黃澤翎, 丁盼, 萬立會(huì), 劉浩, 趙雪可, 曹鴿, 周旭陽, 曹玉文, 3b

乳腺癌是女性最常見惡性腫瘤, 占女性癌癥死亡原因第二位[1］, 越來越多的證據(jù)表明, 遺傳因素和環(huán)境因素均可能與乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[2］, 尋找相對(duì)特異性分子標(biāo)志物對(duì)于乳腺腫瘤的診治和預(yù)后具有重要意義。Hr蛋白（hairless protein）即無毛蛋白[3］, 人Hr蛋白表達(dá)模式與小鼠一致, 在腦和皮膚高表達(dá)[3-4］。另有文獻(xiàn)報(bào)道Hr基因突變與皮膚腫瘤的發(fā)生和存活密切相關(guān)[5］, Hr基因低表達(dá)導(dǎo)致膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病人的生存時(shí)間減少[6］, 因此, 探討Hr蛋白對(duì)乳腺癌變及轉(zhuǎn)移和預(yù)后的影響可能具有一定的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2007年1月至2015年12月石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院石蠟包埋乳腺癌旁正常組織81例（距癌組織＞5 cm）、普通型導(dǎo)管增生79例、不典型導(dǎo)管增生26例、導(dǎo)管原位癌64例、浸潤性導(dǎo)管癌138例。納入標(biāo)準(zhǔn)：病理證實(shí)為原發(fā)性乳腺癌；術(shù)前未進(jìn)行放化療或內(nèi)分泌治療；有完整的臨床病歷資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有嚴(yán)重并發(fā)癥和其他部位惡性腫瘤。臨床分期采用第八版美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)分期[7］, 組織學(xué)類型和分級(jí)基于2019年世界衛(wèi)生組織乳腺腫瘤分類分級(jí)。雌激素受體（ER）和孕激素受體（PR）核染色≥1%為陽性。人表皮生長因子受體-2（HER-2）膜免疫染色3+或基于熒光原位雜交技術(shù)（FISH）基因擴(kuò)增≥2.2倍為陽性。所有納入病人簽署知情同意書, 本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 免疫組織化學(xué)染色石蠟切片依次二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水、高壓微波抗原修復(fù)和3%雙氧水封閉。滴加Hr抗體（1∶50；Santa Cruz, USA）于4 ℃孵育過夜, 滴加二抗（Dako Cytomation EnVision System, Dako, Denmark）孵育30 min, DAB溶液顯色3-5 min, 蘇木精復(fù)染5 min。切片由2名資深臨床病理學(xué)家采用雙盲法判讀結(jié)果。細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)黃色顆粒視為染色陽性。陽性細(xì)胞百分比的評(píng)分為0～4分（0分：0%～5%, 1分：＞5%～25%, 2分：＞25%～50%, 3分：＞50%～75%和4分：＞75%～100%）, 染色強(qiáng)度的評(píng)分為1～3分（0分：無著色, 1分：淡黃色, 2分：黃色和3分：棕黃色）。最后將陽性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度評(píng)分相乘為總免疫組織化學(xué)分?jǐn)?shù), 0～4分為低表達(dá), 5～12分為高表達(dá)。

1.3 隨訪所有浸潤性導(dǎo)管癌病人均以電話或者門診形式進(jìn)行隨訪, 隨訪截止日期為2020年12月, 隨訪時(shí)間為5～148個(gè)月, 中位隨訪時(shí)間為76.5個(gè)月, 中位無復(fù)發(fā)生存時(shí)間為62.5個(gè)月, 中位總體生存時(shí)間為68.5個(gè)月。總生存時(shí)間（OS）定義為手術(shù)至病人死亡或隨訪截止時(shí)間, 無復(fù)發(fā)生存時(shí)間（RFS）定義為手術(shù)至乳腺局部復(fù)發(fā)時(shí)間, 轉(zhuǎn)移定義為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。到隨訪日期結(jié)束, 共計(jì)失訪10例, 死亡46例, 存活82例；復(fù)發(fā)40例, 無復(fù)發(fā)88例；隨訪期間, 40例發(fā)生骨轉(zhuǎn)移, 17例發(fā)生肝轉(zhuǎn)移和16例發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。

