張永康，孫成宏，王西雙，姚景春，張貴民*

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟南 250300

2.魯南制藥集團股份有限公司 中藥制藥共性技術(shù)國家重點實驗室，山東 臨沂 276006

3.魯南制藥集團股份有限公司 臨沂市天然藥物免疫藥理毒理重點實驗室，山東 臨沂 276006

自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）是一種以肝實質(zhì)損害為特征的炎癥性疾病，在亞太地區(qū)的發(fā)病率約為0.005%～0.025%，且呈逐年上升趨勢[1]，如果不及時治療，則會迅速發(fā)展為肝硬化和肝衰竭，嚴重危害人類健康。AIH 的發(fā)病原因較為復(fù)雜，臨床上多以糖皮質(zhì)類激素如地塞米松磷酸鈉注射液等進行治療，但極易引起機體諸多不良反應(yīng)[2]。因此，研究安全、有效和經(jīng)濟的治療藥物仍然是治療AIH 的臨床需要。荊防顆粒組方來源于明代張時徹《攝生眾妙方》中的荊防敗毒散，由荊芥、防風(fēng)、羌活、獨活、柴胡、前胡、川芎、枳殼、茯苓、桔梗、甘草11 味中藥組成，具有暢達氣機，扶助正氣，消除風(fēng)寒、濕熱、痰瘀、氣滯的作用，廣泛用于多種系統(tǒng)疾病的治療[3-4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，荊防顆粒具有良好的抗炎作用，可增強機體免疫力，保護肝臟的免疫功能[5-8]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為藥物研究的新模式，通過構(gòu)建成分-靶點-疾病等相互作用網(wǎng)絡(luò)，對中藥復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制研究提供新的方法[9-10]。本課題組前期研究表明，荊防顆粒對刀豆蛋白 A（concanavalin A，Con A）誘導(dǎo)的免疫性肝炎具有顯著的保護作用，但其作用機制尚不清楚。因此，本研究旨在從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度預(yù)測荊防顆粒治療AIH 的成分、靶點和信號通路，結(jié)合實驗驗證深入探究荊防顆粒對AIH 的治療作用及作用機制，為臨床上應(yīng)用荊防顆粒治療AIH 提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF 級雄性ICR 小鼠，體質(zhì)量（28±2）g，8 周齡，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號SCXK（京）2021-0006，使用許可證號SYXK（魯）-20180008。動物飼養(yǎng)于室溫（23±2）℃、相對濕度40%～70%的環(huán)境中，12 h 光暗循環(huán)，自由進食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后進行實驗。動物實驗經(jīng)魯南制藥集團股份有限公司實驗動物倫理委員會批準（批準號HN-IACUC-2022-097）。

1.2 藥品與試劑

荊防顆粒（國藥準字 Z37020357，批號8022009004）由山東新時代藥業(yè)有限公司提供；地塞米松磷酸鈉注射液（批號2202160612）由山東辰欣藥業(yè)股份有限公司提供；Con A（批號C2010）購自美國Sigma Aldrich 公司；小鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測試劑盒（批號H052-1）購自南京建成生物工程研究所；小鼠白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）檢測試劑盒（批號ml063132-2）、小鼠IL-6 檢測試劑盒（批號ml1002293-2）、小鼠IL-8/CXC 型趨化因子配體8（CXC chemokine ligand 8，CXCL8）檢測試劑盒（批號ml58632）購自Mlbio 公司；磷酸化核因子-κB p65（phosphorylated nuclear factorκB p65，p-NF-κB p65）抗體（批號80477）、NF-κB p65抗體（批號8242）、NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）抗體（批號13158）、抗體分泌細胞（antibody-secreting cell，ASC）抗體（批號67824）、剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cleaved cysteinasparate protease-1，Caspase-1）抗體（批號89332）、IL-1β 抗體（批號27989）、B 淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體（批號3498）、Bcl-2 相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體（批號5023）、Janus 激酶2（Janus kinase 2，JAK2）抗體（批號3230）、磷酸化JAK2（phosphorylated JAK2，p-JAK2）抗體（批號3771）、信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）抗體（批號9139）、磷酸化STAT3（phosphorylated STAT3，p-STAT3）抗體（批號9145）；購自美國CST 公司；β-actin 抗體（批號AF0003）購自Beyotime；IL-6 抗體（批號ab233706）、TNF-α 抗體（批號ab183218）、HRP 標記的山羊抗兔二抗（批號ab6721）、HRP 標記的兔抗鼠二抗（批號ab6728）購自英國Abcam 公司。

