劉計(jì)權(quán)，劉佳寧，王 宇，閆曉睿，薛幗珍，劉 昕

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 榆次 030619； 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 102488）

2020版《中國(guó)藥典》規(guī)定，中藥柴胡來源于傘形科藥用植物柴胡（Bupleurum chinenseDC.）或狹葉柴胡（Bupleurum scorzonerifoliumWilld.）的干燥根，分別習(xí)稱為“北柴胡”和“南柴胡”［1］。目前，商品柴胡以北柴胡為主，其中80%以上來源于栽培，野生的不到20%［2］?，F(xiàn)代研究表明，柴胡具有抗病毒、抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛、提高免疫力、保肝利膽、降血脂等多種功效，柴胡皂苷是其發(fā)揮藥效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)［3］。

柴胡作為山西“十大”晉藥之一，從南到北各縣均有種植，總面積達(dá)到35萬畝以上，其產(chǎn)量占全國(guó)產(chǎn)量的1/3左右。藥用植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的積累會(huì)受到海拔、溫度、光照等多種生態(tài)因子的影響［4］，山西地形、氣候復(fù)雜多樣，各地差異懸殊，由于環(huán)境飾變必然會(huì)導(dǎo)致同種柴胡異地藥材在質(zhì)量上的不同［5-6］。本文通過收集山西不同產(chǎn)地柴胡藥材與生態(tài)因子信息，利用HPLC測(cè)定柴胡皂苷含量，分析柴胡皂苷含量與生態(tài)因子的相關(guān)性，以期為山西柴胡的生態(tài)區(qū)劃種植、品質(zhì)提升提供參考依據(jù)。

1 材料

供試藥材：2019年通過野外踏查，從山西晉北、晉中、晉南、晉東南四個(gè)經(jīng)濟(jì)區(qū)選定11個(gè)柴胡種植的縣域，并于同年11月分別采集11個(gè)產(chǎn)地的二年生柴胡藥材，帶回實(shí)驗(yàn)室50℃下烘干，粉碎，過四號(hào)篩備用。所有產(chǎn)地的藥材經(jīng)鑒定均為傘形科植物柴胡B. chinenseDC.的根。

試劑：柴胡皂苷a（批號(hào)：ST01270120，純度為98.0%）、柴胡皂苷 c（批號(hào)：ST01280120，純度為98.0%）、柴胡皂苷 d（批號(hào)：ST03880120，純度為98.0%）購自上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；甲醇、乙腈購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，均為色譜純；實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。

儀器：Waters 2695高效液相色譜儀、Empower工作站、Waters 2998檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）；AlltimaTMC18色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；AB135-S型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；AR323CN型電子分析天平（奧豪斯儀器（常州）有限公司）；HH-4-40276數(shù)顯水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；FW-100高速萬能粉碎機(jī)（北京中興偉業(yè)儀器有限公司），SB-5200DTDN超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

2 方法

2.1 柴胡不同產(chǎn)地生態(tài)因子信息采集

在山西選定的11個(gè)柴胡種植基地（編號(hào)為S1-S11）進(jìn)行野外踏查的過程中，運(yùn)用 GPS（彩途-K20B）記錄各產(chǎn)地的經(jīng)緯度與海拔，氣候因子通過查詢當(dāng)?shù)貧庀笈_(tái)及借鑒中國(guó)氣象數(shù)據(jù)網(wǎng)更新的最新數(shù)據(jù)。柴胡不同產(chǎn)地生態(tài)因子信息采集結(jié)果見表1。

表1 柴胡不同產(chǎn)地生態(tài)因子信息Tab.1 Ecological factors in different habitats of B. Chinense

2.2 柴胡皂苷含量的HPLC測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取柴胡皂苷a、c、d對(duì)照品2.61 mg、1.39 mg、2.07 mg放入1 mL容量瓶中，然后用1 mL甲醇完全溶解。將上述溶液移入5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，充分混勻后，作為混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

精密稱取上述柴胡藥材粉末約0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入5%濃氨-甲醇溶液25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，30 ℃水溫超聲處理（功率200 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用5%的濃氨甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，用甲醇20 mL分2次洗滌容器及藥渣，洗液與濾液合并，回收溶劑至干。殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 色譜條件

