余文怡, 伍慧敏, 郭秀潔, 閆淑梅, 劉湘杰, 王竹君, 王超然1,*, 沈愛(ài)金*, 梁鑫淼

(1. 中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 中國(guó)科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 遼寧 大連 116023; 2. 中科院大化所中國(guó)醫(yī)藥城生物醫(yī)藥創(chuàng)新研究院, 江蘇 泰州 225300; 3. 江西省中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 贛江中藥創(chuàng)新中心, 江西 南昌 330000; 4. 黑龍江烏蘇里江制藥有限公司, 黑龍江 虎林 158417)

腦血管病是目前我國(guó)患病率、致殘率、病死率最高的疾病之一,嚴(yán)重威脅著人們的生命健康安全[1,2],根據(jù)《中國(guó)卒中報(bào)告2019》, 2018年中國(guó)居民腦血管病死亡率為149.49/10萬(wàn),死亡人數(shù)約157萬(wàn),占當(dāng)年總死亡人數(shù)的22.33%[3]。刺五加注射液是五加科植物刺五加Acanthopanaxsenticosus(Rupr. et Maxim.) Harms的干燥根和根莖或莖經(jīng)過(guò)提取、過(guò)濾和滅菌等工藝制得的注射液。研究表明刺五加注射液能明顯改善急性腦梗死患者的血脂水平及內(nèi)皮細(xì)胞功能,促進(jìn)缺血腦組織神經(jīng)干細(xì)胞的增殖,對(duì)高血壓、腦梗死等腦血管疾病具有良好的療效[4,5]。除此之外,刺五加注射液對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有良好的鎮(zhèn)靜作用[5],可以改善焦慮、煩躁、失眠等癥狀,臨床上常用于治療情志異常類(lèi)疾病[6]和神經(jīng)系統(tǒng)疾病[7]。

中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究是藥效及作用機(jī)理研究的前提,目前針對(duì)刺五加藥材化學(xué)成分的研究已有較多報(bào)道[8-11],而針對(duì)刺五加注射液化學(xué)成分的研究卻十分有限,僅有Xie等[12]采用高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(HPLC-Q-TOF-MS)從刺五加注射液中鑒定出22個(gè)化合物,黃婧等[13]采用HPLC-Q-TOF-MS從刺五加注射液中鑒定出54個(gè)苯丙素類(lèi)成分。作為刺五加臨床用藥的主要形式,刺五加注射液化學(xué)成分研究對(duì)明確刺五加藥材及多種刺五加制劑的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)非常重要。

靜電場(chǎng)軌道阱是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型質(zhì)譜質(zhì)量分析器,相比于飛行時(shí)間質(zhì)譜具有掃描速度更快、分辨率更高等優(yōu)勢(shì),尤其是與超高效液相色譜(UHPLC)結(jié)合后可大大縮短樣品分析時(shí)間,提高化學(xué)成分的鑒定效率,近年來(lái)已成為復(fù)雜樣品分析的有力工具,廣泛用于各種中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究[14]。采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用(UHPLC-Q/Orbitrap HRMS)技術(shù),建立刺五加注射液的快速分析方法,深入研究其化學(xué)成分,進(jìn)一步明確其物質(zhì)基礎(chǔ),對(duì)于深入闡明刺五加及其相關(guān)制劑的藥效作用機(jī)理具有重要的意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Vanquish UHPLC超高效液相色譜儀(Thermo Scientific,美國(guó)),配有自動(dòng)進(jìn)樣器、二元梯度泵、柱溫箱和二極管陣列檢測(cè)器;Q Exactive Plus超高分辨率四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜儀(Thermo Scientific,美國(guó)),配有加熱電噴霧離子(HESI)源、Xcalibur化學(xué)工作站和Compound Discoverer 3.2數(shù)據(jù)處理軟件;Milli-Q超純水制備儀(Milli-pore,美國(guó)); XSR105 DualRange十萬(wàn)分之一電子天平(METTLER TOLEDO,瑞士); SORVALL ST8臺(tái)式離心機(jī)(Thermo Scientific,美國(guó)); KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

刺五加提取液(批號(hào)21080201-01)和注射液(批號(hào)202008012)由黑龍江烏蘇里江制藥有限公司提供,提取液為藥材經(jīng)過(guò)純水提取、減壓濃縮、醇沉等步驟制得,提取液再經(jīng)過(guò)濾、稀釋后制得注射液,制備過(guò)程中未添加其他輔料。標(biāo)準(zhǔn)品信息見(jiàn)表1。

