武瑞赟，桂 萌，劉子宇，Tharushi S. Shinali，尚 楠,

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，北京 100083；3.北京市農(nóng)林科學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)院研究所，北京 100068；4.北京語言大學(xué)社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，北京 100083）

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)中最常見的惡性上皮腫瘤[1]，在歐美等一些發(fā)達國家，結(jié)直腸癌已經(jīng)成為繼肺癌、肝癌和乳腺癌后的第四大常見癌癥[2]，嚴重威脅人類健康。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，生活方式的轉(zhuǎn)變以及老齡化人口的增漲，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率明顯上升，亟需開展有效的防治工作。由于結(jié)直腸癌發(fā)病因素復(fù)雜，病理表征多樣[3]。目前，結(jié)合外科手術(shù)和放療、化療的綜合治療對結(jié)直腸癌的治療效果并不理想，靶向治療費用較為昂貴；此外，結(jié)直腸癌的形成和發(fā)展是一個多階段的漫長過程，通常需要7～10 年的潛伏期[4]，這就為早期的預(yù)防提供了最佳的機會。預(yù)防藥物的開發(fā)已成為目前結(jié)直腸癌研究中的熱點；但是，許多經(jīng)歷多年開發(fā)的化學(xué)預(yù)防藥物都被發(fā)現(xiàn)在長期服用下存在一定的安全問題，如抗藥性或?qū)ζ渌K器的毒性[5]。因此，在滿足有效的同時，尋找安全低毒的預(yù)防物質(zhì)是目前迫切需要解決的問題。

硫酸軟骨多糖（chondroitin sulfate，CS）廣泛存在于動物軟骨、結(jié)締組織和細胞外基質(zhì)中，以D-葡萄糖醛酸（D-glucuronic acid，GlcA）和N-乙酰-D-半乳糖胺（N-acetyl-D-galactosamine，GalNAc）通過β-1,3糖苷鍵為基本二糖單位，二糖單位之間通過β-1,4-糖苷鍵連接形成的一類線性直鏈糖胺聚糖[6]，分子質(zhì)量約10～100 kDa，具有抗炎、止血、保持關(guān)節(jié)軟骨彈性、調(diào)節(jié)細胞發(fā)育、調(diào)控細胞黏附分化和增殖、抗腫瘤等多種生物活性[7]。但是CS的高分子質(zhì)量和高電荷密度導(dǎo)致其生物利用率較低，限制了其生物功效的發(fā)揮[8-9]。越來越多的證據(jù)表明，低分子質(zhì)量CS具有黏度小、溶解性好、易吸收等優(yōu)點，可有效克服CS生物利用率低的缺點，如牛源CS經(jīng)降解后制備出不同分子質(zhì)量的CS（92.7、54.1、26.3、19.7 kDa），通過體外氧化實驗證明了低分子質(zhì)量的CS具有更高的抗氧化活性[10]。因此，開發(fā)和制備分子質(zhì)量低、活性高的CS受到研究者的青睞。目前，低分子質(zhì)量CS主要通過酸降解法、氧化降解法、超聲降解法、輻射降解法以及酶解法獲得[11-14]，其中由于酶解法具有反應(yīng)條件溫和、催化效率高、操作簡便、作用底物專一、產(chǎn)物分子質(zhì)量可控性高等優(yōu)點而被廣泛使用。

常見的CS大多來源于鯊魚軟骨組織，但過度捕撈造成鯊魚資源的日趨匱乏。鱘魚作為世界上最大最原始的軟骨硬鱗魚類，軟骨含量可占魚體的10%～20%[15-16]，為CS的研究提供了豐富的來源。實驗室之前對鱘魚來源的CS進行結(jié)構(gòu)分析，表明鱘魚CS（sturgeon sulfate chondropolysaccharides，SCS）具有和鯊魚CS一樣的官能團和相似的結(jié)構(gòu)[17]，說明SCS可作為鯊魚CS的良好替代物。且前期實驗發(fā)現(xiàn)，SCS具有抑制結(jié)直腸癌細胞增殖的作用[18-19]，但體內(nèi)吸收效果不佳，大量不能吸收的CS主要是通過調(diào)節(jié)患病小鼠腸道菌群緩解或減緩結(jié)直腸癌的發(fā)展[20]。因此，本實驗以SCS為原料，結(jié)直腸癌細胞HT-29增殖活性為指標，通過酶解法，利用響應(yīng)面優(yōu)化制備具有抗結(jié)直腸癌活性的低分子質(zhì)量SCS。此外，開發(fā)SCS相關(guān)的食品或保健食品目前缺乏明確的毒理安全評價資料。因此，本實驗進一步通過動物急性毒性實驗探究制備的SCS食用安全性，研究結(jié)果為開發(fā)以低分子質(zhì)量SCS為基礎(chǔ)的膳食營養(yǎng)補充劑預(yù)防、降低結(jié)直腸癌發(fā)生風(fēng)險提供實驗依據(jù)，對SCS相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)和進一步的安全應(yīng)用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雜交鱘魚（Acipenser schrenckii×Huso dauricus）CS由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院應(yīng)用微生物實驗室制備保存。

