鄭業(yè)煥 張影 李軼 張藝 方娟 付光宇

摘要：目的 通過(guò)頭孢洛林對(duì)臨床革蘭陽(yáng)性菌的體外敏感性研究，為臨床頭孢洛林合理使用提供參考。方法 收集了491株臨床非苛養(yǎng)革蘭陽(yáng)性菌，同時(shí)采用自動(dòng)化系統(tǒng)和微量稀釋法對(duì)頭孢洛林進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)兩種檢測(cè)方法進(jìn)行一致性研究，分析革蘭陽(yáng)性菌對(duì)頭孢洛林體外敏感性。結(jié)果 491株革蘭陽(yáng)性菌最低抑菌濃度檢測(cè)結(jié)果中，用自動(dòng)化系統(tǒng)和微量肉湯稀釋法測(cè)定的MIC值在±1個(gè)二倍稀釋倍數(shù)范圍內(nèi)的有479株，超出此范圍的有12株菌，即基本一致性（EA，Essential agreement）為97.56%（479/491）。針對(duì)有CLSI折點(diǎn)的金黃色葡萄球菌敏感性分析，211株用自動(dòng)化系統(tǒng)和微量稀釋法測(cè)定MIC值在±1個(gè)稀釋倍數(shù)的范圍內(nèi)，有7株菌的MIC值超出了此范圍，即EA為96.70%（205/212）。1株菌藥敏解釋出現(xiàn)差異，即分類(lèi)一致性（CA，Category agreement）為99.53%（211/212）。此外，統(tǒng)計(jì)分析顯示試劑盒檢測(cè)金黃色葡萄球菌對(duì)頭孢洛林的敏感率為96.70%（205/212），MRSA對(duì)頭孢洛林的敏感率為95.95%（71/74）。結(jié)論 在自動(dòng)化儀器藥敏檢測(cè)中，頭孢洛林用于革蘭陽(yáng)性菌的藥敏檢測(cè)結(jié)果精準(zhǔn)穩(wěn)定，與微量肉湯稀釋法的符合率達(dá)到97%以上，對(duì)MRSA的敏感率較高，一定程度上滿足臨床微生物實(shí)驗(yàn)室藥敏檢測(cè)需求。

關(guān)鍵詞：頭孢洛林；革蘭陽(yáng)性菌；藥敏；體外

中圖分類(lèi)號(hào)：R978.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Research of sensitivity of ceftaroline to Gram-positive bacteria

Zheng Yehuan1， Zhang Ying1， Li Yi2， Zhang Yi3， Fang Juan1， and Fu Guangyu1

（1 Zhengzhou Autobio Diagnostics Co.， Ltd， Zhengzhou 450016; 2 Henan Provincial People，s Hospital， Zhengzhou 450003;

3? Zhengzhou central Hospital， Zhengzhou 450052）

Abstract Objective Through the study of the in vitro sensitivity of ceftaroline to clinical Gram-positive bacteria， it provides a reference for the rational use of ceftaroline in clinical practice. Methods A total of 491 clinical non-caustic Gram-positive bacteria were collected， and the in vitro susceptibility test of ceftaroline was carried out by automated system and micro-dilution method， and the consistency of the two detection methods was studied by statistical methods， and the sensitivity of Gram-positive bacteria to ceftaroline in vitro was analyzed. Results Among the 491 strains of parallel detection， 479 strains were determined by automated system and microdilution method in the range of ±1 dilution multiple， and the MIC values of 12 strains exceeded this range， that is， the basic consistency （EA， essential agreement） was 97.56% （479/491）. For the sensitivity analysis of Staphylococcus aureus with CLSI vertices， 211 strains were determined by automated systems and microdilution methods in the range of ±1 dilution multiple， and the MIC value of 7 strain exceeded this range， that is， EA was 96.70% （205/212）. One strain had inconsistent susceptibility results， namely 99.53% （211/212） of the Category agreement （CA）. In addition， statistical analysis showed that the sensitivity rate of Staphylococcus aureus to ceftaroline detected by the kit was 96.70% （205/212）， and that of MRSA to ceftaroline was 95.95% （71/74）. Conclusion In the automated instrumental susceptibility detection， the drug sensitivity test results of ceftaroline for Gram-positive bacteria were accurate and stable， and the coincidence rate with the micro broth dilution method was more than 97%， and the sensitivity rate to MRSA was high， which to some extent met the needs of clinical microbiology laboratory drug sensitivity test.