1.2 溶液制備

對(duì)照品溶液:稱(chēng)定各對(duì)照品適量,分別用70%(v/v)甲醇水溶液溶解,得到對(duì)照品儲(chǔ)備液,置于4 ℃防爆冰箱中保存,質(zhì)量濃度為0.2～0.7 mg/mL。取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量,配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中各化合物濃度見(jiàn)表1。

表1 對(duì)照品信息及在混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中的質(zhì)量濃度

供試品溶液:取刺五加注射液100 μL,加入900 μL純水稀釋10倍后離心(8 000 r/min, 10 min),取上清液,即得供試品溶液。

1.3 儀器條件

色譜條件:Waters ACQUITY UPLC BEH Shield RP18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液,流動(dòng)相B為乙腈;梯度洗脫程序:0～2 min, 0%B; 2～4 min, 0%B～5%B; 4～15 min, 5%B～20%B; 15～15.1 min, 20%B～90%B; 15.1～17 min, 90%B。流速:0.4 mL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:2 μL;檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm。

質(zhì)譜條件:HESI源,正、負(fù)離子模式下分別進(jìn)行檢測(cè);屏蔽氣流速:45 arb;輔助氣流速:10 arb;正離子模式噴霧電壓:3.5 kV,負(fù)離子模式噴霧電壓:3.0 kV;離子傳輸管溫度:380 ℃; S-lens RF水平: 50;干燥氣溫度:400 ℃;數(shù)據(jù)采集模式:一級(jí)質(zhì)譜全掃描加數(shù)據(jù)依賴的二級(jí)質(zhì)譜掃描(Full MS/dd-MS2);質(zhì)量掃描范圍:100～1 300;分辨率:70 000(Full MS), 17 500(MS2);碰撞能(stepped NCE): 10、30和50; TopN: 3;動(dòng)態(tài)排除:2 s。

發(fā)揮水電、水務(wù)的引領(lǐng)帶動(dòng)作用，以項(xiàng)目實(shí)施為載體，重點(diǎn)幫扶陜西、河南、湖南、云南等地加快水利投融資平臺(tái)建設(shè)，吸引社會(huì)資本廣泛參與水電、城市供水、污水處理、水生態(tài)城市開(kāi)發(fā)建設(shè)等，輻射帶動(dòng)社會(huì)投資超過(guò)200億元。此外，不斷優(yōu)化投融資結(jié)構(gòu)，開(kāi)展水利融資租賃試點(diǎn)工作，獲得融資租賃5年期資金3億元，綜合成本比基準(zhǔn)利率下浮13%。落實(shí)中央關(guān)于援疆工作部署，新疆在建水電工程新增投資12.6億元，新增裝機(jī)27.9萬(wàn)kW。重點(diǎn)援疆項(xiàng)目阿爾塔什水利樞紐等重點(diǎn)工程進(jìn)展順利。準(zhǔn)東供水工程發(fā)揮效益，五一水庫(kù)樞紐工程完成投資4.09億元，拉依蘇石化工業(yè)區(qū)供水管網(wǎng)工程建設(shè)全部完工。

1.4 數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)采用Xcalibur軟件和Compound Discoverer 3.2(CD)軟件進(jìn)行處理,扣除背景空白和提取色譜峰后,結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的刺五加藥材及刺五加注射液的化學(xué)成分[9,13,15-17],首先進(jìn)行一級(jí)精確相對(duì)分子質(zhì)量的匹配,然后采用CD軟件在mzCloud和mzVault數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜圖匹配,對(duì)于匹配分?jǐn)?shù)≥75的成分,人工確認(rèn)其二級(jí)譜圖的匹配情況,對(duì)于沒(méi)有匹配分?jǐn)?shù)的成分,結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的碎片和裂解規(guī)律進(jìn)行鑒定,最后采用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)部分化合物進(jìn)行確認(rèn)。