BALB/c小鼠（生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006）購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。SPF級健康5 周齡雌雄小鼠各半飼養(yǎng)于北京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。按照SPF級要求，溫度（22±2） ℃，相對濕度（50±10）%，嚴格按照12 h光照/黑暗循環(huán)進行飼養(yǎng)和管理。實驗中各組小鼠進食和飲水自由。

硫酸軟骨素酶AC（chondroitinase sulfate AC，ChonAC） 北京碧澄生物科技有限公司；人源結(jié)直腸癌細胞HT-29細胞 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶細胞消化液、磷酸鹽緩沖液 美國Gibco公司；順鉑（cisplatin，DDP）美國Sigma公司；蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）試劑盒 北京索萊寶生物技術(shù)有限公司；葡聚糖分子質(zhì)量標準品 美國聚合物標準品公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-1/1C冷凍干燥機 北京德天佑科技發(fā)展有限公司；UV2355紫外-可見分光光度計 上海尤尼科儀器有限公司；SynergyHTX酶標儀 美國Biotek公司；DHG-9141A恒溫恒熱培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；Hitachi 720血生化分析儀 日本日立公司；HEMAVET 950FS血細胞分析儀 美國DREW公司；3K15通用臺式冷凍離心機美國Sigma公司；UFSC40001 Amicon攪拌超濾杯 美國貝德福德密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

HT-29細胞從液氮中取出，在37 ℃快速溶解后，離心收集細胞沉淀，加入新鮮的含有10%牛血清的DMEM培養(yǎng)基并重懸細胞后，置于無菌的細胞培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5%的二氧化碳條件下培養(yǎng)細胞，待細胞增殖到90%左右時進行傳代，3 代以上后用于實驗。

1.3.2 細胞增殖實驗

細胞經(jīng)胰蛋白酶消化2 min后，吹打細胞成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為5×104cells/mL，按照每孔100 μL加入到96 孔板中，于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，更換不同質(zhì)量濃度的SCS溶液（DMEM培養(yǎng)基配制），同時設(shè)置不添加任何藥物的空白處理組和DDP陽性對照組。每個處理設(shè)置6 個平行，培養(yǎng)24 h后，每孔添加10 μL CCK-8試劑，避光4 h后，在450 nm波長下測定吸光度，按照下式計算細胞抑制率。

式中：A處理為處理組吸光度；A空白為空白組吸光度；A對照為DDP陽性對照組吸光度。

1.3.3 具有抑制結(jié)直腸癌增殖的低分子質(zhì)量SCS最優(yōu)制備條件確定

1.3.3.1 單因素試驗

利用單因素試驗，探究酶添加量、底物質(zhì)量濃度、pH值、酶解時間、酶解溫度5 個因素下酶解產(chǎn)物對HT-29細胞增殖抑制率，共進行5 組實驗。酶添加量選取0.012 5、0.025 0、0.050 0、0.100 0、0.200 0 IU/mg；pH值選取5、6、7、8、9；酶解時間選取15、30、60、90、120 min；底物質(zhì)量濃度選取0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 mg/mL；酶解溫度選取20、25、30、35、40 ℃。單因素試驗中每個實驗重復(fù)3 次，取平均值。

1.3.3.2 Plackett-Burman（PB）試驗

試驗中使用Design-Expert 8.0.6軟件輔助設(shè)計PB試驗，選用N＝12的PB試驗設(shè)計。因素及水平如表1所示，響應(yīng)值為酶解產(chǎn)物（1 000 μg/mL）對HT-29細胞存活率。通過對各因素效應(yīng)值、方差和貢獻率的分析，選出貢獻率前3的因素進行下一步研究。