1.3 儀器

冷凍離心機（美國Sigma 公司）；Pannoramic SCAN 圖像掃描及分析系統(tǒng)（匈牙利3D HISTECH公司）；Tissue-Tec?VIPTM5 Jr 型全封閉組織脫水機、Tissue-Tec?TECTM5 組織包埋機（日本櫻花檢驗儀器株式會社）；RM2235 型輪轉(zhuǎn)式病理切片機、HI1210 型組織攤片機、ST5020 型自動染色機（德國Leica 公司）；BX53 型生物顯微鏡（日本Olympus公司）；ELX-800 型酶標儀（美國Bio Tek 公司）；BS-800 型全自動生化分析儀（深圳市邁瑞生物醫(yī)學(xué)電子有限公司）；DYY-7C 型電泳儀、DYCZ-40D 型轉(zhuǎn)移槽（北京六一生物科技有限公司）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.1.1 荊防顆粒靶點的收集 從《中國藥典》2020年版中查詢荊防顆粒11 味中藥的性味與歸經(jīng)，借助TCMSP 數(shù)據(jù)庫分別以荊芥、防風(fēng)、羌活、獨活、柴胡、前胡、川芎、枳殼、茯苓、桔梗、甘草為關(guān)鍵詞搜索各中藥的化學(xué)成分。以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 為篩選標準，獲得荊防顆粒的活性成分及其預(yù)測靶點。將收集到的所有靶點輸入UnitProt數(shù)據(jù)庫進行標準化轉(zhuǎn)換，以獲取目標基因名稱。同時，將目標基因?qū)隒ytoscape 3.7.0 軟件，通過度值確定荊防顆粒的關(guān)鍵活性成分。

2.1.2 AIH 的疾病靶點檢索 使用Omim 數(shù)據(jù)庫（https://www.omim.org/）、 Drugbank 數(shù)據(jù)庫（https://go.drugbank.com/）和 GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/），輸入關(guān)鍵詞“autoimmune hepatitis”篩選疾病目標，將3 個數(shù)據(jù)庫中符合疾病的基因結(jié)果匯總后去重，篩選得到最終AIH 的相關(guān)靶點基因。

2.1.3 荊防顆粒和AIH 交集靶點基因的收集以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用Venn 圖（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）將荊防顆粒成分靶點與AIH 相關(guān)靶點取交集以獲得荊防顆粒治療AIH的關(guān)鍵靶點。將獲得的關(guān)鍵靶點導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫（http://www.string-db.org）獲取PPI網(wǎng)絡(luò)。同時，將PPI網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入Cytoscape 軟件并可視化，利用CytoHubba 插件進行拓撲分析，默認設(shè)置顯示前10名的蛋白節(jié)點，將度值和最大鄰居組件（maximum neighborhood component，MNC）前10 位的靶點作為核心靶點。

2.1.4 基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 將獲得的荊防顆粒治療AIH 的關(guān)鍵靶點上傳Metascape 數(shù)據(jù)庫（http://metascape.org），進行KEGG 通路和GO 功能富集分析。將校正P值≤0.01 的項目進行篩選，根據(jù)富集基因的校正P值來排序，選取排名在前的相關(guān)信號通路，然后通過生物信息學(xué)云平臺（http://www.bioinformatics.com.cn/）可視化上述分析并生成氣泡圖。最后，通過Cytoscape 軟件建立活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

2.2 實驗驗證

2.2.1 AIH 小鼠模型的建立 ICR 小鼠隨機分為對照組、模型組及荊防顆粒低、中、高劑量（2、4、8 g/kg）組和地塞米松（0.8 mg/kg）組，每組10 只。除對照組外，其余各組iv 10 mg/kg Con A 建立AIH模型。模型建立后1 h，荊防顆粒各劑量組ig 相應(yīng)藥物，地塞米松組ip 地塞米松磷酸鈉注射液，對照組和模型組ig 等體積純凈水，記錄造模24 h 后各組小鼠死亡率。小鼠ip 1%戊巴比妥溶液麻醉后，隨機采集血清和肝組織樣本。

2.2.2 肝功能和血液生化分析 將各組小鼠血液于4 ℃、3500 r/min 離心10 min，立即吸取上清液，用全自動生化分析儀檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）活性。

