喬超鋒, 靳磊, 寧濤, 劉禹辰, 杜信岡

2018年全球結(jié)直腸癌新發(fā)病例約180萬例, 在全球惡性腫瘤中位居第3位, 死亡病例約88.1萬例, 位居第2位[1］。2015年我國(guó)結(jié)直腸癌統(tǒng)計(jì)分析顯示, 在全國(guó)惡性腫瘤中發(fā)病率和病死率分別位居第3位和第5位[2］。結(jié)直腸癌大多遵循“腺瘤-癌”的序列, 發(fā)展過程約5～10年, 因此及早發(fā)現(xiàn)癌前病變并行有效的干預(yù)措施可在一定程度上阻止結(jié)直腸癌的發(fā)生。研究顯示結(jié)直腸癌篩查、早診斷和早治療可有效降低結(jié)直腸癌的病死率[3-5］。結(jié)腸鏡是臨床上常用于結(jié)結(jié)直腸癌查的方法, 但具有侵入性。在腫瘤發(fā)展的過程中, 許多與腫瘤相關(guān)的分子進(jìn)入血液, 血液標(biāo)志物的檢測(cè)方便快捷, 可提高人群的篩查率。目前已應(yīng)用于癌癥的常規(guī)檢測(cè)的腫瘤標(biāo)志物包括癌胚抗原和糖類抗原199（carbohydrate antigen 199, CA199）, 但特異性較低, 多個(gè)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)是提高診斷率的方法之一[6］。血清絲氨酸肽酶抑制劑Kazal 4型（serine protease inhibitor Kazal-type 4, SPINK4）, 也稱為PEC60或HEL136, 最初是從豬腸道中分離出來的, 在豬十二指腸中表達(dá)水平較高, 并且在大多數(shù)上皮杯狀細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中高表達(dá)[7］。Chen等[8］研究顯示, 結(jié)直腸癌組織中SPINK4的高表達(dá)與晚期病人的臨床病理特征相關(guān), 對(duì)預(yù)后不良具有一定預(yù)測(cè)價(jià)值。而結(jié)直腸癌病人血清中SPINK4的表達(dá)情況仍不清楚, 因此本研究通過收集結(jié)直腸癌病人和健康受試者, 檢測(cè)結(jié)直腸癌病人外周血中SPINK4的表達(dá)情況, 進(jìn)一步聯(lián)合腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原和CA199, 分析診斷結(jié)直腸癌的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2020年1月至2021年7月在焦作市第二人民醫(yī)院就診的結(jié)直腸癌病人85例, 男性51例, 女性34例, 年齡（53.6±6.2）歲, 范圍為42～68歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)后病理確診為結(jié)直腸癌；②首次確診；③未接受任何放化療治療；④年齡18～80歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他系統(tǒng)腫瘤；②合并肝腎功能障礙；③已發(fā)生血型轉(zhuǎn)移, 存在肝臟、肺上、骨、乳腺或腦轉(zhuǎn)移的病人；④資料不全。選擇同時(shí)期來該院體檢的健康志愿者45例, 男性32例, 女性13例, 年齡（54.9±5.3）歲, 范圍為45～67歲。兩組病人性別、年齡等一般資料比較均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.57,P=0.210；t=2.03,P=0.085）。研究對(duì)象或其近親屬知情同意, 本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 方法

1.2.1 ELISA檢測(cè)外周血中SPINK4、癌胚抗原和CA199的水平檢測(cè) 收集病人清晨空腹外周血5 mL, 以3 000 r/min的速度離心10 min, 收集上清, 放置-20 ℃冰箱中待用。按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)步驟檢測(cè)SPINK4、癌胚抗原和CA199的水平。SPINK4、癌胚抗原和CA199 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海撫生生物有限公司。

1.2.2 觀察指標(biāo) 比較結(jié)直腸癌組和健康對(duì)照組外周血中 SPINK4、癌胚抗原和CA199的表達(dá)水平, 分析結(jié)直腸癌病人中SPINK4、癌胚抗原和CA199的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系, 臨床病理特征包括年齡、性別、腫瘤長(zhǎng)徑、腫瘤位置、分化程度、TNM分期、脈管浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和神經(jīng)浸潤(rùn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS21.0軟件。符合正態(tài)分布計(jì)量資料以±s表示, 組間比較采用成組t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（%）表示, 組間比較采用χ2檢驗(yàn), 多組間兩兩比較調(diào)整檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α'；受試者操作特征曲線（ROC曲線）評(píng)估SPINK4、癌胚抗原和CA199單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)診斷結(jié)直腸癌的臨床價(jià)值, 組間AUC比較采用Z檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組病人外周血中SPINK4、癌胚抗原和CA199的水平結(jié)直腸癌組外周血中SPINK4、癌胚抗原和CA199的水平高于健康對(duì)照組（P＜0.05）, 見表1。另檢測(cè)到結(jié)直腸癌術(shù)后外周血中SPINK4的水平為10.25±1.84, 與術(shù)前相比顯著降低（t=3.85,P=0.010）。

