 進(jìn)一步刺激血管壁中血漿樹(shù)突細(xì)胞活化, 自體免疫及內(nèi)皮細(xì)胞損傷等協(xié)同作用, 進(jìn)而導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化形成。HMGB1是普遍存在于真核生物細(xì)胞核內(nèi)的染色體結(jié)合蛋白, 其在病理狀態(tài)下可從活化細(xì)胞或受損細(xì)胞核內(nèi)被釋放到胞外[17］。Ding等[18］研究表明, HMGB1通過(guò)與炎性因子相互作用, 共同促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的病理過(guò)程。本研究結(jié)果中HMGB1在尿毒癥血液透析并發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化病人血清中高表達(dá), 且與NETs呈正相關(guān), 二者均是影響尿毒癥血液透析病人并發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的因素。Wang等[19］研究結(jié)果中NETs可通過(guò)調(diào)控HMGB1相關(guān)通路觸發(fā)中性粒細(xì)胞募集。Zha等[20］研究結(jié)果中NETs可通過(guò)調(diào)控HMGB1相關(guān)通路參與腫瘤微環(huán)境及膠質(zhì)瘤的進(jìn)展。基于既往研究結(jié)果, 推測(cè)本研究中NETs除了直接激活自體免疫介導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生外, 還可能通過(guò)調(diào)控HMGB1的表達(dá), 激活HMGB1相關(guān)通路, 介導(dǎo)炎癥反應(yīng), 進(jìn)而參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。但其具體生物機(jī)制需進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞或動(dòng)物試驗(yàn)驗(yàn)證。此外, 本研究中血清HMGB1、NETs與IMT及三酰甘油、總膽固醇、LDL-C、HDL-C等血脂指標(biāo)均呈明顯的相關(guān)性。高俊杰[21］研究表明, 血脂異常、血管IMT增厚是早期動(dòng)脈粥樣硬化的表現(xiàn)。因此, 本研究進(jìn)一步推測(cè)血清HMGB1、NETs在尿毒癥血液透析病人動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生中發(fā)揮重要作用, 二者水平變化對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生有重要提示作用, 警示臨床應(yīng)及早介入治療, 減少動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。

綜上所述, HMGB1、NETs在尿毒癥血液透析并發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化病人血清中表達(dá)水平升高, 且與IMT、血脂指標(biāo)呈明顯相關(guān)性。提示HMGB1、NETs可能與尿毒癥血液透析病人動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān), 需引起臨床醫(yī)師的重視。目前臨床中僅顯示HMGB1、NETs可能參與動(dòng)脈粥樣硬化疾病的發(fā)展, 而本研究進(jìn)一步明確了二者在尿毒癥血液透析病人中的表達(dá)情況及其與透析病人動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的關(guān)系, 為臨床預(yù)防血液透析病人動(dòng)脈粥樣硬化疾病的發(fā)生提供新思路。但因本研究收集病人數(shù)量有限, 病人間可能存在個(gè)體性差異, HMGB1、NETs在臨床指導(dǎo)治療中的具體作用仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。且HMGB1、NETs影響尿毒癥血液透析病人并發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)理尚需進(jìn)一步探究。