1.4 數(shù)據(jù)庫分析應(yīng)用GEPIA數(shù)據(jù)庫（http：//gepia.cancer-pku.cn/）分析Hr基因mRNA在乳腺癌組織中的 表 達(dá)[8］, 設(shè) 定 條 件：（1） gene： Hr, （2） cancer： Breast invasive carcinoma。HCMDB數(shù)據(jù)庫（http：//hcmdb.i-sanger.com/index）分析Hr mRNA在乳腺癌器官轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)[9］, 設(shè)定條件：（1） gene： Hr, （2）cancer： Breast invasive carcinoma。UALCAN在線工具（http：//ualcan.path.uab.edu/）分析Hr mRNA與乳腺癌病人臨床病理參數(shù)的相關(guān)性[10］, 篩選條件：（1）gene：Hr, （2）TCGA dataset： Breast invasive carcinoma。Kaplan-Meier Plotter（http：//kmplot.com/analysis/）分析Hr mRNA表達(dá)與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系[11］, 設(shè)置條件：（1）cancer： Breast cancer；（2）gene： Hr；（3）survival：Overall survival（OS） / Rescurrencefree survival（RFS）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 22.0和GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的錄入與分析。使用±s描述符合正態(tài)分布的計(jì)量資料, 多組間比較采用單因素方差分析；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（第25、第75百分位數(shù)）[M（P25,P75）］表示, 采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)進(jìn)行組間的比較。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示, 采用χ2檢驗(yàn)。應(yīng)用Spearman等級(jí)相關(guān)分析檢驗(yàn)Hr蛋白在器官轉(zhuǎn)移中的相關(guān)性。使用Kaplan-Meier分析和log-rank檢驗(yàn)分析乳腺癌生存資料。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hr蛋白在乳腺癌變過程組織中表達(dá)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示, 乳腺上皮細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)黃色顆粒為Hr蛋白表達(dá), Hr在乳腺癌旁正常組織、普通型導(dǎo)管增生、不典型導(dǎo)管增生、導(dǎo)管原位癌、浸潤性導(dǎo)管癌中的免疫組織化學(xué)評(píng)分逐漸減少（P＜0.001）, 五組間兩兩比較, 正常組織（P＜0.001）、普通型增生（P＜0.001）、不典型增生（P=0.018）、原位癌（P=0.021）分別與浸潤癌之間的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 普通型增生與原位癌之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.034）, 詳見圖1；表1, 2。GEPIA數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示, 與正常乳腺組織2.62（2.24, 3.00）相比, Hr mRNA水平在乳腺癌組織1.85（0.78, 2.92）中呈現(xiàn)低表達(dá)（Z=-5.83,P＜0.001）。

圖1 正常乳腺組織到浸潤性導(dǎo)管癌細(xì)胞HE染色圖（×200）及相應(yīng)無毛蛋白免疫組織化學(xué)染色圖（×200）

表1 乳腺癌變過程組織中Hr蛋白表達(dá)強(qiáng)度/例（%）

表2 乳腺癌變過程組織中Hr蛋白表達(dá)評(píng)分比較

2.2 Hr蛋白表達(dá)與乳腺癌病人臨床病理特征的相關(guān)性Hr蛋白高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM晚分期、PR陰性具有相關(guān)性（P＜0.05）, 見表3。UALCAN數(shù)據(jù)庫揭示Hr基因mRNA高表達(dá)分別與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM晚分期及ER、PR、HER-2表達(dá)陰性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）, 見圖2。

表3 Hr蛋白表達(dá)與乳腺癌（浸潤性導(dǎo)管癌）138例臨床病理參數(shù)的相關(guān)性/例（%）

圖2 Hr mRNA與臨床病理參數(shù)關(guān)系：A為Hr與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；B為Hr與臨床分期；C為Hr與雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）及人表皮生長因子受體-2（HER-2）

2.3 Hr蛋白與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)分析上述研究顯示Hr高表達(dá)與病人TNM晚分期有關(guān), 進(jìn)一步檢測(cè)Hr與乳腺癌發(fā)生骨、肝臟和肺臟轉(zhuǎn)移的相關(guān)性, 結(jié)果顯示, Hr蛋白與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移具有明顯正相關(guān)性（P=0.005）, 見表4, 圖3。并且與未發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織2.50（0.00, 6.00）相比, Hr蛋白在發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織7.00（2.50, 8.00）中顯著高表達(dá)（Z=-3.42,P=0.001）；HCMDB數(shù)據(jù)庫也顯示, 與未發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織2.75（1.80, 4.20）相比, Hr mRNA水平在發(fā)生骨轉(zhuǎn)移乳腺癌組織4.48（2.48, 7.75）中呈現(xiàn)高表達(dá)（Z=-3.32,P=0.002）, 本研究與其一致, 提示Hr分子可能與促進(jìn)乳腺癌發(fā)生骨轉(zhuǎn)移相關(guān)。在此基礎(chǔ)上, 進(jìn)一步分析臨床病理參數(shù)與乳腺癌發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的相關(guān)性, 結(jié)果顯示組織學(xué)低分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM晚分期與骨轉(zhuǎn)移差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）, 說明低分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM晚分期是乳腺癌發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素, 見表5。

圖3 無毛蛋白在無骨轉(zhuǎn)移和骨轉(zhuǎn)移乳腺癌中表達(dá)（免疫組織化學(xué)染色×200）：3A為無骨轉(zhuǎn)移；3B為骨轉(zhuǎn)移