表1 兩組外周血中SPINK4、癌胚抗原和CA199的水平/±s

表1 兩組外周血中SPINK4、癌胚抗原和CA199的水平/±s

注：SPINK4為血清絲氨酸肽酶抑制劑Kazal 4型, CA199為糖類抗原199。

組別健康對(duì)照組結(jié)直腸癌組t值P值例數(shù)45 85 SPINK4/（μg/L）2.85±0.54 15.84±2.10 8.20＜0.001癌胚抗原/（μg/L）1.02±0.08 24.62±4.81 12.52＜0.001 CA199/（U/mL）18.36±4.08 58.10±6.62 16.25＜0.001

2.2 ROC曲線分析SPINK4、癌胚抗原和CA199單獨(dú)診斷結(jié)直腸癌的截?cái)嘀到?jīng)ROC曲線分析顯示SPINK4、癌胚抗原和CA199單獨(dú)診斷結(jié)直腸癌的截?cái)嘀捣謩e為9.21 μg/L、16.35 μg/L和42.71 U/L, 見圖1。根據(jù)截?cái)嘀祵⒔Y(jié)直腸癌病人分為SPINK4高水平組、SPINK4低水平組, 癌胚抗原高水平組、癌胚抗原低水平組, CA199高水平組、CA199低水平組。

圖1 ROC曲線分析血清絲氨酸肽酶抑制劑Kazal 4型（SPINK4）、癌胚抗原和糖類抗原199（CA199）單獨(dú)診斷結(jié)直腸癌的截?cái)嘀担篈為SPINK4；B為癌胚抗原；C為CA199

2.3 SPINK4、癌胚抗原和CA199與結(jié)直腸癌臨床病理特征的相關(guān)性分析SPINK4低水平組與高水平組間年齡、腫瘤長(zhǎng)徑、分化程度、TNM分期、脈管浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。癌胚抗原低水平與高水平組間分化程度和TNM分期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CA199低水平組與高水平組間分化程度、TNM分期、脈管浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 SPINK4、癌胚抗原和CA199與結(jié)直腸癌臨床病理特征的相關(guān)性分析/例（%）

2.4 SPINK4、癌胚抗原和CA199單獨(dú)及聯(lián)合診斷結(jié)直腸癌的臨床價(jià)值SPINK4、癌胚抗原和CA199單獨(dú)診斷結(jié)直腸癌的AUC相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=2.15,P=0.102）, SPINK4+癌胚抗原+CA199診斷結(jié)直腸癌的AUC高于SPINK4、癌胚抗原和CA199組（Z=4.20、4.50、6.30,P=0.014、0.010、0.006）, 見表3。

表3 SPINK4、癌胚抗原和CA199單獨(dú)及聯(lián)合診斷結(jié)直腸癌的臨床價(jià)值

2.5 SPINK4、癌胚抗原和CA199單獨(dú)及聯(lián)合診斷結(jié)直腸癌的陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和準(zhǔn)確度的比較SPINK4+癌胚抗原+CA199組診斷結(jié)直腸癌的準(zhǔn)確度和陽性預(yù)測(cè)值高于SPINK4組、癌胚抗原組和CA199組, 陰性預(yù)測(cè)值高于癌胚抗原組（P＜0.008）, 見表4。

表4 SPINK4、癌胚抗原和CA199單獨(dú)及聯(lián)合診斷結(jié)直腸癌的陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和準(zhǔn)確度的比較/%（n/N）

