肖 振，李盛華

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000

2.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

激素性股骨頭壞死（steroid induced osteonecrosis of femoral head，SONFH）是一種常見的進(jìn)行性骨病，80%的患者會(huì)在1～4年內(nèi)出現(xiàn)髖關(guān)節(jié)塌陷，最終需行人工關(guān)節(jié)置換，給社會(huì)家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)[1]。SONFH的發(fā)生是由于免疫相關(guān)疾病過度使用糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid，GC）造成。GC 誘導(dǎo)的骨內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可激活血栓形成并減少血管生成[2]。骨內(nèi)皮細(xì)胞包括骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞（bone microvascular endothelial cells，BMECs）和內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs），在維持血管穩(wěn)態(tài)以及股骨頭血供中起著重要的作用。由骨內(nèi)皮細(xì)胞受損引起的血管生成受損、細(xì)胞凋亡異常、血栓形成和脂肪栓塞被認(rèn)為是SONFH 的關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制[3-8]。研究發(fā)現(xiàn)，骨細(xì)胞不能在距離血管超過100 mm 處存活，所以學(xué)者們普遍認(rèn)為血管發(fā)育總是先于成骨[9]。多項(xiàng)研究表明，血管內(nèi)皮損傷與SONFH 密切相關(guān)，來自SONFH患者的BMECs 具有抑制遷移、血管生成受損和凋亡活性增加的特點(diǎn)[10-11]。另外，通過血管造影觀察血管化大轉(zhuǎn)子的骨移植治療股骨頭壞死能明顯改善股骨頭的血液灌注，并大幅改善患者髖關(guān)節(jié)活動(dòng)功能[12]。因此，改善骨內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)及功能是防控SONFH 發(fā)生和發(fā)展的重要調(diào)節(jié)因子。

血管生成是支持SONFH 修復(fù)的關(guān)鍵因素。研究發(fā)現(xiàn)使用普伐他汀和淫羊藿苷能促進(jìn)血管新生，預(yù)防SONFH 的發(fā)生[13-14]。銀杏葉提取物能增加SONFH 模型小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性，抑制甲強(qiáng)龍誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和功能喪失，逆轉(zhuǎn)激素對(duì)磷酸化磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphorylated phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，p-PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）和磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶（phosphorylated endothelial nitric oxide synthase，p-eNOS）表達(dá)水平的抑制，預(yù)防骨壞死[15]。本研究基于生物信息學(xué)分析篩選SONFH 中與血管生成相關(guān)的差異表達(dá)基因，進(jìn)一步通過基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，確定SONFH 發(fā)病機(jī)制，以及核心基因的表達(dá)、功能、相互作用及信號(hào)通路，并進(jìn)一步篩選靶向中藥活性成分，為靶向修復(fù)骨內(nèi)皮細(xì)胞和探索SONFH 的治療靶點(diǎn)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 SONFH 與血管新生相關(guān)的差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）的篩選

從GEO數(shù)據(jù)庫檢索“steroid induced osteonecrosis of the femoral head”或“SONFH”獲得GSE123568和GSE74089 數(shù)據(jù)集。GSE123568 包含10 個(gè)對(duì)照樣本和30 個(gè)SONFH 樣本，GSE74089 包含SONFH 和對(duì)照各4 個(gè)樣本。檢索Genecards 數(shù)據(jù)庫獲得SONFH靶基因2174 個(gè)。再通過檢索“endothelial cells”和“glucocorticoid”，獲得GSE25269 數(shù)據(jù)集，包含2 個(gè)對(duì)照組內(nèi)皮細(xì)胞樣本和2 個(gè)地塞米松干預(yù)的細(xì)胞樣本。使用Prel 語言處理數(shù)據(jù)集，R 軟件的svg 包對(duì)數(shù)據(jù)集去批次處理，通過limma 包限定P＜0.05 獲得DEGs，制做熱圖進(jìn)行可視化分析。