2 結(jié)果與討論

采用UHPLC-Q/Orbitrap HRMS分析刺五加提取液和注射液,刺五加注射液的紫外色譜圖和正、負(fù)離子模式總離子流圖見(jiàn)圖1,根據(jù)1.4節(jié)的數(shù)據(jù)處理方法從中鑒定出102個(gè)化學(xué)成分,包括62個(gè)苯丙素類(lèi)、23個(gè)有機(jī)酸類(lèi)、7個(gè)核苷類(lèi)、1個(gè)環(huán)烯醚萜類(lèi)和9個(gè)其他類(lèi)成分,其中有65個(gè)成分為從刺五加注射液中首次鑒定得到,包括27個(gè)苯丙素類(lèi)、22個(gè)有機(jī)酸類(lèi)、7個(gè)核苷類(lèi)、1個(gè)環(huán)烯醚萜類(lèi)和8個(gè)其他類(lèi),并系統(tǒng)歸納總結(jié)了各類(lèi)型化合物的裂解規(guī)律。

圖1 刺五加注射液的紫外色譜圖和總離子流色譜圖

2.1 刺五加注射液中苯丙素類(lèi)成分的鑒定

苯丙素類(lèi)化合物是指一類(lèi)以C6-C3為基本單元的化合物。在植物體內(nèi),這種單元可獨(dú)立形成化合物,如苯丙醇類(lèi)化合物、苯丙醛類(lèi)化合物和苯丙酸類(lèi)化合物,也可以2個(gè)、3個(gè)甚至多個(gè)單元聚合形成某一類(lèi)化合物,如木脂素類(lèi)化合物,還可以形成多種氧化程度不同的衍生物,如香豆素類(lèi)化合物。刺五加注射液中包含眾多不同結(jié)構(gòu)類(lèi)型的苯丙素類(lèi)化合物。

2.1.1苯丙酸類(lèi)成分的鑒定

苯丙酸類(lèi)成分在植物中常與不同的醇、氨基酸、糖、有機(jī)酸結(jié)合形成糖苷類(lèi)或酯類(lèi)化合物,且易發(fā)生糖苷鍵和酯鍵的斷裂,丟失葡萄糖(-162 Da)、咖啡酰基(-162 Da)、阿魏?；?-176 Da)、香豆?；?-146 Da)等中性基團(tuán),或者丟失其他基團(tuán)產(chǎn)生咖啡酸(m/z179)、阿魏酸(m/z193)、香豆酸(m/z163)等碎片離子。刺五加注射液中有很多奎寧酸與咖啡酰基、阿魏酰基和苯丙?；Y(jié)合而成的異構(gòu)體,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品研究了這類(lèi)異構(gòu)體的裂解規(guī)律:隱綠原酸(cryptochlorogenic acid,化合物70)相比于新綠原酸(neochlorogenic acid,化合物37)和綠原酸(chlorogenic acid,化合物73)具有更高豐度的m/z173碎片,而新綠原酸相比于綠原酸具有更高豐度的m/z179碎片,這一現(xiàn)象與文獻(xiàn)[18,19]報(bào)道一致,圖2以綠原酸為例描述了這類(lèi)化合物的裂解途徑。值得一提的是,綠原酸和隱綠原酸的出峰順序與文獻(xiàn)報(bào)道略有差異,可能是因?yàn)檫@兩個(gè)成分的保留時(shí)間比較接近,在不同類(lèi)型反相色譜柱上的選擇性有差異導(dǎo)致的。利用以上碎片豐度差異以及化合物在BEH Shield RP18色譜柱上的出峰順序?qū)Ρ奖；鼘幩犷?lèi)化合物(9、10、15、16、19)和阿魏?；鼘幩犷?lèi)化合物(31、50、53)進(jìn)行了鑒定。

