李偉慷，崔清卓#，鄭玉光，張一昕，郭炳顏，趙京山,2,*，劉 琳

1.河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河北省中藥炮制創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050020

2.河北中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050020

3.河北省中藥資源利用與質(zhì)量評(píng)價(jià)國(guó)際聯(lián)合研究中心，河北 石家莊 050020

4.河北醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河北 石家莊 050020

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是冠心病、卒中、心肌梗死等多種心血管疾病的主要原因，也是造成全球人口死亡最主要的病因。AS 表現(xiàn)為細(xì)胞和富含脂質(zhì)的斑塊沉積于內(nèi)膜下，浸潤(rùn)的白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞促進(jìn)血管炎癥、斑塊生長(zhǎng)和破裂，最終導(dǎo)致動(dòng)脈血栓形成，堵塞動(dòng)脈血管。因此，傳統(tǒng)理論認(rèn)為AS 源于內(nèi)皮損傷，是“由內(nèi)到外”的反應(yīng)過(guò)程。然而，支架置入或球囊血管成形術(shù)損傷內(nèi)皮后，在新生內(nèi)膜產(chǎn)生之前，血管外膜成纖維細(xì)胞（vascular adventitial fibroblasts，VAFs）早已開(kāi)始增殖并遷移到內(nèi)膜區(qū)域，分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白產(chǎn)生新生內(nèi)膜[1]。近一半的新生內(nèi)膜細(xì)胞來(lái)源于增殖的外膜成纖維細(xì)胞，表明動(dòng)脈外膜參與血管重構(gòu)反應(yīng)。因此，越來(lái)越多的研究證實(shí)，AS 的發(fā)生發(fā)展可能是“由外而內(nèi)”的過(guò)程[1]，構(gòu)成外膜的VAFs 發(fā)揮著重要作用。中醫(yī)對(duì)心血管疾病的研究在不斷深入，吳以嶺院士的脈絡(luò)學(xué)說(shuō)為心血管疾病的防治提供了理論依據(jù)，其核心理論為營(yíng)衛(wèi)承制調(diào)平。營(yíng)氣與血管內(nèi)膜，衛(wèi)氣與血管外膜具有相關(guān)性。營(yíng)行脈中，衛(wèi)行脈外，衛(wèi)外固護(hù)，阻邪于外，營(yíng)衛(wèi)調(diào)和，才能發(fā)揮血管舒縮功能；反之，“營(yíng)衛(wèi)不通，血凝不流?！毙难懿≡谥嗅t(yī)中歸屬“胸痹”的范疇，衛(wèi)氣失常是胸痹的始動(dòng)因素，衛(wèi)失固護(hù)，腠理疏松，痰瘀邪氣入脈，久而脈積[2]，這與近年來(lái)醫(yī)學(xué)對(duì)血管外膜的研究成果相一致。

炎癥是AS 及其相關(guān)的心血管疾病的主要驅(qū)動(dòng)因素，抑制炎癥能夠治療AS。白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）的單克隆抗體canakinumab可降低患者心血管事件復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)[3]。NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）炎癥小體由NLRP3、凋亡斑點(diǎn)樣蛋白（apoptotic spot-like protein，ASC）及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cystein-asparate protease-1，Caspase-1）組成，ASC可以通過(guò)與pro Caspase-1 結(jié)合激活Caspase-1，進(jìn)而促進(jìn)IL-1β、IL-18 及下游炎癥通路的激活[4]。Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）及核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）為NLRP3 炎性小體的上游分子。研究表明，TLR4/NF-κB/NLRP3 信號(hào)通路在心肌缺血/再灌注損傷及心肌損傷中發(fā)揮重要作用[5-6]。然而，TLR4/NF-κB/NLRP3 信號(hào)通路在血管重塑及AS 中對(duì)血管外膜的作用有待進(jìn)一步研究。

