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        叉頭框蛋白C2、淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體-1的表達(dá)與皮膚鱗狀細(xì)胞癌生物學(xué)特性的相關(guān)性

        2023-03-14 00:49:40孫秋悅曹宸楊細(xì)虎嚴(yán)志新
        安徽醫(yī)藥 2023年3期
        關(guān)鍵詞:淋巴管組織化學(xué)內(nèi)皮細(xì)胞

        孫秋悅, 曹宸, 楊細(xì)虎, 嚴(yán)志新

        皮膚鱗狀細(xì)胞癌(CSCC)是起源于表皮或附屬器角質(zhì)形成細(xì)胞的一類惡性腫瘤, CSCC的發(fā)病率在皮膚非黑色素惡性腫瘤中僅次于基底細(xì)胞癌, 約占所有皮膚癌的20%, 也是非黑色素皮膚腫瘤致死的首要原因[1-4]?,F(xiàn)據(jù)統(tǒng)計(jì), 有5%的CSCC可發(fā)生轉(zhuǎn)移[5]。CSCC在發(fā)生、發(fā)展的過程中涉及眾多的基因。叉頭框蛋白C2(FoxC2)是淋巴管發(fā)育的重要蛋白, 在許多惡性腫瘤中均有表達(dá), 但在CSCC中鮮有研究。淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體-1(LYVE-1)是淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物, 有研究發(fā)現(xiàn)LYVE-1的表達(dá)與口腔鱗狀細(xì)胞癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6-8]。但在CSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的作用還沒有相關(guān)報(bào)道, 因此本實(shí)驗(yàn)探討了FoxC2、LYVE-1在CSCC發(fā)生、發(fā)展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中可能的作用。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)S-P法, 應(yīng)用抗FoxC2單抗對(duì)人CSCC中FoxC2抗原進(jìn)行標(biāo)記;應(yīng)用抗LYVE-1單抗對(duì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記, LYVE-1表達(dá)水平用微淋巴管密度(MLVD)表示。半定量分析FoxC2表達(dá)情況, 定量分析腫瘤內(nèi)MLVD, 探討二者與CSCC生物學(xué)特性的關(guān)系。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料選擇2013年10月至2021年1月在江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院收治的44例原發(fā)性CSCC病人。篩選條件:①病人行原發(fā)性CSCC腫塊切除手術(shù), ②腫瘤原發(fā)灶蠟塊保存完整, ③臨床病理及病例資料完整。44例病人年齡范圍為37~97歲。選取2例正常皮膚組織作為對(duì)照。本研究病人及近親屬對(duì)研究方案簽署知情同意書, 符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

        1.2 免疫組織化學(xué)試劑兔抗人FoxC2單抗(即用型)、兔抗人LYVE-1單抗(即用型)均來自Abcam;羊抗鼠/兔IgG聚合物(即用型)來自合肥泉暉醫(yī)療器械有限公司, 貨號(hào)RQT100;DAB顯色液由該院病理科提供。

        1.3 染色方法采用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)全部標(biāo)本中FoxC2、LYVE-1水平, 操作如下:組織切片常規(guī)脫蠟至水, 在4%福爾馬林溶液室溫條件下固定24 h, 采用高溫高壓組織抗原修復(fù), 抗原修復(fù)液采用濃度0.1 mol/L的乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)(pH 8.0), 修復(fù)條件為溫度121 ℃、修復(fù)時(shí)間為噴氣計(jì)時(shí)2.5 min, 滅活劑采用3%過氧化氫一抗稀釋液采用磷酸緩沖鹽溶液, FoxC2與LYVE-1的稀釋比例分別為1∶200、1∶10 000, 孵育溫度4 ℃, 過夜。二抗羊抗鼠/兔IgG聚合物(即用型), 在室溫下孵育20 min, 顯色液采用DAB, 顯色時(shí)間5 min。蘇木精復(fù)染30 s, 脫水, 中性樹脂封片。

        1.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定觀察FoxC2、LYVE-1在CSCC組織中的表達(dá)情況及與病理參數(shù)(年齡、性別、腫瘤長(zhǎng)徑、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)的關(guān)系。LYVE-1采用MLVD表示, MLVD計(jì)數(shù)方式為[9]:一個(gè)淋巴管為棕黃色染色的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞簇, 先在低倍鏡(40倍鏡)下觀察, 再選擇高密度區(qū)在高倍鏡下(200倍鏡)隨機(jī)選擇5個(gè)視野內(nèi)淋巴管進(jìn)行計(jì)數(shù), 記錄平均值。FoxC2為細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)染色, 主要為細(xì)胞核染色。以同一顯微鏡倍數(shù)(×40)觀察全片, 確定腫瘤浸潤(rùn)邊緣, 然后選擇5個(gè)高倍(×400)視野, 取所分析的5個(gè)不同視野染色細(xì)胞所占百分比及染色強(qiáng)度進(jìn)行綜合評(píng)分, 染色強(qiáng)度判分標(biāo)準(zhǔn):細(xì)胞未著色為0分(-)、淺黃色為1分(+)、棕黃色為2分(++)、棕褐色為3分(+++)。陽性細(xì)胞所占百分比判分標(biāo)準(zhǔn)[10]:陽性細(xì)胞<1%為0分;1%~10%為1分、>10%~30%為2分;>30%~60%為3分;>60%為4分。以染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比評(píng)分之和作為染色結(jié)果的判定, 陰性或低表達(dá):0~3分;高表達(dá):≥4分。0~3分為低表達(dá)組, ≥4分為高表達(dá)組。