Key words Ceftaroline; Gram-positive bacteria; Antibiotics sensitivity; In vitro

革蘭陽(yáng)性菌在自然界分布廣泛，存在于自然環(huán)境、人和動(dòng)物的皮膚黏膜等部位，可引起多種局部化膿性或全身感染[1]。革蘭陽(yáng)性菌種類(lèi)較多，從全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)2014-2019年間的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)來(lái)看，全部醫(yī)院檢出革蘭陽(yáng)性菌排名靠前的五位分別為：金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、肺炎鏈球菌和屎腸球菌[2]。

革蘭陽(yáng)性菌（如金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌和腸球菌等）感染患者常用的抗生素選擇有青霉素、頭孢曲松、左氧氟沙星、喹諾酮類(lèi)等。其中，青霉素類(lèi)為革蘭陽(yáng)性球菌感染的首選抗生素，或第一、二代頭孢菌素用于抗感染治療。但由于青霉素酶的產(chǎn)生和作用靶位的改變等耐藥機(jī)制的出現(xiàn)和廣譜抗生素的使用，導(dǎo)致病原菌對(duì)抗生素的耐藥或多重耐藥率的增加，特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）、耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌 （methicillin-resistant coagulase negative staphylococci，MRCNS）、耐萬(wàn)古霉素的腸球菌（vancomycin-resistant Enterococcus，VRE）等，因此尋找對(duì)多重耐藥革蘭陽(yáng)性菌的有效治療藥物是當(dāng)今抗感染藥物研究的熱點(diǎn)之一。

頭孢洛林（ceftaroline） 是頭孢洛林酯的活性代謝產(chǎn)物，由日本武田制藥研發(fā)的第五代頭孢菌素類(lèi)抗生素，通過(guò)干擾細(xì)菌細(xì)胞壁發(fā)揮作用，用于治療細(xì)菌性肺炎、急性細(xì)菌性皮膚感染等。2010年美國(guó)食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)該藥上市，2012年在歐盟上市，目前在我國(guó)尚未上市，其抗菌譜廣，對(duì)大多數(shù)革蘭陽(yáng)性菌（含MRSA、VRE等）和許多革蘭陰性菌及厭氧菌，都有較強(qiáng)的抗菌活性，而且副作用小[3]。本研究結(jié)合最新2020版CLSI M100-S30標(biāo)準(zhǔn)[4]，491株測(cè)試菌株分離自河南省人民醫(yī)院、鄭州市中心醫(yī)院臨床樣本，采用自動(dòng)化儀器法進(jìn)行頭孢洛林敏感性試驗(yàn)，同時(shí)以微量肉湯稀釋法進(jìn)行對(duì)比，為新抗菌藥物的藥效做出評(píng)價(jià)并為臨床上治療革蘭陽(yáng)性菌感染及合理用藥提供一定的參考和指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 菌株來(lái)源

2020年2月—2020年11月本研究收集了河南省人民醫(yī)院、鄭州市中心醫(yī)院臨床常規(guī)分離的革蘭陽(yáng)性菌株491株，包含腸球菌190株，芽胞桿菌30株，微球菌1株，金黃色葡萄球菌212株，其他屬葡萄球菌58株（溶血葡萄球菌14株，表皮葡萄球菌24株，中間葡萄球菌4株，人葡萄球菌4株，耳葡萄球菌3株，腐生葡萄球菌1株，路鄧葡萄球菌5株，模仿葡萄球菌1株，頭葡萄球菌2株）。質(zhì)控菌株采用ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株：金黃色葡萄球菌（ATCC29213）糞腸球菌（ATCC29212）均源于鄭州安圖生物工程股份有限公司。

1.2 試劑

頭孢洛林購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；革蘭陽(yáng)性菌藥敏板（含梯度稀釋的頭孢洛林）和全自動(dòng)微生物鑒定藥敏分析儀AutoMic-i600由鄭州安圖生物工程股份有限公司提供；Mueller-Hinton Broth （MHB）培養(yǎng)基購(gòu)自BD醫(yī)療器械（上海）有限公司。