表1 PB試驗設(shè)計Table 1 Low and high levels of each independent variable used in Plackett Burman design

表2 PB試驗結(jié)果Table 2 Plackett Burman design and experimental results

1.3.3.3 最陡爬坡試驗

根據(jù)PB試驗得到的顯著因素和效應(yīng)值，利用軟件設(shè)計最陡爬坡試驗的方向和步長。非顯著因素的取值根據(jù)PB試驗中的效應(yīng)值確定。

1.3.3.4 響應(yīng)面試驗

由最陡爬坡試驗得到的拐點可確定響應(yīng)中心及接近響應(yīng)值區(qū)間的因素取值范圍，利用Box-Benhnken（BB）法，利用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應(yīng)面分析。試驗?zāi)Ｐ蛯Ξa(chǎn)物（1 000 μg/mL）作用下HT-29細胞存活率進行二次多元回歸擬合，得到等高線圖和響應(yīng)面曲線圖，并獲得最優(yōu)酶解制備條件，對模型進行方差分析，確定可信度并進行驗證。

1.3.4 低分子質(zhì)量SCS分離

將在最優(yōu)酶解條件下獲得的SCS酶解溶液經(jīng)三氯乙酸除去蛋白后離心取上清，添加到Amicon攪拌超濾杯中，并連續(xù)通過不同分子質(zhì)量的超濾膜（截留分子質(zhì)量5、3、0.5 kDa）。超濾過程中的壓力調(diào)節(jié)0.10～0.22 mPa。收集3 種超濾成分，包括＞5、3～5、0.5～3 kDa，并冷凍干燥樣品，分別命名為SCS-1、SCS-2和SCS-3。測定不同分子質(zhì)量的凍干SCS質(zhì)量，并測定其對HT-29細胞存活率的影響。

1.3.5 動物實驗分組和處理

BALB/c小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后隨機分為6 組，其中雌性和雄性各3 組，每組10 只，實驗采用最大灌胃劑量方法，每只小鼠灌胃劑量為1 mg/（g·d），分別灌胃SCS和SCS-F2，另設(shè)生理鹽水為正常對照組，按照每只0.2 mL/d進行灌胃，連續(xù)灌胃2 周后處死小鼠，取各組織臟器進行病理分析，經(jīng)眼球采血后，進行血液指標和血生化指標的測定。

1.3.6 血常規(guī)測定

使用血液細胞分析儀進行血常規(guī)測定，指標包括紅細胞計數(shù)、紅細胞比容、平均紅細胞體積、白細胞計數(shù)、平均紅細胞血紅蛋白、血小板計數(shù)等。

1.3.7 血液生化指標測定

使用血生化測定儀進行液生化指標測定，包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶、白蛋白等。

1.3.8 病理切片觀察

將剖取的臟器組織置于10%的中性福爾馬林組織固定液中，使用不同體積分數(shù)乙醇溶液和無水乙醇進行梯度脫水，二甲苯透明后，石蠟包埋。使用切片機對組織進行切片，厚度5 μm，按照試劑盒進行操作進行染色后使用光學(xué)顯微鏡檢測并采集圖片，進行病理分析。

取小鼠結(jié)直腸樣本制好的HE染色切片，顯微鏡下進行觀察并拍照記錄，每個樣本隨機選取2～3 個不同視野進行拍照，利用軟件進行圖像分析。選取組織結(jié)構(gòu)完整性好的隱窩，對結(jié)直腸縱切后，記錄每個隱窩縱向一半時的細胞數(shù)為所需隱窩深度，每個樣本的計數(shù)均需要大于20 個隱窩。

1.4 數(shù)據(jù)處理

各個組別臟器指標、血生化以及血液學(xué)指標統(tǒng)計完全后將實驗組的數(shù)據(jù)與空白組利用SPSS軟件進行分析，采用單因素方差分析的方法對各組間的差異進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標準差表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