心血管疾病在中醫(yī)中統(tǒng)稱(chēng)為“胸痹”，常以活血化瘀藥治療。中醫(yī)認(rèn)為胸痹主要病位在心和血脈，血液濃稠、凝固，心脈瘀阻而“胸痹”，當(dāng)以活血化瘀、宣痹通脈。紅花是我國(guó)應(yīng)用廣泛的活血化瘀藥，紅花及其水提物常用于輔助治療冠心病、腦梗死、冠狀A(yù)S。羥基紅花黃色素A（hydroxylsafflower yellow A，HSYA）是紅花的主要活性成分，在心血管疾病中發(fā)揮重要保護(hù)作用[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，HSYA能夠通過(guò)AMP 依賴(lài)的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）/NF-κB/NLRP3 信號(hào)通路抑制支氣管炎，從而減輕小鼠的哮喘癥狀[9]，還可通過(guò)抑制NLRP3 炎癥小體激活保護(hù)心肌缺血/再灌注損傷[10]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，HSYA 能夠通過(guò)調(diào)控自噬抑制血管緊張素II（angiotensin II，ANG II）誘導(dǎo)的VAFs 遷移，改善血管重塑[11]。然而，HSYA在TLR4/NF-kB/NLRP3 信號(hào)通路中的作用目前尚未被研究。本研究主要探討HSYA 是否通過(guò)調(diào)控TLR4/NF-kB/NLRP3 信號(hào)通路抑制ANG II誘導(dǎo)的VAFs 遷移，為HSYA 改善血管重塑及治療AS 提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠，體質(zhì)量160～200 g，6 周齡，購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)IP08169。動(dòng)物飼養(yǎng)于河北中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房，遵循SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)條件，環(huán)境溫度穩(wěn)定為24 ℃，相對(duì)濕度為45%，通風(fēng)，12 h/12 h 光照/黑暗交替，自由飲食。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理原則，并經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)DWLL202203044）。

1.2 藥品與試劑

羥基紅花黃色素A（批號(hào)2021100361，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，批號(hào)2022060581）、血管緊張素II（批號(hào)2022031156）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；DMEM/F12 培養(yǎng)基（批號(hào)2022011271）購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，批號(hào)2021051623）購(gòu)自杭州四季青生物科技有限公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔抗大鼠抗體（批號(hào)2022061362）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）兔抗大鼠抗體（批號(hào)2022040511）、波形蛋白（Vimentin）兔抗大鼠抗體（批號(hào)CY5134）、NLRP3兔抗大鼠抗體（批號(hào)2022030316）、Caspase-1 兔抗大鼠抗體（批號(hào)202205187）、HRP 標(biāo)記的IgG 二抗（批號(hào)2022040315）、山羊抗兔488 熒光二抗（批號(hào)2022032619）、山羊抗兔 594 熒光二抗（批號(hào)2022050106）購(gòu)自上海泊灣生物科技有限公司；ASC兔抗大鼠抗體（批號(hào)2022020817）購(gòu)自美國(guó)Affinity Biosciences 公司；TLR4 抗體、NF-κB 抗體、p-NFκB 抗體、核質(zhì)蛋白提取試劑盒（批號(hào)2022180627）購(gòu)自上海泊灣生物科技有限公司；CCK-8 試劑盒（批號(hào)2022060721）購(gòu)自上海圣爾生物有限公司。

1.3 儀器

SW-CJ-2FD 型超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；311 型細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；VICTOR Nivo 型多功能微孔讀數(shù)儀（德國(guó)Perkln Elmer 公司）；ECLIPSE Ti2 型倒置相差顯微鏡、ECLIPSE TS2 型熒光顯微鏡（日本Nikon 公司）；5804 型高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；1645050 型電泳、電轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；Fusion FX5 Spectra 型多功能成像系統(tǒng)（法國(guó)Vilber 公司）。

2 方法

2.1 原代VAFs 培養(yǎng)

大鼠ip 25%烏拉坦（10 mL/kg）麻醉，固定，75%乙醇消毒，打開(kāi)胸腔，取出胸主動(dòng)脈。PBS 清洗主動(dòng)脈后，去除血管外膜周?chē)闹窘M織，縱切面剪開(kāi)血管，清洗管腔，去除血管內(nèi)皮細(xì)胞和中層平滑肌細(xì)胞，將剩余的血管外膜剪成小塊（1 mm2/塊），用含15%胎牛血清的完全培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

