李欣燃， 方娜娜， 朱 淼， 翁貴英， 王緒英

（六盤水師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，貴州六盤水 553004）

MicroRNA（miRNA）是一類長度為20～24 nt的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA（崔玉等，2022），其前體一般含有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，對植物生長發(fā)育、新陳代謝、有機(jī)物合成、抗逆作用及細(xì)胞凋亡過程均起到非常重要的作用（葉靖等，2022；陳志輝等，2018）。miR399作為miRNA的重要家族成員，已在多個物種中被鑒定。該基因在磷轉(zhuǎn)運作用機(jī)制中的研究已相對透徹，其靶基因POH2（Phosphatase2）與miR399結(jié)合，導(dǎo)致POH2表達(dá)受到抑制，從而增強(qiáng)磷轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)，促進(jìn)植物中磷的積累，達(dá)到調(diào)節(jié)植物對磷吸收的目的（劉浩等，2019）。研究表明，miR399廣泛分布在被子植物中，且長度較穩(wěn)定，成員間進(jìn)化具有一定的保守性，但不同物種間miR399在數(shù)量分布和功能進(jìn)化等方面存在一定的差異（劉潮等，2019），其對靶基因的具體調(diào)節(jié)機(jī)制值得深入研究。

油菜（BrassicanapusL.）作為我國主要的油料作物，近年來年均種植面積已達(dá)667 hm2，以其生產(chǎn)的菜籽油占我國油料作物產(chǎn)油總量的55%以上（趙改會等，2022）。不僅如此，油菜也可作為人們餐桌上的食用蔬菜及畜牧業(yè)飼料蛋白來源（文雁成等，2022；鄔瑜錦等，2022）。因此，提升油菜的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要的經(jīng)濟(jì)價值和戰(zhàn)略意義。挖掘利用油菜自身的調(diào)節(jié)機(jī)制，選育優(yōu)良性狀已成為研究熱點，油菜miR399（Bna-miR399）家族成員眾多，且在油菜生長發(fā)育過程中可能發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。本研究通過生物信息學(xué)的方法對Bna-miR399進(jìn)行分析預(yù)測，以期更好地為油菜分子育種及性狀改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 利用PmiREN數(shù)據(jù)庫搜索BnamiR399家族成熟以及前體序列，并將獲得的全部成員下載備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 成熟序列堿基保守性分析 利用Multiple Sequence Alignment by CLUSTALW對BnamiR399的成熟序列進(jìn)行比對，并將比對結(jié)果用WebLogo繪制序列保守性Logo圖，以便于進(jìn)一步分析每個位點上堿基出現(xiàn)頻率和保守度。

1.2.2 前體序列二級結(jié)構(gòu)預(yù)測與系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析 利用RNAfold web server預(yù)測BnamiR399全部成員前體二級結(jié)構(gòu)，通過MEGA X計算Bna-miR399前體序列建樹最優(yōu)模型，并通過最大似然法（ML）構(gòu)建Bna-miR399成員的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.3 靶基因預(yù)測 利用WMD3和psRNATarget分別獲得Bna-miR399全部成員的靶基因預(yù)測信息，利用NCBI在線比對獲取基因注釋功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bna-miR399家族成熟序列分析 共獲得22個Bna-miR399家族成員，對其成熟序列保守性進(jìn)行分析（圖1），并將該結(jié)果繪制了序列保守性的直觀Logo對比圖（圖2）?？梢钥闯鯞namiR399的22條成熟序列中，除Bna-miR399 g和h含有20 nt，其余20個成熟序列均含有21 nt，序列間有17 nt重復(fù)位點，保守性較高，其中BnamiR399 c和e，Bna-miR399 d和f，Bna-miR399 a、b、k、o、p、q、m和l，Bna-miR399 i，Bna-miR399 g和h，Bna-miR399 j、n、r、s、t、u和v序列堿基分別完全相同。這22個成熟序列間位點輕微差異的產(chǎn)生可能是由于其處于油菜不同發(fā)育階段或組織導(dǎo)致的。

圖1 Bna-miR399家族成熟序列比對

圖2 Bna-miR399家族成熟序列保守性分析

2.2 Bna-miR399前體序列二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 通過對Bna-miR399家族22個前體序列二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測（圖3），結(jié)果顯示，Bna-miR399家族成員均可形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，且各前體的二級莖環(huán)結(jié)構(gòu)差異較大，莖環(huán)大小高度可變，表明其前體保守性較低。

圖3 Bna-miR399前體二級結(jié)構(gòu)

2.3 Bna-miR399前體序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析利用MEGA X對Bna-miR399家族成員前體序列對比分析，并構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖4），結(jié)果表明22個家族成員分為6個分支：Bna-miR a、b、d、f、l、o和q為第Ⅰ分支，Bna-miR c、e、k、m和p為第Ⅱ分支，Bna-miR i為第Ⅲ分支，Bna-miR g和h為第Ⅳ分支，Bna-miR n和r為第Ⅴ分支，Bna-miR j、s、t、u和v為第Ⅵ分支。從進(jìn)化樹角度看，成員Bna-miR i應(yīng)該產(chǎn)生較早，其前體序列和成熟序列也與其他成員差異最大，可以推出BnamiR i在油菜進(jìn)化過程中發(fā)生了較多的堿基替換或突變的現(xiàn)象（劉雪梅等，2021）。