如圖1所示，隨著酶添加量、pH值、溫度、酶解時間和底物質(zhì)量濃度的增加，酶解產(chǎn)物對HT-29細胞的抑制率呈現(xiàn)先增加后降低或趨于不變的趨勢。其中，酶添加量在0.1、0.2 IU/mg時達到最大（圖1A），這是由于在一定的底物質(zhì)量濃度時，大分子、長鏈的糖鏈會被酶解成短鏈的多糖，從而分子質(zhì)量降低[13-14]，但是酶解產(chǎn)物對細胞的抑制率與酶解效率并不呈正相關(guān)，小分子的糖越多，分子質(zhì)量越低并不一定代表對細胞的抑制活性越強。如圖1B所示，當pH值為7時對細胞的抑制率最高為58.05%；而后隨pH值增加，酶解產(chǎn)物的細胞活性抑制率降低。這可能是由于隨pH值增加，糖苷鍵斷裂加劇，聚合度減低，形成的單糖越多，為細胞生長提供的營養(yǎng)越充分，促進細胞增殖[21]，也因此細胞的抑制率有所降低。在固定酶添加量和pH值的條件下，酶解溫度對產(chǎn)物活性的影響如圖1C所示，酶解溫度為35 ℃時，產(chǎn)物對HT-29細胞的抑制率最高，為62.43%。這是由于溫度的升高，使酶與底物之間的分子運動速率增加，酶的作用效果加強，酶解效率也有所增加，糖苷鍵斷裂的數(shù)量增加，使更多具有抑制癌細胞生長的活性糖鏈片段被分離出來。在此條件下，隨酶解時間延長，細胞抑制率在60 min時達到最大值64.41%（圖1D）；而后酶解時間進一步延長，一方面底物和酶的含量有限，酶解效率減緩；另一方面，酶解得到的寡糖或者二糖增加，細胞生長需要的碳源增加，使得細胞的增殖能力有所上升，SCS對HT-29細胞的抑制率降低。保持其他條件不變的情況下，底物質(zhì)量濃度為1、2 mg/mL時，產(chǎn)物對細胞的抑制率最大，分別為70.04%和70.11%（圖1E），且與其他各組差異顯著。細胞抑制率增長表明酶解反應(yīng)后更多具有活性的SCS被解離[22-23]，糖苷鍵斷裂，具有抗腫瘤活性的糖鏈被解離出來。通過單因素試驗得到最適酶添加量、pH值、酶解溫度、酶解時間及底物質(zhì)量濃度分別為0.1 IU/mg、7、35 ℃、60 min和1 mg/mL。

圖1 酶添加量（A）、pH值（B）、溫度（C）、酶解時間（D）、底物質(zhì)量濃度（E）對細胞增殖活性的影響Fig. 1 Effects of enzyme dosage (A), pH (B), temperature (C),enzymatic hydrolysis time (D) and substrate concentration (E) on cell proliferation activity

2.2 PB試驗

利用Design Expert 8.0.6設(shè)計N＝12的Plackett-Burman，選擇對酶添加量（A）、底物質(zhì)量濃度（B）、酶解溫度（C）、pH值（D）及溫度（E）5 個因素進行分析?？疾旄饕蛩貙χ苽涞拿附猱a(chǎn)物抑制結(jié)直腸癌細胞增殖活性的影響，以上述因素在單因素實驗中的結(jié)果選擇合適的范圍和高低水平，以酶解產(chǎn)物對結(jié)直腸癌細胞HT-29的抑制率為響應(yīng)值，設(shè)計和結(jié)果分別如表1、2所示。

用Design Expert 8.0.6對實驗結(jié)果進行效應(yīng)分析以及方差分析，結(jié)果如表3、4所示。由表3可知，酶添加量、底物質(zhì)量濃度、酶解時間這3 個因素為正效應(yīng)；pH值、溫度2 個因素為負效應(yīng)，并且這些因素效應(yīng)值的大小與貢獻率保持一致。由表4可知，模型顯著，說明PB模型選擇合適，各因素P值的大小反映了該因素對實驗結(jié)果影響的顯著程度，P值越小說明該因素對結(jié)果影響越顯著。因此可選用這3 個因素進行最陡爬坡試驗。對于其他的因素，pH值、溫度為負效應(yīng)，因此應(yīng)選取其低水平，即pH 5、溫度35 ℃。

表3 PB試驗設(shè)計因素水平及效應(yīng)分析Table 3 Analysis of effect and contribution rate of each variable used in PB design

表4 PB試驗整體因素模型方差分析表Table 4 Analysis of variance for the effect of each variable on cell proliferation activity in PB design