圖2 咖啡?？鼘幩犷?lèi)化合物的二級(jí)質(zhì)譜圖和綠原酸的質(zhì)譜裂解途徑

除上述已報(bào)道的成分外,從刺五加注射液中首次鑒定了10個(gè)苯丙酸類(lèi)成分,具體鑒定過(guò)程如下:化合物30、52、59、67、71具有相同的相對(duì)分子質(zhì)量和二級(jí)碎片,分子式為C10H10O4,主要碎片m/z177和m/z163為丟失H2O和CH3OH產(chǎn)生,經(jīng)CD軟件匹配二級(jí)譜圖將其鑒定為3-羥基-5-甲氧基-肉桂酸(3-hydroxy-5-methoxy-cinnamic acid)及其在不同取代位置的異構(gòu)體;化合物82和85互為同分異構(gòu)體,其質(zhì)量數(shù)和二級(jí)碎片與刺五加果實(shí)中報(bào)道的(2E)-3-[4-({(1S,2S)-1-[4-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-3-甲氧基苯基]-1,3-二羥基-2-丙烯基}氧基)-3-甲氧基苯基]丙烯酸((2E)-3-[4-({(1S,2S)-1-[4-(β-D-glucopyranosyloxy)-3-methoxyphenyl]-1,3-dihydroxy-2-propanyl}oxy)-3-methoxyphenyl] acrylic acid)一致[17],該化合物在刺五加根和根莖中未見(jiàn)報(bào)道;化合物84的分子式為C32H36O17,碎片m/z529為[M-Glu]-,碎片m/z353和m/z191為繼續(xù)丟失阿魏酰基和咖啡?；a(chǎn)生,結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道將其鑒定為阿魏?？Х弱？鼘幩崞咸烟擒?feruloyl caffeicyl quinic acid glucoside)[9];化合物41在正離子模式下有碎片m/z131和m/z103,為丟失CH3OH和CO產(chǎn)生,經(jīng)CD軟件匹配二級(jí)譜圖將其鑒定為肉桂酸甲酯(methyl cinnamate);化合物64先丟失H2O產(chǎn)生m/z147,再丟失CO和·CH3產(chǎn)生m/z119和m/z103,經(jīng)CD軟件匹配二級(jí)譜圖將其鑒定為D(+)-苯乳酸(D(+)-phenyllactic acid)。

2.1.2苯丙醇類(lèi)成分的鑒定

從刺五加注射液中鑒定到3個(gè)苯丙醇類(lèi)成分,分別為紫丁香苷葡萄糖苷(syringinoside,化合物39)、松柏苷(coniferin,化合物42)和紫丁香苷(syringin,化合物48),其中紫丁香苷葡萄糖苷和松柏苷為首次從刺五加注射液中鑒定得到,其在質(zhì)譜中的裂解從糖苷鍵的斷裂開(kāi)始,然后發(fā)生H2O、·CH3等中性丟失,松柏苷的裂解途徑見(jiàn)圖3。

圖3 松柏苷的二級(jí)質(zhì)譜圖和質(zhì)譜裂解途徑

2.1.3苯丙醛類(lèi)成分的鑒定

從刺五加注射液中鑒定出1個(gè)苯丙醛類(lèi)成分芥子醛(sinapaldehyde,化合物88),該化合物在正離子模式下響應(yīng)較好,在負(fù)離子模式下響應(yīng)較弱,質(zhì)譜裂解以中性丟失CO、CH3OH、·CH3等為主,經(jīng)CD軟件匹配二級(jí)譜圖將其鑒定為芥子醛,其裂解途徑見(jiàn)圖4,該化合物為首次從刺五加中鑒定得到。

圖4 芥子醛的二級(jí)質(zhì)譜圖和質(zhì)譜裂解途徑

2.1.4香豆素類(lèi)成分的鑒定

從刺五加注射液中鑒定到9個(gè)香豆素類(lèi)成分,均為簡(jiǎn)單香豆素及其與葡萄糖、鼠李糖連接形成的糖苷類(lèi)化合物?；衔?5、62、66、90為同分異構(gòu)體,正、負(fù)離子模式加合峰和二級(jí)碎片均相同,負(fù)離子模式下碎片離子m/z206和m/z191為分子離子峰連續(xù)丟失·CH3產(chǎn)生,繼續(xù)連續(xù)丟失CO產(chǎn)生m/z163、m/z135和m/z107,化合物90通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品鑒定為異嗪皮啶(isofraxidin),其裂解途徑見(jiàn)圖5,其余3個(gè)化合物鑒定為秦皮素定(fraxidin)或白蠟樹(shù)精(fraxinol)或網(wǎng)狀菌醇(reticulol),為異嗪皮啶不同取代基位置差異的異構(gòu)體,這3個(gè)異構(gòu)體為首次從刺五加注射液中鑒定得到。

化合物56和化合物63根據(jù)其正、負(fù)離子模式加合峰推測(cè)其分子式分別為C17H20O10和C23H30O14,二級(jí)碎片m/z221分別為[M-Glu]-和[M-Glu-Rha]-,其余碎片離子與化合物90一致,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比將化合物56鑒定為刺五加苷B1(eleutheroside B1),根據(jù)文獻(xiàn)[13]推測(cè)化合物63為刺五加苷B2(eleutheroside B2),其二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖5?；衔?9與化合物56為同分異構(gòu)體,其丟失葡萄糖之后的碎片與秦皮素定和異嗪皮啶等化合物相同,將其鑒定為秦皮素定葡萄糖苷(fraxidin-O-glucoside)。