2.2.3 肝組織病理學(xué)分析 取各組小鼠肝臟組織，甲醛固定后，經(jīng)梯度乙醇脫水并制作石蠟切片，用自動染色機對組織（5 μm）進行蘇木素-伊紅（HE）染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肝臟病理學(xué)的差異。根據(jù)肝臟Knodell 評分系統(tǒng)[11]評價炎性細胞浸潤和壞死程度：0 分，無炎性細胞滲透和壞死；1分，輕度炎性細胞浸潤和壞死；2 分，中度炎性細胞浸潤和壞死；3 分，嚴重炎性細胞浸潤和壞死。

2.2.4 肝組織炎性因子水平檢測 取各組小鼠肝組織，在PBS 溶液中勻漿后4 ℃、12 000×g離心10 min，取上清液，按ELISA 試劑盒說明書測定IL-6、TNF-α、IL-1β 和CXCL8 的含量。

2.2.5 Western blotting 檢測肝組織p-NF-κB p65、NF-κB p65、NLRP3、ASC、cleaved Caspase-1、IL-1β、Bcl-2、Bax、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、IL-6和TNF-α 蛋白表達 取各組小鼠肝臟組織，加入含有磷酸酶抑制劑和PMSF 的RIPA 裂解液，提取總蛋白，按照BCA 試劑盒測定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h 后，加入相應(yīng)抗體，4 ℃孵育過夜；PBST 洗滌3 次，加入二抗，室溫孵育2 h；PBST 洗滌3 次，加入ECL 發(fā)光試劑顯影，采用凝膠成像系統(tǒng)成像，并使用Image J軟件分析條帶灰度值。

2.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗數(shù)據(jù)通過GraphPad Prism 8.0.2 軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以±s表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 荊防顆?；钚猿煞峙c靶點的篩選

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索荊防顆粒中的11 味藥中所有的潛在靶點，以同時滿足OB≥30%和DL≥0.18 為篩選條件，再通過UniProt 數(shù)據(jù)庫更正和刪除重復(fù)項目后，共鑒定出269 個與荊防顆粒相關(guān)的非重復(fù)性靶點和159 個活性成分。將信息導(dǎo)入Cytoscape 軟件分析荊防顆?！爸兴?成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，度值排名前10 位的活性成分見表1。

表1 荊防顆?；钚猿煞?前10)Table 1 Active ingredients of Jingfang Granules(top 10)

3.2 荊防顆粒治療AIH 的關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過Genecard、OMIM 和Drugbank 數(shù)據(jù)庫共獲得761 個AIH 疾病相關(guān)靶點，匯總?cè)ブ睾?，共獲得343 個非重復(fù)性靶點。將269 個荊防顆粒靶基因與343 個潛在AIH 相關(guān)靶基因取交集，共獲得25個交集靶點（圖1-A），為荊防顆粒治療AIH 的潛在靶點。應(yīng)用Cytoscape 軟件對荊防顆粒治療AIH的25 個潛在靶點構(gòu)建成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)，見圖1-B。將潛在靶點導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫得到PPI網(wǎng)絡(luò)，進一步分析獲得其核心網(wǎng)絡(luò)，并通過Cytoscape 軟件可視化，見圖1-C。拓撲分析前10 名的核心網(wǎng)絡(luò)靶點包括IL-6、TNF-α、IL-1β、STAT3、CXCL8、IL-10、γ 干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、IL-4、Caspase-8（CASP8）和C 反應(yīng)蛋白（C-reaction protein，CRP）。

圖1 荊防顆粒治療AIH 的核心靶點和PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Core target and PPI network of Jingfang Granules in treating AIH

3.3 GO 功能和KEGG 通路富集分析

GO 功能富集分析主要包括生物過程（biological process，BP）、細胞成分（cell component，CC）和分子功能（molecular function，MF）。將25個潛在治療靶點導(dǎo)入Metascape 數(shù)據(jù)庫后，得到GO條目689 個（P＜0.01），生成了BP、MF、CC 和KEGG 富集分析結(jié)果。其中BP 條目共646 個，主要涉及細胞因子的產(chǎn)生、炎癥反應(yīng)、凋亡信號通路和免疫過程；MF 條目34 個，主要參與細胞因子受體結(jié)合，包括腫瘤壞死因子受體結(jié)合；CC 條目9 個，主要涉及質(zhì)膜和囊泡（圖2）。KEGG 通路富集分析篩選得到93 條通路（P＜0.01），結(jié)果表明，荊防顆粒可能通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、細胞因子、肝細胞壞死等信號通路治療AIH（圖3）。