3 討論

結(jié)直腸癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因, 在全球癌癥相關(guān)死亡中排名第四[9］。結(jié)直腸癌通常始于非癌性腺瘤, 經(jīng)過致癌過程的激活和惡變, 最終發(fā)展成為腫瘤, 此過程取決于飲食、環(huán)境、遺傳變異和其他有害因素的影響[10］。據(jù)估計(jì)50%～70%的結(jié)直腸癌病人診斷時(shí)已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移, 嚴(yán)重影響病人的總生存期[11］。因此, 識(shí)別特定的生物標(biāo)志物對(duì)于更好地了解結(jié)直腸癌的發(fā)生和預(yù)后勢(shì)在必行。癌胚抗原是診斷結(jié)直腸癌中最常用的血液生物標(biāo)志物, 然而敏感性和特異性較低[12］。血清癌胚抗原水平增加并不是結(jié)直腸癌的特定指標(biāo), 其他疾病如胰腺癌, 也可能伴有血清癌胚抗原水平的增加[13］。血清CA199水平升高, 往往預(yù)示著疾病由良性發(fā)展為惡性, 現(xiàn)常用于胰腺癌和結(jié)直腸癌的治療監(jiān)測(cè), 亦缺乏診斷結(jié)直腸癌的特異性[14］。

SPINK基因位于染色體9p13.3上, 為影響乳糜瀉功能的候選基因。在荷蘭的一項(xiàng)研究中顯示, SPINK4在乳糜瀉病人中表達(dá)增加, 且在未經(jīng)治療的病人中檢測(cè)到差異基因的表達(dá)[15］。在之前的報(bào)告中發(fā)現(xiàn)活動(dòng)性乳糜瀉的腸上皮細(xì)胞中SPINK4顯著上調(diào), 有可能是通過干擾素γ進(jìn)行調(diào)節(jié)的[16］。SPINK4與炎癥性腸病具有一定相關(guān)性, Brenna等[17］研究發(fā)現(xiàn)與正常大鼠相比, 炎癥性腸病大鼠模型結(jié)腸黏膜中的SPINK4的表達(dá)顯著增強(qiáng)。此外, SPINK4還被確定為潰瘍性結(jié)腸炎和巴雷特食管的風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)[18-19］。以上研究均表明SPINK4與胃腸道疾病密切相關(guān), 但其在結(jié)直腸癌中的作用目前研究還較為少見。

在本研究中, 首先檢測(cè)到結(jié)直腸癌病人外周血中SPINK4的水平高于健康對(duì)照組, 且結(jié)直腸癌術(shù)后病人外周血中SPINK4的水平顯著降低, 提示SPINK4在結(jié)直腸癌中具有一定的特異性。進(jìn)一步分析與臨床病理資料的關(guān)系顯示, SPINK4高水平組病人的年齡較大、腫瘤長(zhǎng)徑大、分化程度低、TNM分期高、脈管浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病人比例高, 提示外周血中SPINK4的表達(dá)水平增加可能促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生及進(jìn)展。Chen等[8］研究顯示, 在結(jié)直腸癌組織中SPINK4的表達(dá)水平增加, 與晚期病人的臨床病理特征和較差的治療反應(yīng)相關(guān), 進(jìn)一步證實(shí)SPINK4水平增加參與結(jié)直腸癌的進(jìn)展。在SPINK4聯(lián)合癌胚抗原和CA199診斷結(jié)直腸癌時(shí)的曲線下面積明顯增加, 且準(zhǔn)確度和陽性預(yù)測(cè)值高于三個(gè)指標(biāo)的單獨(dú)檢測(cè), 提示SPINK4、癌胚抗原和CA199聯(lián)合診斷結(jié)直腸癌具有較高的臨床價(jià)值。

本研究雖然表明血清SPINK4水平升高與結(jié)直腸癌有密切關(guān)系, 聯(lián)合癌胚抗原和CA199對(duì)結(jié)直腸癌具有較高的診斷價(jià)值, 但仍具有一定的局限性。首先, 本研究的樣本量較小, 未分析SPINK4與包括吸煙、大量飲酒和生活方式在內(nèi)的對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)病有影響的因素, 這可能對(duì)結(jié)果的可靠性有影響。本研究主要檢測(cè)結(jié)直腸癌外周血中SPINK4的水平, 未對(duì)結(jié)直腸癌組織中SPINK4的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè), 因此SPINK4在結(jié)直腸癌診斷中的臨床價(jià)值仍須進(jìn)一步研究。

綜上所述, SPINK4在結(jié)直腸癌外周血中的表達(dá)水平增加, 與結(jié)直腸癌的不良臨床病理特征相關(guān), 聯(lián)合癌胚抗原和CA199可提高診斷結(jié)直腸癌的臨床價(jià)值。