1.2 關(guān)鍵基因的篩選及GO 和KEGG 富集分析

將各數(shù)據(jù)集DEGs 導(dǎo)入venny2.1 軟件，獲得SONFH 中與血管新生相關(guān)的關(guān)鍵基因。進(jìn)一步使用David 軟件獲取GO 富集和KEGG 通路相關(guān)信息。

1.3 關(guān)鍵基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心基因的篩選

通過STING 平臺(tái)和Cytoscape 3.9.0 軟件，深入了解SONFH 中差異表達(dá)血管新生相關(guān)基因的內(nèi)在聯(lián)系。使用MCODE 插件對(duì)基因進(jìn)行聚類分析，使用CytoHubb 插件獲取核心基因。

1.4 鑒定與SONFH 相關(guān)的核心基因

為了驗(yàn)證核心基因篩選的可靠性，使用GSE123568 數(shù)據(jù)集鑒定選定的核心基因的表達(dá)水平。進(jìn)一步使用CTD 數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證核心基因與SONFH 之間的相互作用關(guān)系。

1.5 靶向核心基因的中藥活性成分篩選

CTD 數(shù)據(jù)庫是比較毒理基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫，采用CTD 數(shù)據(jù)庫搜索靶向作用于核心基因的中藥活性成分（限定interactions≥2）。

1.6 分子對(duì)接

在TCMSP 平臺(tái)、ZINC 數(shù)據(jù)庫搜索與核心基因作用指數(shù)最高的中藥活性成分的3D 結(jié)構(gòu)（mol2 格式），在PDB 數(shù)據(jù)庫中輸入核心基因Uniprot ID，下載相關(guān)靶蛋白的pdb 格式文件，經(jīng)PyMOL 去水加氫后，使用Autodock vina1.1.2 軟件進(jìn)行分子對(duì)接，再用PyMOL 軟件將結(jié)果可視化。

1.7 體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.7.1 細(xì)胞及試劑 人BMECs 購自ICELL（上海）生物技術(shù)股份有限公司，白藜蘆醇（resveratrol）、3-MA（PI3K 抑制劑）購自MCE 上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司，注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉（methylprednisolone sodium，MPS，輝瑞制藥有限公司），實(shí)驗(yàn)時(shí)將MPS 溶于ECM 培養(yǎng)基，3-MA 和白藜蘆醇分別溶于 DMSO，原液濃度均為 100 mmol/L，后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（endothelial cell medium，ECM）稀釋至合適濃度。0.1%胰蛋白酶-EDTA、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）、RIPA 裂解液（北京索萊寶科技有限公司）；蛋白酶和磷酸酶抑制劑（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；Matrigel基質(zhì)膠（BD Biosciences公司，美國）；Transwell 小室（24 孔培養(yǎng)板）、96 孔培養(yǎng)板（Corning 公司，美國）；血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）兔抗多克隆抗體（1∶1000）、PI3K 兔抗多克隆抗體（1∶1000）、Akt 兔抗多克隆抗體（1∶1000）、磷酸甘油醛脫氫酶（reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔抗多克隆抗體（1∶5000）；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記羊抗兔二抗（1∶5000）均為ImmunoWay 公司產(chǎn)品。

1.7.2 白藜蘆醇對(duì)MPS 干預(yù)后BMECs 增殖的影響使用ECM 培養(yǎng)制備BMECs 混懸液，細(xì)胞數(shù)2×105個(gè)/mL，加入96 孔板中，每孔100 μL，空白組不加細(xì)胞僅加100 μL ECM。過夜貼壁后，對(duì)照組加入ECM，處理組分別用終濃度25、50、75、100、200 μmol/L 白藜蘆醇＋20 μg/mL（終質(zhì)量濃度）MPS[16]處理24、42、72 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 避光孵育2 h。酶標(biāo)儀（BioRed，美國）檢測450 nm 處的吸光度（A），計(jì)算細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

細(xì)胞存活率＝(A處理－A空白)/(A對(duì)照－A空白)