圖5 異嗪皮啶、刺五加苷 B1、刺五加苷 B2的二級(jí)質(zhì)譜圖和異嗪皮啶的質(zhì)譜裂解途徑

化合物46和57通過(guò)一級(jí)相對(duì)分子質(zhì)量匹配分別得到化合物東莨菪素(scopoletin)和秦皮素(fraxetin),二者相差一個(gè)羥基,其質(zhì)譜裂解主要為丟失·CH3、H2O、CO、CH3OH等中性基團(tuán),符合香豆素類(lèi)化合物的一般裂解規(guī)律,此外經(jīng)CD軟件匹配二級(jí)譜圖發(fā)現(xiàn),這兩個(gè)化合物的二級(jí)譜圖與數(shù)據(jù)庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)品的譜圖匹配良好,因此分別將化合物46和57鑒定為東莨菪素和秦皮素,二者均為首次從刺五加注射液中鑒定得到,其裂解途徑見(jiàn)圖6。

圖6 東莨菪素和秦皮素的二級(jí)質(zhì)譜圖和質(zhì)譜裂解途徑

2.1.5木脂素類(lèi)成分的鑒定

刺五加中的木脂素通常以單糖苷或雙糖苷的形式存在[20-22],一般具有相對(duì)較高的相對(duì)分子質(zhì)量(>500)。從刺五加注射液中鑒定出16個(gè)木脂素類(lèi)成分,包括6種結(jié)構(gòu)類(lèi)型:雙環(huán)氧木脂素類(lèi)(83、87、91、100、102)、氧新木脂素類(lèi)(76、78、79)、苯駢呋喃類(lèi)(77、89、95)、單環(huán)氧木脂素類(lèi)(80、96、97)、芳基萘類(lèi)(75)和二芳基丁烷類(lèi)(93)。此類(lèi)化合物的二級(jí)質(zhì)譜通常會(huì)先丟失糖基產(chǎn)生苷元的碎片離子,然后根據(jù)苷元上取代基的不同發(fā)生·CH3、CH2O、CH3OH、·OCH3等中性丟失,進(jìn)一步碰撞還會(huì)產(chǎn)生苷元中醚鍵或呋喃環(huán)等結(jié)構(gòu)的斷裂,生成更小的二級(jí)碎片。如圖7阿拉克苷(salvadoraside)的裂解途徑,準(zhǔn)分子離子峰m/z789連續(xù)丟失糖基生成m/z581和m/z419,碎片m/z419會(huì)丟失CH2O或發(fā)生四氫呋喃環(huán)裂解生成m/z389、m/z222等碎片,該化合物此前只在刺五加莖中有報(bào)道[23],本工作為首次從刺五加注射液中鑒定得到。

圖7 Salvadoraside的二級(jí)質(zhì)譜圖和質(zhì)譜裂解途徑

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,刺五加中的苯丙素類(lèi)成分具有保護(hù)神經(jīng)元、改善植物神經(jīng)紊亂、調(diào)節(jié)免疫力、緩解焦慮等多種藥理活性[24-28]。刺五加苷B、刺五加苷E和異嗪皮啶是刺五加中的主要苯丙素類(lèi)成分,這3個(gè)成分在μmol/L水平對(duì)β淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的軸突和樹(shù)突萎縮具有明顯的保護(hù)作用,而軸突和樹(shù)突萎縮是導(dǎo)致阿爾茨海默癥記憶缺失的直接原因[24]。此外,刺五加苷B還具有心血管保護(hù)作用和抗腫瘤作用,刺五加苷E還具有免疫調(diào)節(jié)作用、抗氧化作用和降血糖作用等[28]。本研究從刺五加注射液中鑒定出包含上述3個(gè)主要成分在內(nèi)的62個(gè)苯丙素類(lèi)成分,其中27個(gè)為首次鑒定到,這些成分為刺五加注射液進(jìn)一步的藥理研究奠定了基礎(chǔ)。