組織貼壁培養(yǎng)1 周后，用0.25%胰酶消化組織貼塊周?chē)募?xì)胞，待細(xì)胞由梭形變圓時(shí)，去除胰酶，并用培養(yǎng)基終止消化過(guò)程。收集細(xì)胞懸液，1000 r/min 離心10 min，棄上清，獲得P0 代VAFs。細(xì)胞按1∶3 傳至P3 代，獲得實(shí)驗(yàn)用VAFs。通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)鑒定VAFs。

2.2 ANG II 及HSYA 的量效、時(shí)效關(guān)系確定

將細(xì)胞按3000 個(gè)/孔接種于96 孔板，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，在無(wú)血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，然后添加100 μL 含不同濃度梯度的ANG II（0、1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9mol/L）或HSYA（0、5、10、20、40、80、160 μmol/L）的培養(yǎng)基刺激細(xì)胞，并設(shè)置對(duì)照組（無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基），細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，采用CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力。確定ANG II及HSYA 作用濃度后，將細(xì)胞接種于96 孔板，接種密度和培養(yǎng)條件相同。細(xì)胞饑餓刺激后，將ANG II或HSYA 的作用時(shí)間設(shè)置為0、12、24、48 h，并設(shè)置對(duì)照組，采用倒序給藥法對(duì)細(xì)胞給予ANG II或HSYA 刺激。最后一次給藥即為0 h，給藥結(jié)束后，CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力，平行測(cè)定6次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

2.3 CCK-8 法測(cè)定VAFs 活力

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96 孔板，待細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)時(shí)，用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，給予ANG II或HSYA 刺激，每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μL CCK-8 試劑，37 ℃孵育1 h 后，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 處的吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

2.4 Western blotting 檢測(cè)ANG II 誘導(dǎo)的VAFs 中TLR4 和NF-κB 蛋白表達(dá)

VAFs 以2×105個(gè)/孔接種于6 孔板，待細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后，設(shè)置對(duì)照組、ANG II組和HSYA（20、40、60 μmol/L）組，對(duì)照組給予培養(yǎng)基正常培養(yǎng)，其余各組給予1×10-7mol/L ANG II處理24 h 構(gòu)建ANG II誘導(dǎo)的VAFs 遷移模型。然后更換為含不同濃度HSYA 的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集各組細(xì)胞，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液，提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；加入二抗孵育后，利用化學(xué)發(fā)光法將蛋白印跡顯色。

2.5 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

VAFs 以1×104個(gè)/孔接種于放置無(wú)菌爬片的24孔板，培養(yǎng)48 h。設(shè)置對(duì)照組、ANG II組、HSYA 組、LPS 組和LPS＋HSYA 組，對(duì)照組給予培養(yǎng)基正常培養(yǎng)，其余各組給予1×10-7mol/L ANG II處理24 h 構(gòu)建ANG II誘導(dǎo)的VAFs 遷移模型。然后更換為含100 nmol/L LPS 或40 μmol/L HSYA 的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出爬片，使用0.25% Triton X 100 打孔，滴加37 ℃山羊血清封閉30 min，滴加兔抗鼠NLRP3、Vimentin、α-SMA、ACS 抗體（1∶200），37 ℃封閉1 h；滴加山羊抗兔594 熒光二抗，避光封閉30 min，滴加DAPI封片，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)

VAFs 以2×105個(gè)/孔接種于6 孔板，待細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，更換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h 后，用無(wú)菌槍頭在細(xì)胞上劃線，按“2.5”項(xiàng)下方法分組，LPS 提前3 h 預(yù)處理細(xì)胞，再加入相應(yīng)濃度的ANG II和HSYA。拍照記錄給藥0 h 細(xì)胞狀態(tài)，更換為含15%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，隨機(jī)選取3 個(gè)劃痕視野拍照記錄24 h 細(xì)胞狀態(tài)，計(jì)算細(xì)胞遷移率。

遷移率＝(0 h 劃痕寬度－24 h 劃痕寬度)/0 h 劃痕寬度

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpad Prism 5 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以±s表示，One-way ANOVA 用于多組比較分析，t檢驗(yàn)用于兩兩比較分析。