1.7.3 白藜蘆醇對(duì)MPS 干預(yù)后BMECs 遷移的影響

（1）劃痕實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種于6孔板內(nèi)，分為6 組：對(duì)照組、模型（10 mg/mL MPS）組、3-MA 抑制劑（10 mg/mL MPS＋5 mmol/L[16]3-MA＋100 μmol/L 白藜蘆醇）組及白藜蘆醇低、中、高劑量（10 mg/mL MPS＋50、100、200 μmol/L白藜蘆醇）組。細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中饑餓8 h 后，用200 μL 移液管吸頭刮去內(nèi)皮細(xì)胞，洗滌未附著的細(xì)胞，每組給予相應(yīng)藥物，培養(yǎng)0、24 h 后拍照，計(jì)算劃痕愈合率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

劃痕愈合率＝(0 h 劃痕寬度－24 h 劃痕寬度)/0 h 劃痕寬度

（2）Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)：分組和給藥同劃痕實(shí)驗(yàn)，消化細(xì)胞并用PBS 洗滌3 次去除血清影響，用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，每孔加入200 μL 細(xì)胞懸液于Transwell 小室內(nèi)，24 孔板內(nèi)加入750 μL 含10% FBS 的ECM 培養(yǎng)基。每組給予相應(yīng)藥物，孵育24 h 后，Transwell 小室用甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色；隨后用棉簽去除每個(gè)小室內(nèi)部未遷移細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察。隨機(jī)取3 個(gè)視野計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞并取均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.7.4 蛋白質(zhì)印記分析 分組和給藥同劃痕實(shí)驗(yàn)，BMECs 給予相應(yīng)處理48 h 后，通過RIPA 裂解緩沖液（含蛋白酶和磷酸酶抑制劑1∶100）提取蛋白質(zhì)，紫外分光光度計(jì)測定蛋白濃度并稀釋濃度至10 mg/mL。加入5×上樣緩沖液混合均勻，在95 ℃下加熱5 min 導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。使用8% SDS-PAGE 分離膠分離40 μg 蛋白質(zhì)樣品，然后將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用10%脫脂牛奶封閉2 h，然后一抗在隨后的4 ℃下孵育過夜。之后，與其相應(yīng)的二抗進(jìn)行孵育。用電化學(xué)發(fā)光法觀察條帶。Image Lab 3.0 軟件用于量化條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 9.0.0 統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SONFH 與血管新生的DEGs 的確定

數(shù)據(jù)集和平臺(tái)信息見表1，通過GEO2R 獲得差異表達(dá)基因，以P＜0.05 為條件篩選DEGs，GSE123568 包含12 796 個(gè)，GSE74089 包含12 120個(gè)，Genecards 包括2354 個(gè)，其中GSE123568 和GSE74089 的數(shù)據(jù)經(jīng)Perl 語言處理合并及R 軟件（svg 包）矯正后，使用ggplot2 包將數(shù)據(jù)可視化，見圖1，SONFH 差異基因火山圖及熱圖見圖2。綜合各數(shù)據(jù)集共獲得SONFH 的DEGs 963 個(gè)，見圖3-A。同樣篩選GSE25269（P＜0.05）數(shù)據(jù)集獲得與血管生成相關(guān)的2373 個(gè)DEGs，前50 個(gè)DEGs 熱圖見圖3-B。

圖2 SONFH 的DEGs 火山圖和聚類熱圖Fig.2 Volcano map(A)and clustering heat map(B)of DEGs of SONFH

表1 數(shù)據(jù)集基本信息Table 1 Basic information of data set

圖1 GEO 數(shù)據(jù)矯正Fig.1 GEO data correction

2.2 關(guān)鍵基因的篩選

將SONFH 中與血管生成相關(guān)的基因定義為關(guān)鍵基因。將各數(shù)據(jù)集DEGs（P＜0.05）導(dǎo)入venny 2.1 軟件，獲得118 個(gè)SONFH 中與血管新生相關(guān)的DEGs（圖3-C）。其中74 個(gè)在SONFH 中表達(dá)上調(diào)，44 個(gè)在SONFH 中表達(dá)下調(diào)。