2.3 最陡爬坡試驗

最陡爬坡法是將各因素正負效應(yīng)的變化確定為爬坡方向，利用各因素的效應(yīng)值大小確定變化步長，可以更經(jīng)濟快速地逼近最佳值區(qū)域，得到有效的響應(yīng)擬合方程。根據(jù)PB試驗結(jié)果，篩選出主要的影響因素并設(shè)計最陡爬坡路徑。最陡爬坡試驗拐點圖如圖2所示。編號為4的實驗是最大值點，對應(yīng)的條件為酶添加量0.1 IU/mg、底物質(zhì)量濃度1 mg/mL、酶解時間90 min。對應(yīng)對HT-29細胞的抑制率可達80.95%，故該點為下一步BB試驗設(shè)計的中心點。

圖2 最陡爬坡試驗Fig. 2 Results of steepest ascent test

2.4 BB響應(yīng)面試驗

利用Design-Expert 8.05b軟件對酶添加量（A）、底物質(zhì)量濃度（B）、酶解時間（C）設(shè)計三因素三水平的實驗，BB試驗的結(jié)果如表5所示。BB試驗的數(shù)據(jù)分析使用Design-Expert 8.0.5b軟件進行方差分析，結(jié)果如表6所示。

表5 Box-Behnken試驗設(shè)計Table 5 Box-Behnken design and experimental results

表6 Box-Behnken實驗回歸模型方差分析Table 6 AVOVA of quadratic polynomial model developed based on Box-Behnken design

由表6可知，所選擇的回歸模型的P值小于0.05，表明整體模型對實驗結(jié)果有顯著的影響，具有可信度；失擬項的P值為0.053 5，不顯著，說明未知因素對結(jié)果的影響較小，殘差主要由隨機誤差引起，模型選擇適當；該模型的相關(guān)系數(shù)R2＝0.978 7，信噪比大于4，表明模型可信。低分子質(zhì)量硫酸軟骨對HT-29細胞的抑制率（Y）對酶添加量（A）、底物質(zhì)量濃度（B）、酶解時間（C）的多元二次回歸方程為：

由回歸方程所做的響應(yīng)面立體圖見圖3所示，主要反映了酶添加量、底物質(zhì)量濃度和酶解時間之間的交互作用。通過方程可知，二次項系數(shù)為負值，表明方程具有最大值。利用Design-expert8.0.5b分析計算，酶解最佳條件為酶添加量0.103 IU/mg、底物質(zhì)量濃度1.005 mg/mL、酶解時間87 min，可得最大抑制率82.63%。按照工藝進行驗證實驗，所得結(jié)果為82.55%，與預(yù)測值基本吻合，說明模型很好地預(yù)測試驗結(jié)果。

圖3 兩因素交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig. 3 Response surfaces and contour plots showing individual and interactive effects of variables on inhibitory activity against cell proliferation

2.5 具有抗結(jié)直腸癌活性的低分子質(zhì)量SCS的超濾分離

超濾分離后各組分相對含量如圖4A所示，共收集到3 個組分，凍干并計算相對含量，SCS-F1、SCS-F2和SCS-F3分別占SCS總質(zhì)量的24.11%，57.07%和18.02%。配制1 000 μg/mL的各組分樣品進行細胞實驗，檢測各組分對結(jié)直腸癌細胞HT-29增殖活性的抑制效果。如圖4B所示，SCS-F2具有更高的抑制活性（88.87%），顯著高于陽性對照DDP處理組（50.70%）。同時分子質(zhì)量最小的SCS-F3卻顯示出較低的抑制活性，約29.13%，低于陽性對照DDP組，這可能是由于分子質(zhì)量降低，具有抗腫瘤活性的官能團減少或者消除[23]，使得該組分（SCS-F3）不具有抗腫瘤活性，因此選擇SCS-F2進行后續(xù)研究。

圖4 不同分子質(zhì)量截留超濾后各組分相對含量（A）和對結(jié)直腸癌細胞HT-29增殖活性的影響（B）Fig. 4 Percentages of ultrafiltration fractions with different molecular masses (A) and their inhibitory effects on the proliferation of colorectal cancer cell line HT-29 (B)