3 結(jié)果

3.1 原代VAFs 的形態(tài)及鑒定

VAFs 形態(tài)為梭形，大鼠胸主動(dòng)脈血管外膜組織貼塊爬出的細(xì)胞形態(tài)符合VAFs（圖1-A）。免疫熒光染色檢測(cè)VAFs 的標(biāo)志蛋白Vimentin 及血管平滑肌細(xì)胞的標(biāo)志蛋白α-SMA，如圖1-B所示，Vimentin呈陽(yáng)性表達(dá)，未見(jiàn)α-SMA 表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)VAFs培養(yǎng)成功。

圖1 VAFs 形態(tài)(A，×100)及α-SMA、Vimentin 蛋白表達(dá)(B，×400)Fig.1 Morphology(A,× 100),α-SMA and Vimentin protein expressions(B,× 400)of VAFs

3.2 ANG II 的劑量及作用時(shí)間確定

利用CCK-8 法檢測(cè)ANG II處理VAFs 后細(xì)胞活力的變化，確定ANG II的作用濃度和刺激時(shí)間。如圖2所示，1×10-7mol/L ANG II促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用最強(qiáng)（P＜0.01），因此，選用1×10-7mol/L 的ANG II進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。進(jìn)一步的作用時(shí)效結(jié)果顯示，ANG II的作用時(shí)效呈鐘形，即細(xì)胞活力隨著作用時(shí)間增加顯著增強(qiáng)，24 h 作用最強(qiáng)（P＜0.01），24 h 后隨時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞活力逐漸降低，因此后續(xù)ANG II作用時(shí)間選擇24 h。

圖2 ANG II 對(duì)VAFs 活力的量效(A)和時(shí)效(B)關(guān)系(±s,n = 6)Fig.2 Dose-effect(A)and time-dependent(B)of ANG Ⅱ on cell viability of VAFs(±s,n = 6)

3.3 HSYA 的劑量及作用時(shí)間確定

利用CCK-8 法檢測(cè)HSYA 處理VAFs 后細(xì)胞活力的變化，確定HSYA 的作用濃度和刺激時(shí)間，如圖3所示，HSYA 能夠顯著抑制VAFs 活力（P＜0.05、0.01），當(dāng)作用濃度達(dá)到40 μmol/L，細(xì)胞抑制率達(dá)到50%，當(dāng)作用濃度達(dá)到80 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)萎縮。因此，選用40 μmol/L 的HSYA 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。進(jìn)一步的作用時(shí)效結(jié)果顯示，隨著HSYA 作用時(shí)間延長(zhǎng)至24 h，細(xì)胞活力顯著下降（P＜0.01）；繼續(xù)延長(zhǎng)至48 h，細(xì)胞活力下降50%，但出現(xiàn)皺縮，因此后續(xù)HSYA 作用時(shí)間選擇24 h。

3.4 HSYA 抑制TLR4/NF-κB 信號(hào)通路

如圖4所示，與對(duì)照組比較，ANG II組TLR4蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.001），p-NF-κB 和核內(nèi)NF-κB 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05、0.001）；與ANG II組比較，HSYA 組TLR4 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01、0.001），HSYA（40、60 μmol/L）組p-NF-κB 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），HSYA 各劑量組核內(nèi)NF-κB 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05、0.01、0.001），表明HSYA 能夠抑制TLR4/NF-κB 信號(hào)通路，并且可以抑制NF-κB的磷酸化和入核。

圖4 HYSA 抑制ANG II 誘導(dǎo)的VAFs 中TLR4、NF-κB 和p-NF-κB 蛋白表達(dá)(±s,n = 4)Fig.4 HSYA inhibited the expression of TLR4,NF-κB and p-NF-κB protein expressions(±s,n = 4)

3.5 HSYA 抑制NLRP3 和ASC 共表達(dá)

如圖5所示，與對(duì)照組比較，ANG II組NLRP3和ASC 熒光強(qiáng)度增加，NLRP3 和ASC 共表達(dá)增加，提示ANG II促進(jìn)NLRP3 炎性小體激活和組裝。與ANG II組比較，HSYA 組NLRP3 和ASC 熒光強(qiáng)度減弱，NLRP3 和ASC 共表達(dá)減少，表明HSYA 能夠抑制NLRP3 炎性小體的組裝和激活。

圖5 HSYA 抑制NLRP3 和ASC 共表達(dá)(×400)Fig.5 HSYA inhibited the co-expression of NLRP3 and ASC(× 400)