圖3 SONFH 和血管新生相關(guān)的DEGs 及關(guān)鍵基因的篩選Fig.3 SONFH and angiogenesis related DEGs and screening of key genes

2.3 關(guān)鍵基因GO 和KEGG 富集分析

使用DAVID 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行關(guān)鍵基因的GO 富集（圖4-A、B、D）和KEGG 通路富集分析，GO富集中生物過程主要涉及正調(diào)控血管生成、細(xì)胞黏附、炎癥、細(xì)胞增殖、遷移和傷口愈合等；細(xì)胞組分主要涉及細(xì)胞外間隙、細(xì)胞外基質(zhì)和胞外區(qū)；分子功能涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、血小板衍生生長因子和蛋白酶結(jié)合等。KEGG 主要富集到PI3K 信號(hào)通路、黏附斑信號(hào)通路、細(xì)胞外基質(zhì)受體互作通路和Ras 相關(guān)蛋白1（Ras-related protein 1，Rap1）信號(hào)通路等，關(guān)鍵基因與通路的桑基氣泡圖見圖4-C。

圖4 關(guān)鍵基因的GO 和KEGG 富集分析Fig.4 GO and KEGG enrichment analysis of key genes

2.4 關(guān)鍵基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（proteinprotein interaction network，PPI）及核心基因篩選

將DEGs 導(dǎo)入STRING 平臺(tái)，隱藏?zé)o連接的節(jié)點(diǎn)，獲得包含102 個(gè)節(jié)點(diǎn)和443 條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)，再導(dǎo)入Cytoscape，使用NetworkAnalyzer 工具計(jì)算節(jié)點(diǎn)屬性，節(jié)點(diǎn)大小對(duì)應(yīng)度（degree）大小，見圖5。再使用Cytoscape 的MCODE 插件尋找關(guān)鍵的子網(wǎng)絡(luò)6 個(gè)，見圖6-A～F，其主要子網(wǎng)絡(luò)（圖6-A）涉及vegf 激活的血小板衍生生長因子受體信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞增殖、一氧化氮介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)、冠狀血管形態(tài)發(fā)生和細(xì)胞黏附的正調(diào)節(jié)。

圖5 關(guān)鍵基因PPI 網(wǎng)絡(luò)(節(jié)點(diǎn)大小對(duì)應(yīng)度值大小)Fig.5 PPI network of key genes(node size correspondence degree value size)

通過Cytoscape 軟件中的CytoHubba 插件篩選關(guān)鍵基因中最大中心度（maximal clique centrality，MCC）評(píng)分前10 位的基因，定義為核心基因。通過篩選依次為血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGFA）、白蛋白（albumin，ALB）、胰島素（insulin，INS）、胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor 1，IGF1）、透明質(zhì)酸的受體（CD44）、整合素β-1（integrin beta-1，ITGB1）、Thy-1 膜糖蛋白（Thy-1 membrane glycoprotein，THY1）、血小板衍生生長因子受體β（platelet-derived growth factor receptor beta，PDGFRB）、受體型酪氨酸蛋白磷酸酶 C（receptor-type tyrosine-protein phosphatase C，PTPRC）和膠原蛋白α-1（collagen alpha-1(I)chain，COL1A1），見圖6-G。進(jìn)一步對(duì)核心基因富集通路分析，結(jié)果顯示通路主要富集到PI3K-Akt、黏附斑、Ras 和Rap1 信號(hào)通路等（圖7），與關(guān)鍵基因富集通路大致相同。

圖6 PPI 網(wǎng)絡(luò)基因簇模塊(A～F)與核心基因(G)Fig.6 Gene cluster module of PPI network(A—F)and core genes(G)