表4 Hr蛋白與乳腺癌（浸潤性導(dǎo)管癌）138例器官轉(zhuǎn)移的相關(guān)性/例

表5 臨床病理參數(shù)與乳腺癌（浸潤性導(dǎo)管癌）138例骨轉(zhuǎn)移的相關(guān)性/例

2.4 Hr蛋白對(duì)乳腺癌預(yù)后的影響前期研究發(fā)現(xiàn), Hr分子與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM晚分期以及骨轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性, 進(jìn)一步探討Hr蛋白對(duì)乳腺癌病人生存狀態(tài)的影響, Kaplan-Meier 生存分析結(jié)果顯示, Hr高表達(dá)病人的無復(fù)發(fā)生存率和總體生存率低于Hr低表達(dá)病人（P＜0.05）, Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫顯示Hr mRNA高表達(dá)與無復(fù)發(fā)生存率和總體生存率降低顯著相關(guān)（P＜0.05）, 提示Hr分子是乳腺癌預(yù)后不良的因素, 詳見圖4。

圖4 無毛蛋白對(duì)乳腺癌（浸潤性導(dǎo)管癌）138例預(yù)后的影響：4A為無毛蛋白與病人無復(fù)發(fā)生存曲線；4B為無毛蛋白與病人總體生存曲線；4C為無毛蛋白mRNA與病人無復(fù)發(fā)生存曲線；4D為無毛蛋白mRNA與病人總體生存曲線

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn), Hr蛋白在乳腺正常組織、普通型導(dǎo)管增生、不典型導(dǎo)管增生、導(dǎo)管原位癌、浸潤性導(dǎo)管癌中的表達(dá)水平逐漸降低, 提示Hr分子在乳腺連續(xù)癌變過程中可能扮演抑癌基因角色。目前研究較多的是Hr突變與腫瘤的關(guān)系, 在藥物和紫外線誘導(dǎo)下的Hr突變無毛老鼠發(fā)生皮膚乳頭狀瘤比率顯著高于有毛老鼠[12-14］, 隨后Kim等[15］發(fā)現(xiàn)紫外線照射后的老鼠Hr陰性者更容易發(fā)生皮膚鱗狀細(xì)胞癌, 有學(xué)者報(bào)道Hr突變與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤及其他腦腫瘤相關(guān)[6］, 并且其表達(dá)水平明顯降低。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致, 說明Hr低表達(dá)能促進(jìn)腫瘤形成。通過組間比較發(fā)現(xiàn), Hr在乳腺正常組織、普通型增生、不典型增生、原位癌中的表達(dá)分別顯著高于浸潤癌, 提示Hr蛋白低表達(dá)可能促進(jìn)正常上皮發(fā)生良性增生甚至惡性轉(zhuǎn)化, 在乳腺癌變階段和早期浸潤階段發(fā)揮抑癌基因作用。

我們進(jìn)一步分析Hr對(duì)乳腺癌病人臨床病理特征的影響, 發(fā)現(xiàn)Hr高表達(dá)的病人更容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM晚期以及ER、PR、HER-2表達(dá)陰性, 提示Hr蛋白可能促進(jìn)乳腺癌惡性進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。因此, 有必要探討Hr蛋白對(duì)乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的影響, 結(jié)果顯示Hr在發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中表達(dá)明顯升高, 進(jìn)而分析Hr與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的關(guān)系, 結(jié)果顯示Hr與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)而與肝和肺轉(zhuǎn)移無顯著性, 提示Hr蛋白在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中可能作為癌基因角色發(fā)揮促進(jìn)作用。有研究發(fā)現(xiàn), 血清維生素含量低水平乳腺癌婦女的總體存活率和無病生存期較差[16］, 此外, 組織學(xué)低分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM晚分期也是乳腺癌發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的重要因素。STRING數(shù)據(jù)庫顯示Hr與JMJD8蛋白相互作用, JMJD8激活A(yù)KT/GSK3β/β-catenin信號(hào)通路上調(diào)靶基因MMP9表達(dá)[17］, 從而增強(qiáng)骨質(zhì)溶解促進(jìn)腫瘤細(xì)胞骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生[18］, 提示Hr蛋白促進(jìn)骨轉(zhuǎn)移可能與上述分子及機(jī)制有關(guān), 有待我們進(jìn)一步分析探討。最后本研究顯示Hr蛋白高表達(dá)的乳腺癌病人預(yù)后更差, 有文獻(xiàn)報(bào)道Hr低表達(dá)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病人預(yù)后較差[6］, 與我們研究結(jié)果不一致, 可能與Hr在不同的腫瘤中發(fā)揮不同的作用有關(guān)。

綜上所述, Hr是影響乳腺癌病人的預(yù)后因素, 可能成為評(píng)估乳腺癌預(yù)后的指標(biāo)。