3.6 HSYA 抑制ANG II 及LPS 誘導(dǎo)的VAFs 遷移

LPS 能夠激活TLR4/NF-κB 信號(hào)通路，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)HSYA 能夠抑制ANG II誘導(dǎo)的VAFs的遷移[11]。為了確定HSYA 抑制VAFs 的遷移作用與TLR4/NF-κB 有關(guān)，在ANG II誘導(dǎo)的VAFs 遷移模型上對(duì)細(xì)胞進(jìn)行LPS 刺激，通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移情況，如圖6所示，與對(duì)照組比較，ANG II組細(xì)胞遷移率顯著增加（P＜0.01）；與ANG II組比較，HSYA 組細(xì)胞遷移率顯著降低（P＜0.01），LPS組細(xì)胞細(xì)胞遷移率增加；與LPS 組比較，LPS＋HSYA 組細(xì)胞遷移率顯著降低（P＜0.01），表明HSYA 能夠逆轉(zhuǎn)LPS 對(duì)VAFs 遷移的促進(jìn)作用。

圖6 HSYA 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的VAFs 遷移的作用(×40，±s,n = 4)Fig.6 Effect of HSYA on LPS-induced VAFs migration(× 40,±s,n = 4)

3.7 HSYA 抑制LPS 誘導(dǎo)的VAFs 中NLRP3 和ASC 共表達(dá)

為了進(jìn)一步確定HSYA 可通過(guò)調(diào)控TLR4/NFκB 通路抑制NLRP3炎癥小體的激活，檢測(cè)LPS 刺激的VAFs 細(xì)胞中NLRP3 炎癥小體相關(guān)蛋白的共表達(dá)。如圖7所示，與對(duì)照組比較，ANG II組NLRP3和ASC 蛋白共表達(dá)增加；與ANG II組比較，HSYA組NLRP3 和ASC 蛋白共表達(dá)降低，LPS 組NLRP3和ASC 蛋白共表達(dá)增加；與LPS 組比較，LPS＋HSYA 組NLRP3 和ASC 蛋白共表達(dá)降低，HSYA逆轉(zhuǎn)了LPS 對(duì)VAFs 中Caspase-1 和ASC 的共表達(dá)，表明HSYA 靶向抑制NLRP3 炎性小體組裝。LPS 為T(mén)LR4/NF-κB 通路及NLRP3炎癥小體的激活的上游刺激物質(zhì)，能夠激活TLR4/NF-κB/NLRP3信號(hào)通路，HSYA 能夠抑制LPS 刺激的NLRP3炎癥小體的組裝及VAFs 的遷移。以上結(jié)果表明HSYA通過(guò)抑制TLR4/NF-κB/NLRP3 通路抑制LPS 誘導(dǎo)NLRP3 炎性小體激活。

圖7 HSYA 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的NLRP3 和ASC 共表達(dá)的作用(×40)Fig.7 Effect of HSYA on LPS-induced co-expression of NLRP3 and ASC(× 40)

4 討論

動(dòng)脈血管由以?xún)?nèi)皮細(xì)胞為主的內(nèi)膜、以血管平滑肌細(xì)胞為主的中膜以及富含膠原纖維的外膜組成。內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞已受到血管生物學(xué)家的廣泛關(guān)注，而構(gòu)成外膜的主要細(xì)胞類(lèi)型——外膜成纖維細(xì)胞在很大程度上被忽視。然而，越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，血管外膜在AS 和高血壓等血管疾病中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[12-13]。外膜作為血管壁的主要“損傷感知組織”，在內(nèi)膜發(fā)生改變之前，VAFs 早已對(duì)缺氧、血管膨脹、損傷及炎癥等環(huán)境壓力做出反應(yīng)，表現(xiàn)為VAFs 激活、增殖并遷移至內(nèi)膜和中膜，進(jìn)而導(dǎo)致血管重構(gòu)[14]。另外，遷移的VAFs能夠增加細(xì)胞因子的分泌，直接影響血管平滑肌細(xì)胞張力，促進(jìn)血管炎癥發(fā)生，從而影響整個(gè)血管張力和血管壁結(jié)構(gòu)[15-16]。因此，VAFs 能夠“由外而內(nèi)”調(diào)節(jié)血管的功能和結(jié)構(gòu)。抑制VAFs 的遷移，能夠改善血管纖維化、AS 及其相關(guān)的心血管疾病。