依據(jù)參考文獻(xiàn)［7］的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。混合對(duì)照品和柴胡樣品的HPLC色譜圖見圖1。

圖1 混合對(duì)照品及柴胡樣品的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram of reference substance and sample

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

將獲得的數(shù)據(jù)使用 Excel 2019軟件進(jìn)行處理，采用 SPSS 22.0進(jìn)行主成分分析和Pearson 相關(guān)性分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同產(chǎn)地柴胡皂苷含量測(cè)定結(jié)果

不同產(chǎn)地柴胡皂苷a、c、d的含量測(cè)定結(jié)果見表2。由表中結(jié)果可以看出，不同產(chǎn)地之間，柴胡皂苷a、c、d的含量具有一定的差異性。采自S7產(chǎn)地的柴胡，其皂苷a、d、a+d、a+c+d的含量顯著高于其它產(chǎn)地，采自S6產(chǎn)地的柴胡中皂苷c的含量最高。2020版《中國(guó)藥典》規(guī)定，柴胡皂苷a+d的含量不得低于0.30%［1］，本次測(cè)定的11個(gè)產(chǎn)地中，柴胡皂苷a+d的總含量介于0.285%～1.513%之間，產(chǎn)地S2、S8柴胡中柴胡皂苷a+d的含量低于0.30%，未達(dá)到《中國(guó)藥典》規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。

表2 柴胡皂苷含量測(cè)定結(jié)果Tab.2 Determination results of saikosaponin in B. Chinense （%）

3.2 環(huán)境因子主成分分析

3.2.1 生態(tài)因子原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化

利用SPSS 2019軟件，將表1生態(tài)因子原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，結(jié)果見表3。

表3 柴胡不同產(chǎn)地生態(tài)因子原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化Tab.3 Standardization of original data of ecological factors in different habitats of B. Chinense

3.2.2 主成分分析

利用SPSS分析軟件進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見表4。從表4中提取特征值大于1、累計(jì)方差貢獻(xiàn)率大于80%的成分作為主成分。由表4可知，前2個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到82.118%，因此提取2個(gè)主成分，分別設(shè)為Y1和Y2，計(jì)算得到各因子對(duì)原始7個(gè)指標(biāo)數(shù)據(jù)的載荷情況，見表5。

由表5可知，主成分1中因子載荷量較大的變量分別是經(jīng)緯度、無霜期和年均溫，主成分2中因子載荷量較大的變量是年均日照。由表4可知主成分1方差貢獻(xiàn)率為65.005%，主成分2方差貢獻(xiàn)率為17.114%，所以主成分1中的經(jīng)緯度、無霜期和年均溫對(duì)柴胡生長(zhǎng)的影響較為顯著，主成分2中的年均日照變量對(duì)柴胡生長(zhǎng)的影響較弱。

表4 評(píng)價(jià)因子主成分特征值和貢獻(xiàn)率Tab.4 Principal component eigenvalue and contribution rate of evaluation factors

表5 各項(xiàng)評(píng)價(jià)因子載荷矩陣Tab.5 Load matrix of each evaluation factor

3.2.3 不同產(chǎn)地綜合得分

利用軟件和Excel計(jì)算柴胡不同產(chǎn)地綜合得分并進(jìn)行排序，由表6可知，山西各柴胡產(chǎn)地綜合得分較高、排名居于前三位的依次是S7、S6、S5，結(jié)合表1生態(tài)因子調(diào)查結(jié)果和表2柴胡皂苷含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行直觀分析可以看出，S7、S6、S5這三個(gè)產(chǎn)地的生境特點(diǎn)為經(jīng)緯度較高、無霜期較短、年均溫較低，同時(shí)這三個(gè)產(chǎn)地柴胡皂苷a+d的含量相對(duì)較高。因此，初步推測(cè)在一定生境范圍內(nèi)，經(jīng)緯度越高、無霜期越短、年均溫越低的區(qū)域越有利于柴胡皂苷的積累。

表6 柴胡不同產(chǎn)地綜合得分與排名Tab.6 Comprehensive score and ranking of different origins of B. Chinense