圖2 荊防顆粒治療AIH 靶點的GO 功能富集分析Fig.2 GO function enrichment analysis of targets of Jingfang Granules in treating AIH

圖3 荊防顆粒治療AIH 靶點的KEGG 通路富集分析Fig.3 KEGG pathway enrichment analysis of targets of Jingfang Granules in treating AIH

3.4 荊防顆粒對AIH 模型小鼠的保護作用

通過建立Con A 誘導(dǎo)的AIH 小鼠模型，驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的結(jié)果。如圖4-A所示，模型組小鼠死亡率遠高于對照組，而各給藥組小鼠死亡率均低于模型組，且荊防顆粒中、高劑量組小鼠死亡率低于地塞米松組。如圖4-B、C所示，與對照組比較，模型組小鼠血清中ALT 和AST 活性均顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，荊防顆粒中、高劑量組和地塞米松組血清中ALT 和AST 活性均顯著降低（P＜0.05、0.01）。如圖4-D所示，模型組小鼠肝組織出現(xiàn)明顯的門脈炎癥，中央靜脈周圍出現(xiàn)嚴重的竇性充血以及點狀或斑片狀壞死；給予荊防顆?；虻厝姿闪姿徕c注射液治療后，小鼠肝臟中的炎癥細胞浸潤和細胞壞死受到顯著抑制（P＜0.05、0.01）。以上結(jié)果表明，荊防顆?？梢詼p輕Con A 誘導(dǎo)的AIH 小鼠的肝損傷，且藥效優(yōu)于地塞米松磷酸鈉注射液。

圖4 荊防顆粒對AIH 小鼠的保護作用(±s,n = 10)Fig.4 Protective effect of Jingfang Granules on AIH mice(±s,n = 10)

3.5 荊防顆粒對AIH 小鼠肝組織炎癥因子水平的影響

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果和KEGG 通路富集分析表明，大多數(shù)確定的關(guān)鍵靶點在炎癥細胞因子的相互作用中富集。通過ELISA 試劑盒檢測肝組織中相關(guān)炎癥因子水平，如圖5所示，與對照組比較，模型組小鼠肝組織中TNF-α、IL-1β、IL-6 和CXCL8 水平均顯著升高（P＜0.05、0.01）；與模型組比較，荊防顆粒高劑量組TNF-α 水平顯著降低（P＜0.05），荊防顆粒中、高劑量組和地塞米松組IL-1β 水平顯著降低（P＜0.05），荊防顆粒高劑量組和地塞米松組IL-6水平顯著降低（P＜0.05），荊防顆粒中、高劑量組CXCL8 水平顯著降低（P＜0.05），表明荊防顆粒對Con A 誘導(dǎo)的AIH 小鼠具有顯著的抗炎作用?；谏鲜鼋Y(jié)果，選擇荊防顆粒高劑量（8 g/kg）組作為代表組，探討荊防顆粒治療AIH 的作用機制。

圖5 荊防顆粒對AIH 小鼠的抗炎作用(±s,n = 6)Fig.5 Anti-inflammatory effect of Jingfang Granules on AIH mice(±s,n = 6)

3.6 荊防顆粒對AIH 小鼠肝組織IL-6/STAT3 信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

如圖6所示，與對照組比較，模型組小鼠肝組織中IL-6、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 和Bax蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05、0.01），Bcl-2蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，荊防顆粒高劑量組小鼠肝組織中 IL-6、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 和Bax 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05、0.01），Bcl-2 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）。

圖6 荊防顆粒對AIH 小鼠肝組織IL-6/STAT3 信號通路相關(guān)蛋白表達的影響(±s,n = 3)Fig.6 Effect of Jingfang Granules on IL-6/STAT3 signal pathway related protein expressions in liver of AIH mice(±s,n = 3)

3.7 荊防顆粒對AIH 小鼠肝組織NLRP3/IL-1β 信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

如圖7所示，與對照組比較，模型組小鼠肝組織中NLRP3、ASC、cleaved Caspase-1 和下游IL-1β蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05、0.01），表明模型組小鼠具有明顯的炎癥反應(yīng)；與模型組比較，荊防顆粒高劑量組NLRP3、ASC、cleaved Caspase-1和下游IL-1β 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）。

圖7 荊防顆粒對AIH 小鼠肝組織NLRP3/IL-1β 信號通路相關(guān)蛋白表達的影響(±s,n = 3)Fig.7 Effect of Jingfang Granules on NLRP3/IL-1β signal pathway related protein expressions in liver of AIH mice(±s,n = 3)