        1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。FoxC2的表達(dá)高低與病人臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)。LYVE-1的表達(dá)情況用MLVD表示, MLVD值與病人臨床病理特征的關(guān)系, 兩組樣本間比較符合正態(tài)分布且方差齊者采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn), 反之則采用秩和檢驗(yàn)。三組樣本間比較先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn), 方差齊且符合正態(tài)分布采用單因素方差分析, 反之則采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。FoxC2和LYVE-1的表達(dá)的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05。

        2 結(jié)果

        2.1 FoxC2表達(dá)和MLVD值與CSCC臨床病理特征的關(guān)系2例正常皮膚組織中FoxC2表達(dá)陰性。44例CSCC中, FoxC2高表達(dá)率為52%(23/44), 有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組其高表達(dá)率為(88.88%), 明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(42.85%)(P=0.036);中低分化組FoxC2高表達(dá)率為(88.88%), 明顯高于高分化組(26.92%)(P<0.001);不同年齡、性別、腫瘤長(zhǎng)徑的CSCC組織中FoxC2表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

        CSCC標(biāo)本經(jīng)免疫組織化學(xué)LYVE-1抗體染色后, 其淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)為棕黃色, 44例CSCC的MLVD為(9.62±5.07)個(gè), 不同年齡、性別、腫瘤長(zhǎng)徑的CSCC組織中MLVD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), CSCC有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、中低分化組的MLVD值分別高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、高分化組(P<0.05)。具體情況見表1。

        表1 原發(fā)性皮膚鱗狀細(xì)胞癌44例癌組織中叉頭框蛋白C2(FoxC2)表達(dá)和微淋巴管密度(MLVD)與其臨床病理特征的關(guān)系

        2.2 FoxC2表達(dá)水平與MLVD的相關(guān)性44例CSCC組織中, FoxC2高表達(dá)組MLVD為(12.24±4.86)個(gè), 低表達(dá)組MLVD為(6.75±3.56)個(gè), Pearson相關(guān)分析顯示, FoxC2表達(dá)情況與MLVD值呈正相關(guān)(r=0.55,P<0.001), 即FoxC2高表達(dá)組的MLVD值高于FoxC2低表達(dá)組的MLVD值。

        3 討論

        CSCC臨床上的治療手段主要以手術(shù)切除治療為主, 我國仍然以傳統(tǒng)腫塊局部切除手術(shù)為主, 國外最常用的手術(shù)治療為莫式顯微描記手術(shù), 此技術(shù)不僅僅可以切除皮膚腫塊, 在充分考慮浸潤(rùn)深度的前提下, 可以將局部復(fù)發(fā)率降到最低, 但在我國還沒有達(dá)到普及[11-12]。目前納米光療已經(jīng)是治療皮膚腫瘤的一種全新的技術(shù), 但治療效果仍然非常受限[13], 我國CSCC病人術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)依然很高, 一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移將會(huì)導(dǎo)致較差的預(yù)后。

        FoxC2是調(diào)節(jié)血管及淋巴管發(fā)育的重要蛋白, 目前有17個(gè)Fox基因亞家族, 控制著一系列生物過程, 包括細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化, 其突變與淋巴水腫密切相關(guān), 同時(shí)也是腫瘤轉(zhuǎn)移所必需的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[14]。本研究結(jié)果顯示, FoxC2在CSCC中低分化組、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中高表達(dá), 提示FoxC2可能參與CSCC發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移, 且FoxC2高表達(dá)組的MLVD值明顯高于低表達(dá)組, 提示FoxC2促進(jìn)腫瘤淋巴管新生, 與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。FoxC2參與腫瘤淋巴管新生的原因可能有:①磷酸化的FoxC2和果蠅同源框蛋白1(Prox1)控制下游的連接蛋白37的表達(dá)[15], 從而阻礙淋巴管瓣膜的形成。FoxC2和連接蛋白37的缺失會(huì)導(dǎo)致淋巴管生長(zhǎng)和重塑發(fā)生嚴(yán)重缺陷[16]。②淋巴管成熟需要流體剪切應(yīng)力, 而FoxC2可以通過調(diào)節(jié)流體剪切應(yīng)力來穩(wěn)定新生的淋巴管系統(tǒng), 幫助其存活[17]。因此FoxC2在淋巴系統(tǒng)中起到至關(guān)重要的作用。已有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)FoxC2在食管癌病人中高度表達(dá), 其表達(dá)程度與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[18], 本研究結(jié)果與其相似。因此, 靶向阻斷FoxC2的表達(dá)可能會(huì)在治療CSCC及腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移有著廣闊的前景。

        LYVE-1是淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物, 用于區(qū)分淋巴管與血管, 對(duì)淋巴管有高度特異性, 在淋巴管新生中發(fā)揮重要的作用[19]。本研究結(jié)果顯示, CSCC有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、中低分化組的MLVD值分別高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、高分化組, FoxC2高表達(dá)組MLVD值大于FoxC2低表達(dá)組, 提示LYVE-1的表達(dá)水平與CSCC的發(fā)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此, 靶向阻斷LYVE-1的表達(dá)可能會(huì)為治療CSCC提供新的方向。

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