3.3 柴胡皂苷含量與生態(tài)因子相關(guān)性分析

表7相關(guān)性分析結(jié)果表明，總體來看，柴胡皂苷含量與經(jīng)緯度、海拔呈正相關(guān)，與年均溫、年均降雨量、年均日照和無霜期呈負(fù)相關(guān)。其中經(jīng)度與柴胡皂苷a、c、d和a+d的含量呈顯著正相關(guān)，緯度與柴胡皂苷a、d、a+d和a+c+d的含量呈極顯著正相關(guān)，而無霜期與柴胡所有皂苷的含量均呈顯著負(fù)相關(guān)。單就《中國(guó)藥典》規(guī)定的柴胡皂苷a+d含量而言，經(jīng)緯度、無霜期、年均溫對(duì)其影響相對(duì)較大。

表7 柴胡皂苷含量與生態(tài)因子相關(guān)性Tab.7 Correlation between saikosaponin contents and ecological factors

4 討論

藥用植物的生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)環(huán)境有著極大的依賴性，不同產(chǎn)地的同種中藥材，其藥效成分的含量可能有所不同，這種差異取決于不同區(qū)域的生態(tài)條件。劉照東等［8］報(bào)道了11個(gè)省市29個(gè)樣地柴胡中柴胡皂苷 a、c、d、e、f的含量均存在一定的差異性。光照和溫度是影響藥用植物生長(zhǎng)發(fā)育最重要的環(huán)境因子，光照對(duì)藥用植物生理生化都有重要的影響［9］。二年生西洋參中人參皂苷Rd、Rc和Rg1的含量會(huì)受到光照的影響［10］。馬繼良等［11］研究發(fā)現(xiàn)，曲靖煙葉總糖和總氮含量與產(chǎn)地緯度和海拔呈正相關(guān)，而與經(jīng)度呈負(fù)相關(guān)。呂欽楊［12］報(bào)道，廣西盾翅藤葉片中多糖、總氨基酸、總黃酮、總皂苷等的含量與產(chǎn)地海拔和年均降雨量成正相關(guān)，而與產(chǎn)地年均溫和無霜期成負(fù)相關(guān)。但曾平生等［13］報(bào)道，華重樓根狀莖中的總皂苷含量與產(chǎn)地海拔間呈高度負(fù)相關(guān)，皂苷Ⅶ與海拔呈中度負(fù)相關(guān)，而皂苷Ⅱ與年均溫、皂苷Ⅵ與7月均溫間均呈高度正相關(guān)，并且皂苷含量還與總酚酸和總黃酮含量具有一定的相關(guān)性。此外，陳千良［14］研究發(fā)現(xiàn)，“西陵知母”中知母皂苷AⅢ的含量與年均日照時(shí)數(shù)及7月均溫呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。

本文研究結(jié)果顯示，經(jīng)緯度、年均溫、無霜期是造成不同產(chǎn)地柴胡皂苷含量差異的主要生態(tài)因子，其中經(jīng)緯度與柴胡皂苷含量呈正相關(guān)，而年均溫、無霜期與柴胡皂苷含量呈負(fù)相關(guān)。與以往研究文獻(xiàn)相比，同一生態(tài)因子對(duì)代謝產(chǎn)物積累的影響既有相同的結(jié)果，也有不同的結(jié)果。不同藥用植物的代謝途徑不同，進(jìn)而產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物不同，而且不同產(chǎn)地之間的生態(tài)因子復(fù)雜多樣，各生態(tài)因子之間也會(huì)相互影響，如經(jīng)緯度、海拔會(huì)對(duì)溫度和光照產(chǎn)生影響，這些是導(dǎo)致同一生態(tài)因子對(duì)不同藥用植物代謝產(chǎn)物積累影響結(jié)果不同的可能原因。不同產(chǎn)地中藥材有效成分含量的差異性其實(shí)是在特定環(huán)境下多種生態(tài)因子綜合作用的結(jié)果，所以在研究生態(tài)因子對(duì)中藥材品質(zhì)的影響時(shí)，要選擇盡可能多的生態(tài)因子，同時(shí)還應(yīng)充分考慮物種、次生代謝產(chǎn)物的種類，這樣才能得出更加全面客觀、科學(xué)的結(jié)論。

本文初步研究了山西產(chǎn)柴胡皂苷含量與部分生態(tài)因子的相關(guān)性，研究結(jié)果可為山西產(chǎn)柴胡優(yōu)良品系篩選、生態(tài)區(qū)劃種植、品質(zhì)提升的深入研究提供一定的參考依據(jù)。