心血管疾病在中醫(yī)中屬“脈絡(luò)-系統(tǒng)性疾病”，從《絡(luò)病學(xué)》的“絡(luò)病證治”到《脈絡(luò)論》的“絡(luò)脈學(xué)說(shuō)”，其核心理論為營(yíng)衛(wèi)承制調(diào)平。衛(wèi)氣失常，衛(wèi)外不固，腠理疏松，痰濁瘀血邪氣易侵，久則脈積，易發(fā)中風(fēng)、胸痹等。脈積與西醫(yī)中AS 相關(guān)，是心血管疾病的發(fā)病基礎(chǔ)。血管外膜護(hù)衛(wèi)不利，外膜滋養(yǎng)血管增多，招募炎癥細(xì)胞[17]，促進(jìn)成纖維細(xì)胞活化，發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，向內(nèi)膜遷移，造成內(nèi)膜增生增厚[18]，導(dǎo)致血液瘀阻，從而促進(jìn)心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。中醫(yī)衛(wèi)營(yíng)調(diào)平與血管外內(nèi)膜穩(wěn)態(tài)具有相關(guān)性，固衛(wèi)外，消瘀堵，在疾病早期抑制血管外膜重構(gòu)或可成為潛在治療靶點(diǎn)。

持續(xù)的炎癥免疫反應(yīng)在動(dòng)脈硬化不穩(wěn)定斑塊的形成、發(fā)展和破裂過(guò)程中發(fā)揮重要作用。TLR4 是一種跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，能夠與LPS 結(jié)合，NF-κB 及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的各種炎性細(xì)胞因子，在AS 的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[19]。抑制TLR4/NF-κB 通路可減輕AS[20]。因此，TLR4/NF-κB 通路在LPS 感染中起重要作用。除TLR4/NF-κB 通路外，NLRP3炎癥小體的激活在AS 的發(fā)展過(guò)程發(fā)揮重要作用[21]。NLRP3可調(diào)節(jié)IL-1β 和IL-18 的生成，參與炎癥介導(dǎo)的斑塊的形成與發(fā)展[21]。因此TLR4、NF-κB、NLRP3 炎癥小體是AS 等炎癥性疾病的有前景的藥理靶點(diǎn)。

紅花是經(jīng)典的活血化瘀藥，常用于治療多種心腦血管疾病。HSYA 為紅花最主要的有效成分，在多種疾病中發(fā)揮重要作用[7-8]。研究表明，HSYA 可通過(guò)抑制炎癥減輕小鼠的哮喘癥狀[9]，HSYA 還可通過(guò)蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號(hào)通路抑制內(nèi)皮損傷及血管平滑肌細(xì)胞的遷移減輕AS[22-23]。然而，HSYA 能否通過(guò)抑制TLR4/NF-κB/NLRP3 通路抑制ANG II誘導(dǎo)的VAFs 的遷移，改善血管重構(gòu)，目前尚未被研究。本研究利用ANG II誘導(dǎo)VAFs的增殖和遷移，并給予細(xì)胞LPS 刺激，探究HSYA在LPS 誘導(dǎo)的TLR4/NF-κB/NLRP3 炎癥通路中的作用。通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)鑒定大鼠主動(dòng)脈組織貼塊法培養(yǎng)的細(xì)胞為VAFs。ANG II及HSYA 的量效、時(shí)效結(jié)果確定ANG II和HSYA 的最佳作用濃度分別為1×10-7mol/L 和40 μmol/L，作用時(shí)間均為24 h。Western blotting 結(jié)果顯示，ANG II刺激顯著增加VAFs 中TLR4 及NF-κB 的磷酸化水平，還能升高核內(nèi)NF-κB 含量；HSYA 能夠顯著抑制ANG II誘導(dǎo)的TLR4 及NF-κB 的磷酸化水平升高，抑制效果與作用濃度正相關(guān)。NLRP3 炎性小體的激活在血管重塑中發(fā)揮重要作用，為了明確HSYA 對(duì)ANG II誘導(dǎo)的VAFs 遷移的抑制作用與NLRP3 炎癥小體有關(guān)，檢測(cè)細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的組裝情況，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，ANG II組細(xì)胞中NLRP3和ASC 熒光重合后，熒光強(qiáng)度增加，提示ANG II促進(jìn)NLRP3 和ASC 的共表達(dá)，以上結(jié)果表明，ANG II促進(jìn)NLRP3 炎性小體組裝。與ANG II組比較，隨著HSYA 劑量增加，VAFs 中NLRP3 和ASC 的共表達(dá)逐漸降低，表明ANG II誘導(dǎo)的VAFs 中NLRP3炎性小體的激活被HSYA 顯著抑制。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HSYA 能夠顯著抑制ANG II及LPS 誘導(dǎo)的VAFs 遷移。LPS 為NLRP3 炎性小體的上游，能夠激活NLRP3 炎性小體[24]。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行LPS 刺激，檢測(cè)HSYA 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的NLRP3 炎性小體激活的作用。采用免疫熒光雙染實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)ASC 和NLRP3 蛋白，免疫熒光結(jié)果顯示LPS 誘導(dǎo)ASC 和NLRP3 共表達(dá)增加，提示LPS 促進(jìn)NLRP3 炎性小體的組裝，而HSYA 逆轉(zhuǎn)了這一作用，表明HSYA 通過(guò)抑制NLRP3 炎性小體的組裝和激活抑制ANG II誘導(dǎo)的VAFs 遷移。