1.3 方法

革蘭陽(yáng)性菌藥敏嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)和儀器標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程完成上機(jī)檢測(cè)；微量稀釋法的操作和判讀參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[5]：配制與頭孢洛林包被板卡標(biāo)記濃度一致的濃度梯度稀釋液8～0.12 ?g/mL

（包含陽(yáng)性、陰性對(duì)照孔），完成加樣后進(jìn)行封閉處理，在35℃±1℃環(huán)境下孵育20～24 h，當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照孔明顯渾濁時(shí)，觀察結(jié)果并記錄MIC值。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)自動(dòng)化儀器法與微量肉湯法MIC結(jié)果，參考CLSI折點(diǎn)文件確定敏感程度。并統(tǒng)計(jì)2種不同方法檢測(cè)結(jié)果的EA（指測(cè)試方法與對(duì)比方法在±1個(gè)稀釋倍數(shù)范圍內(nèi)的符合率）和CA（指測(cè)試方法與對(duì)比方法的藥敏解釋完全一致的符合率）[6-7]。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)控菌株最低抑菌濃度檢測(cè)結(jié)果

本次質(zhì)量控制參考CNAS-GL028臨床微生物檢驗(yàn)程序驗(yàn)證指南[8]，選用的2株ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株，每天重復(fù)測(cè)定3次，每次單獨(dú)制備接種物，連續(xù)測(cè)定5天，記錄藥物的MIC值，結(jié)果顯示藥敏板卡結(jié)果與微量稀釋法一致，均符合質(zhì)控范圍要求，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1所示。

2.2 樣本EA結(jié)果分析

共計(jì)491株革蘭陽(yáng)性菌，479株用自動(dòng)化藥敏儀器法和微量稀釋法測(cè)定MIC值在±1個(gè)2倍稀釋梯度范圍內(nèi)。其中完全一致的有176株（176/491，35.85%），±1個(gè)稀釋倍數(shù)的有303株（303/491，61.71%）。超出了±1個(gè)2倍稀釋梯度的有12株菌，EA為97.56%（479/491），針對(duì)這12株菌經(jīng)復(fù)測(cè)確認(rèn)，有9株菌測(cè)定結(jié)果在±1個(gè)2倍稀釋梯度范圍內(nèi)，即糾正后的EA為99.39%（488/491），結(jié)果見(jiàn)表2所示。

2.3 樣本CA結(jié)果分析

頭孢洛林僅對(duì)金黃色葡萄球菌有藥敏折點(diǎn)解釋標(biāo)準(zhǔn)，故有藥敏解釋的樣本共212例，且CLSI M100文件指出頭孢洛林對(duì)葡萄球菌的藥敏折點(diǎn)包括S、SDD、R，其中SDD是指劑量依賴(lài)性敏感。針對(duì)212株金黃色葡萄球菌用自動(dòng)化藥敏和微量稀釋法測(cè)定，藥敏結(jié)果不一致的有1株，即分類(lèi)一致性（CA，category agreement）為99.53%（211/212）（表3）。

2.4 CPT藥敏結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析

使用革蘭陽(yáng)性菌藥敏檢測(cè)試劑盒檢測(cè)頭孢洛林藥敏結(jié)果，整體敏感率為96.70%（205/212）；MRSA的敏感率為95.95%（71/74），具體結(jié)果見(jiàn)表4。