圖7 核心基因富集通路圖Fig.7 Enrichment pathway map of core genes

2.5 SONFH 血管新生相關(guān)的核心基因的篩選及鑒定

通過驗(yàn)證GSE123568 數(shù)據(jù)集鑒定選定的10 個(gè)核心基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)核心基因表達(dá)均差異明顯（P＜0.05，圖8-A），尤其PTPRC、CD44、IGF1和VEGFA的差異最為顯著，其中CD44、ITGB1和PTPRC表達(dá)上調(diào)，其余皆表達(dá)下調(diào)。進(jìn)一步受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）分析顯示PTPRC、CD44、IGF1、PDGFRB、ITGB1和VEGFA的曲線下面積（area under curve，AUC）值分別為0.897、0.837、0.777、0.770、0.767 和0.703（圖8-B）。

圖8 核心基因在SONFH 中的表達(dá)情況Fig.8 Expression of core genes in SONFH

再使用CTD 數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證核心基因與SONFH 之間的相互作用關(guān)系（圖9），結(jié)果發(fā)現(xiàn)COL1A1、IGF1、VEGFA和PTPRC與SONFH 作用指數(shù)較高，提示可能為干預(yù)修復(fù)SONFH 的重要靶點(diǎn)。

圖9 核心基因與SONFH 相互作用指數(shù)Fig.9 Interaction index of core genes and SONFH

2.6 靶向核心基因的中藥活性成分篩選

CTD 數(shù)據(jù)庫中靶向作用于核心基因的中藥活性成分（interactions≥2）見表2。結(jié)果顯示白藜蘆醇、姜黃素、雌二醇和槲皮素等與核心基因相互作用指數(shù)較高，提示這些活性成分可能是作用核心基因促進(jìn)血管新生修復(fù)SONFH 關(guān)鍵藥物成分。

表2 靶向作用核心基因的中藥活性成分Table 2 Active components of traditional Chinese medicine targeting core genes

2.7 分子對(duì)接

通過Autodock vina 軟件分子對(duì)接，顯示靶向核心基因的主要中藥活性成分白藜蘆醇與VEGFA、PTPRC、ITGB1、PDGFRB、IGF1和CD44結(jié)合能均小于-5 kcal/mol（1 kcal＝4.2 kJ），結(jié)合穩(wěn)定，結(jié)合能依次為-6.2、-6.1、-5.9、-5.6、-5.2 和-5.3 kcal/mol。白藜蘆醇與各蛋白形成氫鍵豐富，結(jié)構(gòu)構(gòu)象穩(wěn)定，如與VEGFA通過氨基酸殘基SER-9、GLY-42、GLY-41、LYS-103 形成4 個(gè)氫鍵；與PTPRC通過氨基酸殘基SER-828/SER-829、ARG-834、GLY-833、HIS-797、GLN-872 形成6 個(gè)氫鍵；與PDGFRB通過氨基酸殘基SER-40、SER-39、SER-77、ARG-19、ARG-37、PTR-1 形成6 個(gè)氫鍵；與ITGB1通過殘基ARG-309、THR-310、SER-233 形成3 個(gè)氫鍵；與IGF1通過氨基酸殘基GLY-19、GLN-15 形成2個(gè)氫鍵；與CD44通過氨基酸殘基SER-109、ILE-26、GLU-37 形成3 個(gè)氫鍵（圖10），結(jié)果提示白藜蘆醇有可能通過核心基因VEGFA、PTPRC、ITGB1、PDGFRB、IGF1 和CD44發(fā)揮修復(fù)SONFH 的作用。

圖10 白藜蘆醇與核心基因結(jié)合位點(diǎn)Fig.10 Sites of resveratrol binding to core gene

2.8 白藜蘆醇對(duì)MPS 干預(yù)后BMECs 的影響

2.8.1 對(duì)BMECs 增殖的影響 CCK8 檢測顯示，白藜蘆醇濃度為100 μmol/L 且作用48 h，能顯著改善MPS 對(duì)BMECs 活性的抑制，見圖11。