無(wú)菌性炎癥在早期和晚期AS 的發(fā)展中起著重要作用[25]。TLR4 信號(hào)參與AS 的進(jìn)展[20]，NLRP3炎性小體激活pro Caspase-1 的切割，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的IL-1β 成熟與釋放，加劇血管重構(gòu)。VAFs 作為血管損傷響應(yīng)的前哨細(xì)胞，啟動(dòng)并參與AS 相關(guān)的血管重構(gòu)。因此，進(jìn)一步探究HSYA 對(duì)ANG II誘導(dǎo)的TLR4/NF-κB 通路及NLRP3 炎性小體組裝的影響。發(fā)現(xiàn)ANG II刺激能夠激活TLR4/NF-κB 通路，促進(jìn)NF-κB 的磷酸化與入核、NLRP3 炎性小體的組裝，從而激活TLR4/NF-κB/NLPR3 通路的炎癥反應(yīng)；HSYA 能夠抑制LPS 誘導(dǎo)的NLRP3 炎性小體組裝及VAFs 的遷移和增殖，進(jìn)而抑制血管重塑及其相關(guān)的心血管疾病。以上結(jié)果表明TLR4/NFκB/NLPR3 通路在VAFs 遷移和表型轉(zhuǎn)化中起重要作用，進(jìn)一步證實(shí)了HSYA 通過(guò)影響TLR4/NFκB/NLPR3 通路，抑制ANG II誘導(dǎo)的VAFs 遷移。

本研究發(fā)現(xiàn)，HSYA 能夠通過(guò) TLR4/NFκB/NLPR3 信號(hào)通路抑制ANG II誘導(dǎo)的VAFs 遷移。然而，HSYA 具有半衰期短、體內(nèi)消除速度、口服生物利用度較低的特點(diǎn)[26-27]。HSYA 在體內(nèi)是否能夠顯著改善ANG II誘導(dǎo)的血管重塑，需要進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。另外，HSYA 在臨床上常以血必凈注射液或丹紅注射液等復(fù)方制劑形式用藥。因此，在研究HSYA 調(diào)控VAFs 遷移相關(guān)的血管重塑的作用機(jī)制的基礎(chǔ)上，還應(yīng)結(jié)合HSYA 在體內(nèi)的代謝方式，選擇合適的藥用輔料，延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的半衰期，為其臨床治療血管重塑性疾病提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)依據(jù)。綜上，HSYA 通過(guò)抑制TLR4/NFκB/NLPR3 通路抑制ANG II誘導(dǎo)的VAFs 遷移，改善血管重塑。HSYA 可能是治療血管重塑性疾病的一個(gè)潛在的治療候選藥物。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突