2.6 具有抗腫瘤活性的低分子質(zhì)量SCS毒性分析

動物實驗期間，各小鼠均未表現(xiàn)出明顯的不良反應(yīng)，且無意外死亡狀況發(fā)生。隨機剖取各組中的小鼠，觀察不同處理對小鼠心、肝、脾、肺、腎和結(jié)腸組織的影響。表7中臟器質(zhì)量結(jié)果顯示，SCS-F2對臟器的生長發(fā)育沒有影響。如圖5所示，各組臟器的形態(tài)、顏色和質(zhì)地未見變化。其中肝臟組織切片的HE染色圖顯示各組肝臟中肝小葉排列規(guī)則、結(jié)構(gòu)無異常、無病理性改變，但是在空白對照組中，可見少部分胞漿呈空泡網(wǎng)格狀，猜測可能有輕微炎癥現(xiàn)象，SCS-F2處理組中未見該現(xiàn)象，且干細胞索排列整齊，細胞形態(tài)正常，胞核位于中央，胞漿分布均勻，未見變性壞死，說明對肝臟沒有毒性影響，結(jié)合上述肝臟血生化指標（表7），SCS-F2處理組中血液中抗炎指標均高于空白組，說明SCS-F2一定程度上對肝臟具有保護作用。

圖5 SCS和SCS-F2對小鼠組織臟器的影響（200×）Fig. 5 Effects of SCS and SCS-F2 on visceral tissues of mice (200 ×)

表7 SCS和SCS-F2對小鼠臟器質(zhì)量、血常規(guī)及血生化的影響Table 7 Effects of SCS and SCS-F2 on visceral organ mass, complete blood count and blood biochemical indexes in mice

腎臟病理切片觀察可以看出，各組小鼠腎臟組織中腎皮質(zhì)及腎髓質(zhì)分界清晰，腎小球分散且分布均勻，周圍組織未見明顯病變，均為正常腎臟組織。腎臟的基本功能是產(chǎn)生尿液[24-25]，清除體內(nèi)代謝產(chǎn)物及不可被吸收的殘渣，具有保證機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和新陳代謝的正常進行的作用[26-29]，說明SCS-F2對腎臟不具有毒副作用。

異常隱窩灶（aberrant crypt foci，ACF）是結(jié)直腸的一種癌前病變，是結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的一個重要階段[30-31]。因此，對ACF的檢測和改善可以有效預(yù)防結(jié)直腸癌的早期發(fā)生[32]。如圖5所示，各組中小鼠結(jié)腸隱窩細胞排列整齊規(guī)則；對比正常對照組，SCS-F2處理組中不論是雄性或者是雌性小鼠中結(jié)腸均為出現(xiàn)柱狀細胞和杯狀細胞增生的現(xiàn)象。如圖6所示，與正常對照組和SCS處理組相比，SCS-F2處理后ACF數(shù)量較低，僅為6.11±2.09（雄性）和6.00±3.21（雌性），說明SCS-F2具有預(yù)防和治療結(jié)直腸癌的潛力。綜合以上結(jié)果，SCS-F2屬于實際無毒級，對小鼠內(nèi)臟器官無不良影響。根據(jù)《保健食品檢驗與技術(shù)評價規(guī)范》，當死亡數(shù)量≤50%時，可以進入下一階段的毒理學(xué)試驗，實驗結(jié)果說明實驗組在1 000 μg/（g·d）劑量下滿足食品安全要求，可初步確定SCS-F2安全。

圖6 SCS和SCS-F2對小鼠結(jié)腸ACF的影響Fig. 6 Effects of SCS and SCS-F2 on colonic aberrant crypt foci in mice

3 結(jié) 論

本實驗以SCS為原料，以結(jié)直腸癌細胞抑制率為指標，利用酶解法和響應(yīng)面法結(jié)合的手段，確定最佳酶解制備條件，通過凝膠層析色譜，分離純化出具有高活性的低分子質(zhì)量SCS；采用小鼠急性毒性實驗，對SCS-F2的食用安全性進行評價。結(jié)果顯示，制備的低分子質(zhì)量SCS具有較高的抑制結(jié)直腸癌增殖活性，且無毒副作用，在1 000 μg/（g·d）劑量下滿足保健食品的要求。本研究為開發(fā)高活性、低分子質(zhì)量SCS的制備和研究提供新思路，初步了解SCS是否具有食用安全性，為SCS相關(guān)產(chǎn)品的日后開發(fā)和利用提供依據(jù)。