圖11 白藜蘆醇對(duì)MPS 干預(yù)后BMECs 活力的影響(n＝3)Fig.11 Effect of resveratrol on BMECs activity after MPS intervention(n = 3)

2.8.2 對(duì) BMECs 遷移的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖12）表明，基于劃痕愈合率和細(xì)胞遷移數(shù)量兩方面，模型組BMECs 的遷移顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），白藜蘆醇低、中、高劑量組BMECs 的遷移明顯高于模型組，白藜蘆醇中劑量組明顯高于3-MA 抑制劑組（P＜0.05）。

圖12 白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞遷移的影響(±s,n=3)Fig.12 Effects of resveratrol on cell migration(±s,n=3)

2.8.3 對(duì)細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響 Western blotting 檢測結(jié)果（圖13）顯示，與對(duì)照組比較，模型組PI3K/Akt/VEGF 通路蛋白表達(dá)降低，其中PI3K 表達(dá)水平降低顯著（P＜0.05）；與模型組比較，白藜蘆醇低、中、高劑量組中Akt、VEGF 蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高（P＜0.05），白藜蘆醇中、高劑量組PI3K 蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高（P＜0.05），而3-MA抑制劑組較白藜蘆醇中劑量組通路蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。

圖13 白藜蘆醇對(duì)MPS 誘導(dǎo)降低的BMEC 中PI3K/Akt/VEGF 信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響(±s,n=3)Fig.13 Effects of resveratrol on PI3K/Akt/VEGF signaling pathway protein expression in MPS induced BMECs(±s,n=3)

3 討論

SONFH 是難治性骨科疾病，主要由血液供應(yīng)中斷和凝血系統(tǒng)功能障礙引起，導(dǎo)致骨細(xì)胞死亡、股骨頭塌陷。GC 的使用抑制了血管生成、骨修復(fù)和一氧化氮的代謝，通過調(diào)節(jié)血管活性介質(zhì)如內(nèi)皮素-1、去甲腎上腺素和緩激肽來誘導(dǎo)骨內(nèi)股骨頭動(dòng)脈血管的收縮導(dǎo)致股骨頭缺血，以及增加骨內(nèi)壓引起缺血，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，減少流向股骨頭的血量[17-20]。骨內(nèi)皮細(xì)胞不僅可以形成微血管系統(tǒng)，為發(fā)育中的骨骼提供營養(yǎng)，還可以在體外和體內(nèi)增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，促進(jìn)骨修復(fù)。因此，尋找SONFH 中與血管生成相關(guān)的基因，在診斷和修復(fù)SONFH 方面具有重要作用。