圖4 Bna-miR399前體序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

2.4 Bna-miR399家族靶基因預(yù)測 利用WMD3、psRNATarget、NCBI分 別 預(yù) 測 BnamiR399家族22個成員靶基因及其功能（表1）。結(jié)果顯示，22個成員有多個共同的靶基因，如所有成員均可預(yù)測到TC186251，表明Bna-miR399成員間功能具有較高的保守性。通過對基因功能預(yù)測發(fā)現(xiàn)這些靶基因在油菜多種生命活動中發(fā)揮重要作用，表明該基因家族功能具有廣泛性的特點。

表1 Bna-miR399家族靶基因預(yù)測結(jié)果

3 討論與結(jié)論

植物基因調(diào)控與生長發(fā)育及脅迫應(yīng)答調(diào)控網(wǎng)絡(luò)間存在著密切聯(lián)系。油菜作為我國主要的油料和動物蛋白飼料來源，其與miR399之間的關(guān)聯(lián)與互作機(jī)制目前仍鮮見報道，但隨著生物信息技術(shù)的高速發(fā)展，使得探究油菜中miR399成員功能成為可能。

研究發(fā)現(xiàn)miR399僅分布于被子植物中，特別是雙子葉植物居多（劉潮等，2019）。該家族成員在植物中比較保守，目前已經(jīng)陸續(xù)在擬南芥、水稻、菜豆及苜蓿等多種植物中被發(fā)現(xiàn)，該基因家族成員受低磷誘導(dǎo)作用影響，可通過調(diào)節(jié)靶基因PHO2轉(zhuǎn)錄水平，促進(jìn)植物對磷的吸收，進(jìn)而緩解低磷脅迫對植物生長發(fā)育過程中的不良影響（陶平，2016）。通過檢索發(fā)現(xiàn)Bna-miR399共有22個成員，其成熟序列間具有較高的保守性，前體序列高度可變，其中Bna-miR i序列與其他成員差異最大，應(yīng)相對產(chǎn)生較早，可推斷Bna-miR i在油菜進(jìn)化過程中發(fā)生了較多的堿基替換或突變的現(xiàn)象，可見Bna-miR399成員間既高度保守，又存在一定的變化。通過對Bna-miR399成員靶基因及其功能分析發(fā)現(xiàn)，Bna-miR399所有成員均可預(yù)測到“可能的泛素結(jié)合酶E2 24”功能，說明Bna-miR399在DNA修復(fù)、光周期和維管分化調(diào)控及抗逆脅迫響應(yīng)等過程中發(fā)揮重要作用（王金利等，2010）；部分家族成員靶基因含有“線粒體磷酸鹽載體蛋白3”作用，可以將無機(jī)磷轉(zhuǎn)運至線粒體基質(zhì)上，促進(jìn)無機(jī)磷轉(zhuǎn)運，便于ADP轉(zhuǎn)化成ATP（衣冠帥，2016）；“無機(jī)磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白1-7”有利于植物將土壤中磷元素吸收、分配和再利用（付禹，2021）；“堿性/中性轉(zhuǎn)化酶A/C”與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)，在植物的生長周期、生物/非生物應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用（劉爽，2020）；“s-腺苷甲硫氨酸載體1”是植物體內(nèi)甲基供體的關(guān)鍵酶，可提升植物對逆境響應(yīng)的耐受作用（才曉溪等，2022）；“液泡加工酶α同工酶”可能與油菜的蛋白儲存和細(xì)胞凋亡密切相關(guān)（蘇雨等，2021）；“U-box結(jié)構(gòu)域的蛋白35”可能通過控

制油菜異常蛋白質(zhì)降解的方式參與其發(fā)育及病變的相關(guān)過程 （靳苗靜等，2007）。此外，BnamiR399家族基因還具有參與甘遂醇合成、氨基酸蛋白激酶等多種功能，進(jìn)而調(diào)控RNA合成及轉(zhuǎn)錄、代謝等過程（劉潮等，2019）。綜上，miR399家族在油菜磷轉(zhuǎn)運及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面發(fā)揮重要作用，間接調(diào)節(jié)植物體的生長發(fā)育、有機(jī)物合成、磷的吸收以及脅迫響應(yīng)等各個過程，對油菜多種代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控起著不可替代的作用。

通過對Bna-miR399基因家族生物信息學(xué)分析，可為油菜優(yōu)良品種選育奠定基礎(chǔ)，分析BnamiR399家族成員及靶基因作用特點對于解析該基因家族作用機(jī)制及其起源和進(jìn)化具有重要意義，同時為探明Bna-miR399基因調(diào)節(jié)機(jī)制提供理論依據(jù)。