3 討論

抗菌藥物敏感性試驗(yàn)是指對(duì)臨床組織樣本中分離的細(xì)菌進(jìn)行體外抗菌藥物敏感性試驗(yàn)，用于測(cè)定抗菌藥物在體外對(duì)病原微生物有無(wú)抑菌或殺菌的作用，旨在幫助臨床醫(yī)師選用效果最佳的藥物治療感染性疾病。目前，臨床微生物實(shí)驗(yàn)室采用的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)方法主要有紙片擴(kuò)散法、E-test法、肉湯稀釋法和自動(dòng)化儀器法（即產(chǎn)品化的微量肉湯法）。其中，紙片擴(kuò)散法通過(guò)測(cè)量抑菌圈來(lái)反應(yīng)對(duì)測(cè)試菌株對(duì)抗菌藥物的敏感程度，該方法測(cè)得藥敏結(jié)果具有較好的重復(fù)性、效率較高，且試劑成本相對(duì)較低，因此是基層醫(yī)院開(kāi)展藥敏試驗(yàn)常用的一種方法。E-test法雖然可以檢測(cè)具體MIC值，但操作基本都是手工完成，E-test試條成本較高，藥物選擇種類(lèi)有限也限制了其應(yīng)用。肉湯稀釋法可分為宏量肉湯稀釋法和微量肉湯稀釋法，兩種方法的基本原理相同但操作較為繁瑣[7]。為了滿足臨床試驗(yàn)需求，許多廠家生產(chǎn)了商品化的微量抗生素敏感試驗(yàn)板（如BD Phoenix、Vitek-compact系統(tǒng)），簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟，抗生素種類(lèi)豐富，更適合開(kāi)展藥敏試驗(yàn)。

頭孢菌素類(lèi)藥物屬于β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素藥物，是一類(lèi)廣譜半合成抗生素，通過(guò)干擾繁殖期細(xì)菌細(xì)胞壁中肽聚糖的合成發(fā)揮殺菌消炎的作用。與青霉素類(lèi)相比，頭孢菌素具有耐青霉素酶、不良過(guò)敏反應(yīng)較少、毒性較低等優(yōu)點(diǎn)，在呼吸道感染、泌尿系統(tǒng)感染等癥狀治療中發(fā)揮極其重要的作用[9]。但隨著獲得性耐藥和多重耐藥問(wèn)題日趨嚴(yán)重，不斷壓縮臨床抗感染治療藥物的選擇空間，加大治療難度，因此研發(fā)抗菌譜廣、活性高的新型頭孢菌素是目前的研究熱點(diǎn)。第五代頭孢類(lèi)藥物-頭孢洛林酯（Teflaro）于2010年10月通過(guò)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)上市，用于治療由MRSA引起的成人社區(qū)獲得性細(xì)菌性肺炎（CABP）、急性細(xì)菌性皮膚和軟組織感染（ABSSSI），這些潛在致命性感染急需新的治療方案[10-11]。第五代頭孢菌素的最大的臨床應(yīng)用價(jià)值是治療多種病原菌混合感染。特別是有MRSA感染風(fēng)險(xiǎn)的混合感染，因?yàn)槟壳俺Ｓ玫目筂RSA的藥物為萬(wàn)古霉素、替考拉寧和利奈唑胺[12]，而此類(lèi)藥物常需要聯(lián)合其他藥物進(jìn)行聯(lián)合治療，并可能有耳毒性、腎毒性和血小板減少等不良反應(yīng)。五代頭孢的出現(xiàn)讓臨床醫(yī)師們單藥治療多種病原菌混合感染成為可能。該藥物對(duì)β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定性較高，既能減少聯(lián)合抗菌素，又能降低抗菌藥的使用強(qiáng)度，還能讓重癥感染病人得到一個(gè)簡(jiǎn)單卻沒(méi)有死角的抗感染治療的最佳選擇[13]。

頭孢洛林作為新型第五代頭孢菌素，在2010年美國(guó)上市之后相繼有不少研究學(xué)者對(duì)治療兒童急性細(xì)菌感染性疾?。ㄖ饕–AP和SSSIS）的療效進(jìn)行報(bào)道，美國(guó)醫(yī)療中心關(guān)于頭孢洛林對(duì)細(xì)菌病原體耐藥性五年監(jiān)測(cè)項(xiàng)目中指出：頭孢洛林在≤2 μg /ml時(shí)對(duì)所有金黃色葡萄球菌均有抑制作用，對(duì)甲氧西林耐藥的菌株也具有較好的抗菌活性[14]。體外藥敏試驗(yàn)中頭孢洛林對(duì)頭孢曲松耐藥肺炎鏈球菌和耐多藥肺炎鏈球菌均有較好的抑制作用[15]，劉岳峰等[16]檢索了2010年10月—2020年2月間發(fā)表在Pubmed、EMBASE、Cochrane Central Register of Controlled Trials、Medline、CBM、CNKI上的關(guān)于涉及關(guān)鍵詞“頭孢洛林、兒童、急性細(xì)菌感染”等的198篇報(bào)道，并對(duì)內(nèi)容進(jìn)行提取通過(guò)Meta分析得出結(jié)論：頭孢洛林治療兒童急性細(xì)菌感染性疾病的臨床療效和安全性較好。袁曉慶等[17]在對(duì)頭孢洛林的作用機(jī)制研究中指出頭孢洛林與青霉素結(jié)合蛋白具有高度親和力，對(duì)MRSA的最低抑菌濃度濃度明顯低于β-內(nèi)酰胺抗生素，表明頭孢洛林在體外對(duì)MRSA有一定的抗菌活性。