本研究分析了公共數(shù)據(jù)庫中可用的微陣列數(shù)據(jù)集GSE123568、GSE74089、GSE25269 和Genecards數(shù)據(jù)庫，獲得SONFH 的DEGs 共963 個(gè)，血管生成相關(guān)DEGs 共2373 個(gè)，獲得SONFH 中與血管生成相關(guān)的關(guān)鍵基因118 個(gè)，其中74 個(gè)在SONFH 中表達(dá)上調(diào)，44 個(gè)在SONFH 中表達(dá)下調(diào)。這些基因主要富集于正調(diào)控血管生成、細(xì)胞黏附、炎癥、細(xì)胞增殖和遷移、傷口愈合等，大部分作用于細(xì)胞質(zhì)和核質(zhì)。有研究證實(shí)細(xì)胞因子IL-10 和TNF-α 與SONFH 的發(fā)生有關(guān)[21]。據(jù)報(bào)道，促紅細(xì)胞生成素通過刺激VEGF 的表達(dá)來促進(jìn)血管生成，以保護(hù)股骨頭免受GC 誘導(dǎo)的骨壞死的侵害[22-23]。細(xì)胞黏附相關(guān)蛋白R(shí)ap1 在SONFH 中下調(diào)，對(duì)股骨頭內(nèi)微血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附及遷移造成障礙，未能對(duì)受損血管內(nèi)皮及時(shí)修復(fù)，加速骨壞死進(jìn)程[24]。此外，KEGG 富集分析主要涉及PI3K-Akt 信號(hào)通路、黏著斑信號(hào)通路、細(xì)胞外基質(zhì)受體互作通路和Rap1 信號(hào)通路等。參與這些途徑的大多數(shù)基因都被上調(diào)了。PI3K-Akt是一個(gè)重要而復(fù)雜的信號(hào)通路，其在干細(xì)胞調(diào)節(jié)的細(xì)胞存活、增殖、遷移和血管生成中起著核心作用。激活PI3K-Akt 信號(hào)通路可顯著增強(qiáng)各種組織中內(nèi)皮細(xì)胞的功能[25]。黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）是一種非受體蛋白酪氨酸激酶和支架蛋白，可介導(dǎo)許多細(xì)胞功能，包括黏附、遷移和侵襲。FAK 抑制劑可減少滑膜成纖維細(xì)胞的侵襲和遷移，因此，抑制FAK 可能有助于改善在SONFH 發(fā)展中的骨髓水腫和滑膜炎[26]。黏著斑與細(xì)胞生長、形狀和運(yùn)動(dòng)有關(guān)。研究表明，黏著斑是股骨頭壞死后未成熟關(guān)節(jié)軟骨中顯著豐富的生物學(xué)途徑[27]。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)非創(chuàng)傷性股骨頭壞死可能與信號(hào)通路Rap1/PI3K/Akt 受到抑制導(dǎo)致其表達(dá)下降所引起的血管內(nèi)皮損傷有關(guān)[24]。細(xì)胞外基質(zhì)受體互作通路與血管生成、軟骨生成和軟骨退化有關(guān)[28]，且在股骨頭壞死的髖軟骨中顯著富集[29]。本研究結(jié)果提示PI3K-Akt 信號(hào)通路、黏著斑和Rap1 信號(hào)通路等參與了SONFH 的發(fā)病機(jī)制。

10 個(gè)核心基因是VEGFA、ALB、INS、IGF1、CD44、ITGB1、THY1、PDGFRB、PTPRC和COL1A1。這些核心基因都可能在SONFH 發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用。VEGFA基因位于染色體6p31.3[30]，是編碼血管內(nèi)皮生長因子的成員，與VEGF 受體在胞外結(jié)合，刺激細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，增加血管通透性。已有研究將VEGFA 啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的多個(gè)遺傳多態(tài)性與非創(chuàng)傷性SONFH 的疾病狀態(tài)聯(lián)系起來。VEGFA 是血管生成的關(guān)鍵介質(zhì)[31]，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞遷移，抑制細(xì)胞凋亡并誘導(dǎo)血管通透。使用VEGF受體拮抗劑可以在動(dòng)物模型中阻斷血管生成并誘導(dǎo)SONFH[32]。IGF1 調(diào)控細(xì)胞生長、分化，如刺激成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，促進(jìn)組織再生與修復(fù)。IGF1 可逆轉(zhuǎn)地塞米松對(duì)PI3K-Akt 信號(hào)通路的抑制，并抑制其下游叉頭框蛋白O1（forkhead box protein O1，F(xiàn)OXO1）的表達(dá)，進(jìn)而治療SONFH[33]。CD44 抗原是透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）的受體。通過其與HA 和其他配體（如骨橋蛋白、膠原蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶）的親和力來介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)的相互作用，其與HA 的結(jié)合在細(xì)胞遷移中起作用。PDGFRB 通過促進(jìn)周細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和募集，在血管發(fā)育中起至關(guān)重要的作用[34]。PTPRC 是抗原受體激活T 細(xì)胞所需的蛋白質(zhì)酪氨酸-蛋白質(zhì)磷酸酶。有研究發(fā)現(xiàn)微重力環(huán)境中的小鼠股骨頭出現(xiàn)了骨吸收，檢測髓腔分離的細(xì)胞顯示早期間充質(zhì)干細(xì)胞造血分化的基因 PTPRC 的表達(dá)顯著下調(diào)[35-36]。COL1A1 在SONFH 模型兔中的表達(dá)被抑制，使用葛根素后COL1A1 的表達(dá)升高，且SONFH 模型兔的成骨能力增加[37]。目前ALB、INS、CD44和THY1等核心基因在骨壞死中的作用機(jī)制尚不清楚，有待于進(jìn)一步研究。