2.2 刺五加注射液中有機(jī)酸類(lèi)成分的鑒定

除了苯丙素類(lèi)成分之外,刺五加注射液中還包含大量小分子有機(jī)酸類(lèi)成分,如水楊酸(salicylic acid)、原兒茶酸(protocatechuic acid)、壬二酸(azelaic acid)等,這些化合物多數(shù)為苯環(huán)或長(zhǎng)鏈烷烴連接羥基或羧基而成,一般在負(fù)離子模式下響應(yīng)較好[29],二級(jí)質(zhì)譜以丟失H2O、CO、CO2、HCOOH等小分子為主,從刺五加注射液中鑒定出23個(gè)有機(jī)酸類(lèi)成分。

綜上,刺五加注射液的化學(xué)成分鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 刺五加注射液中黃酮類(lèi)成分測(cè)定

鑒于刺五加注射液現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-3425-98[30]以紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定總黃酮的含量作為主要質(zhì)量控制方法,但上述質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)主成分均非黃酮類(lèi)成分,因此我們對(duì)刺五加注射液的黃酮類(lèi)成分進(jìn)行了探索?？紤]到?jīng)]有文獻(xiàn)報(bào)道刺五加注射液中的黃酮類(lèi)成分,我們參考刺五加藥材化學(xué)成分的研究工作[8],在刺五加注射液中提取相應(yīng)的黃酮類(lèi)成分的提取離子流圖(EIC),除葛根素和3′-甲氧基葛根素(見(jiàn)圖8)可以提到響應(yīng)很低的色譜峰之外(用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)這兩個(gè)成分進(jìn)行確認(rèn),發(fā)現(xiàn)保留時(shí)間基本一致,但是由于這兩個(gè)成分在刺五加注射液中的含量非常低,質(zhì)譜響應(yīng)在104水平,即使采用target模式也無(wú)法采集到有效的二級(jí)譜圖,因此無(wú)法對(duì)其碎片進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)),其他黃酮類(lèi)成分(包括蘆丁、金絲桃苷、山柰酚、槲皮苷、槲皮素、金合歡素、大豆苷、3′-甲氧基大豆苷、4′-甲氧基葛根素)提取不到色譜峰。我們推測(cè)是由于黃酮類(lèi)成分整體極性相對(duì)較弱,注射液采用水提工藝無(wú)法有效提取。此外,文獻(xiàn)[31]報(bào)道蘆丁等黃酮類(lèi)成分主要存在于刺五加葉中,因此也可能是文獻(xiàn)所用的刺五加藥材中混入了刺五加葉。

圖8 葛根素和3′-甲氧基葛根素在(a)標(biāo)準(zhǔn)溶液和(b)刺五加注射液中的提取離子色譜圖

3 結(jié)論

本研究通過(guò)建立UHPLC-Q/Orbitrap HRMS分析方法,從刺五加注射液中共鑒定出102個(gè)化合物,其中包含62個(gè)苯丙素類(lèi)成分,為刺五加注射液臨床治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病和心血管疾病提供了一定的化學(xué)成分依據(jù)。除此之外,本研究首次鑒定了27個(gè)苯丙素類(lèi)成分、22個(gè)有機(jī)酸類(lèi)成分、7個(gè)核苷類(lèi)成分、1個(gè)環(huán)烯醚萜類(lèi)成分和8個(gè)其他類(lèi)成分,豐富了刺五加注射液的物質(zhì)組成信息,這些新成分的發(fā)現(xiàn)為刺五加注射液作用機(jī)制的闡明奠定了科學(xué)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。與此同時(shí),我們針對(duì)黃酮類(lèi)成分進(jìn)行了探索,發(fā)現(xiàn)黃酮類(lèi)成分并非刺五加注射液的主要成分,現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)測(cè)定總黃酮的含量可能并不能對(duì)注射液進(jìn)行有效的質(zhì)量控制。除上述化學(xué)成分類(lèi)型之外,有研究報(bào)道刺五加中還含有三萜皂苷類(lèi)成分,該類(lèi)成分與人參皂苷類(lèi)成分藥理活性較為相似,與刺五加對(duì)心腦血管的治療作用直接相關(guān)[20],然而在本次實(shí)驗(yàn)中從刺五加注射液中未鑒定到三萜皂苷類(lèi)成分,在對(duì)刺五加提取液進(jìn)行鑒定時(shí)也未發(fā)現(xiàn)三萜皂苷類(lèi)成分,推測(cè)可能是由于三萜皂苷類(lèi)成分極性較弱,在水中溶解度較差導(dǎo)致的,因此現(xiàn)有刺五加注射液的制備方法可能還存在進(jìn)一步改進(jìn)的空間。