本文通過(guò)對(duì)陽(yáng)性球菌中的212株金黃色葡萄球菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果分析可見(jiàn)，安圖革蘭陽(yáng)性菌藥敏檢測(cè)試劑盒中的頭孢洛林對(duì)金黃色葡萄球菌的敏感率可達(dá)到96.70%（205/212），其中對(duì)MRSA的敏感率達(dá)到95.95%（71/74）。通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)：Biedenbach等[18]研究的頭孢洛林可以抑制臨床分離的90.2% MRSA。Sader等[19]在2013年對(duì)2351株金黃色葡萄球菌藥敏結(jié)果進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)對(duì)頭孢洛林的敏感率達(dá)到93.4%。與本文結(jié)果比較接近，此外Pfaller等[20]采用金標(biāo)準(zhǔn)微量肉湯稀釋法對(duì)6222株金黃色葡萄球菌對(duì)頭孢洛林的藥物敏感性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)敏感率可高達(dá)99.6%，對(duì)MRSA敏感率99.1%。進(jìn)一步可以說(shuō)明，本研究使用的方法得到的金黃色葡萄球菌的藥敏結(jié)果準(zhǔn)確度較高。另外本文也匯總分析了全球各地對(duì)頭孢洛林的藥敏研究結(jié)果：其中美國(guó)地區(qū)頭孢洛林對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌率98.2%，頭孢洛林對(duì)甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌（MSSA）的抑菌率達(dá)100%[21]；中東和非洲國(guó)家在2015—2018年中從軟組織感染分離的MRSA菌株未發(fā)現(xiàn)頭孢洛林耐藥的現(xiàn)象[22]；在一項(xiàng)全球皮膚感染項(xiàng)目中關(guān)于頭孢洛林和頭孢他啶阿維巴坦對(duì)革蘭陽(yáng)性菌和陰性菌的體外活性研究指出，從歐洲、亞洲/南太平洋、拉丁美洲、非洲/中東這些地區(qū)收集的7950株甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（MSSA）對(duì)頭孢洛林的敏感性高達(dá)99.6%，9174株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）分離株對(duì)頭孢洛林的敏感率同樣高達(dá)96.5%的比例[23]。

綜上可見(jiàn)全球不同地區(qū)針對(duì)頭孢洛林對(duì)金黃色葡萄球菌及MRSA敏感率的研究有微小區(qū)域差異性，但整體抑菌率比較接近，與本文金黃色葡萄球菌敏感率96.70%（MRSA敏感率95.95%）結(jié)論比較一致；更進(jìn)一步展現(xiàn)了頭孢洛林對(duì)金黃色葡萄球菌較好的抗菌活性，為臨床陽(yáng)性菌感染又添利器。

藥物敏感性試驗(yàn)為臨床用藥、新藥研究、監(jiān)測(cè)耐藥變遷、發(fā)現(xiàn)耐藥機(jī)制等提供客觀證據(jù)[24]，準(zhǔn)確的藥敏試驗(yàn)對(duì)于臨床選擇適當(dāng)?shù)目刮⑸锼幬锓浅ｊP(guān)鍵[25]。本文中研究的頭孢洛林的結(jié)果顯示EA達(dá)到99.39%，CA達(dá)到99.53%。可見(jiàn)評(píng)價(jià)試劑與微稀釋方法有較高的一致性，可以為臨床體外藥敏試驗(yàn)提供更多選擇。