通過GSE123568 數(shù)據(jù)集鑒定，發(fā)現(xiàn)核心基因尤其是PTPRC、CD44、IGF1和VEGFA的表達(dá)差異最為顯著。ROC 分析顯示PTPRC、CD44、IGF1、PDGFRB、ITGB1和VEGFA的AUC 值均大于0.7，具有較大可能性成為SONFH 潛在生物標(biāo)志物，Ma等[38]在1 項(xiàng)漢族人群VEGFA與SONFH 的遺傳關(guān)系的研究中，VEGFA單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）基因型rs2010963與SONFH 顯著相關(guān)。通過CTD 數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證核心基因與SONFH 之間的相互作用關(guān)系，發(fā)現(xiàn)COL1A1、IGF1、VEGFA和PTPRC與SONFH 作用指數(shù)較高，提示可能為干預(yù)修復(fù)SONFH 的重要靶點(diǎn)。目前已有通過VEGFA 防治SONFH 的研究，有研究發(fā)現(xiàn)促紅細(xì)胞生成素通過刺激VEGFA 的表達(dá)，可保護(hù)股骨頭免受GC 誘導(dǎo)的骨壞死的侵害[39]。CTD 數(shù)據(jù)庫篩選靶向核心基因的中藥活性成分，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇、姜黃素、雌二醇和槲皮素等與核心基因相互作用指數(shù)相對(duì)較高，為防治SONFH 提供了新的方向。

分子對(duì)接顯示白藜蘆醇與SONFH 中與血管新生有關(guān)的核心基因結(jié)合穩(wěn)定，并通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)白藜蘆醇能顯著上調(diào)本研究篩選的核心基因VEGFA及PI3K/Akt 信號(hào)通路的表達(dá)水平，表明白藜蘆醇對(duì)激素干預(yù)的BMECs的損傷具有修復(fù)作用，主要通過激活 PI3K/AKT/VEGF 信號(hào)通路提高BMECs 的活性并促進(jìn)細(xì)胞的遷移。也有研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以改善SOFNH 兔模型中的骨骼血液供應(yīng)，以保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞并減少血栓形成[40-41]。研究表明，姜黃素可通過抑制Janus 激酶1/2（Janus kinase 1/2，JAK1/2）-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）途徑抑制SONFH 模型小鼠細(xì)胞M1 極化來防止炎癥介導(dǎo)的骨細(xì)胞凋亡[42]，與本研究篩選結(jié)果一致，說明姜黃素有很大潛能成為臨床治療SONFH 藥物的新選擇。

4 結(jié)論

通過生物信息學(xué)分析鑒定了SONFH 血管新生相關(guān)的核心基因和通路，尤其是PTPRC、IGF1、VEGFA、ITGB1、PDGFRB和CD44核心基因和PI3K信號(hào)通路、黏附斑信號(hào)通路、細(xì)胞外基質(zhì)受體互作通路和Rap1 信號(hào)通路等，它們可能與SONFH 發(fā)病密切相關(guān)；篩選出白藜蘆醇最有可能成為預(yù)防或逆轉(zhuǎn)骨壞死的潛在藥物，并進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究有助于理解血管新生在SONFH 發(fā)病機(jī)制中的作用，為尋找具有SONFH 診斷或治療價(jià)值的生物標(biāo)志物的相關(guān)大樣本研究提供參考依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突