3.8 荊防顆粒對AIH 小鼠肝組織TNF-α/NF-κB 信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

如圖8所示，與對照組比較，模型組小鼠肝組織中TNF-α 和p-NF-κB p65/NF-κB p65 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，荊防顆粒高劑量組TNF-α 和p-NF-κB p65/NF-κB p65 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05、0.01），表明荊防顆粒能夠抑制TNF-α/NF-κB 信號通路相關(guān)蛋白的磷酸化水平。

圖8 荊防顆粒對AIH 小鼠肝組織TNF-α/NF-κB 信號通路相關(guān)蛋白表達的影響(±s,n = 3)Fig.8 Effect of Jingfang Granules on TNF-α/NF-κB signal pathway related protein expressions in liver of AIH mice(±s,n = 3)

4 討論

AIH 是一種典型的自身免疫性疾病，發(fā)生于任何年齡和種族[12-13]。幾十年來對治療AIH 藥物的研究表明，單一靶點藥物難以解決所有問題[14]。近年來，中醫(yī)藥治療AIH 因其藥理作用明顯、不良反應(yīng)少而受到越來越多的關(guān)注[15]。荊防顆粒具有改善能量代謝循環(huán)、解表驅(qū)汗、抗炎等作用[3-5,8,16]。研究表明，荊防顆粒通過降低促炎因子表達、抗氧化、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）/Smad4 信號通路對CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化有明顯的治療作用[17]。此外，荊防顆粒還可以通過激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路發(fā)揮解酒保肝作用[18]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)綜合了中藥有效成分、相應(yīng)靶點和相應(yīng)疾病3 個方面，并將其作為3 種不同類型的節(jié)點，形成“成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)，揭示了中藥治療相關(guān)疾病的有效成分和作用機制[9]。李志杰等[19]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究了苦黃顆粒治療AIH 的活性成分和作用機制。郝建亨等[20]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)探究了丹參酮IIA治療AIH 的潛在靶點與通路之間的關(guān)系。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實驗驗證探究荊防顆粒治療AIH 的作用機制，確定了槲皮素是荊防顆粒最重要的活性成分，其次是木犀草素、β-谷甾醇、山柰酚和漢黃芩素等。通過Venn 圖確定荊防顆粒與AIH 疾病相關(guān)的25 個中心靶點。成分-靶點網(wǎng)絡(luò)表明，荊防顆粒在AIH 治療中作用于多個靶點并產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。GO 功能和KEGG 通路分析表明，大多數(shù)靶點在炎癥和凋亡過程中富集。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析未提供特定的信號通路靶點，但本研究從荊防顆粒治療AIH 相關(guān)的交叉靶點中發(fā)現(xiàn)了炎癥和凋亡通路。PPI網(wǎng)絡(luò)顯示IL-6、TNF-α、IL-1β、STAT3 和CXCL8 是5 個度值最大的靶點，這些靶點都表明了荊防顆粒對AIH 的抗炎和抗凋亡特性，實際可能存在涉及更有效成分和作用機制的暗示。

Con A 誘導(dǎo)的AIH 模型是一種具有代表性的、易于構(gòu)建的AIH 模擬模型，也是一種急性肝損傷模型，可導(dǎo)致高死亡率[21]。此外，Con A 誘導(dǎo)的AIH模型的典型特征為炎癥細胞因子的分泌，ALT 和AST 活性升高，肝細胞凋亡和壞死異常[22]。本研究結(jié)果表明，荊防顆粒能顯著降低Con A 誘導(dǎo)的AIH模型小鼠的死亡率、肝組織炎癥和細胞凋亡，并能抑制AIH 小鼠血清ALT 和AST 的活性。

異常的IL-6/STAT3 信號通路在AIH 的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，抑制IL-6/SATA3 信號通路可以減輕Con A 誘導(dǎo)的肝損傷[23]。在自身免疫炎癥性疾病模型中，分泌的IL-6 通過gp130 與受體結(jié)合，激活JAK2 并觸發(fā)STAT3 通路，調(diào)節(jié)肝細胞凋亡[24]。Bcl-2 表達提高有利于增強細胞的抗凋亡功能，而Bax 的增加則促進細胞凋亡。Bax/Bcl-2 值通常用來表示細胞凋亡水平[25-26]。李翔子等[27]研究結(jié)果證實，荊防顆?？梢酝ㄟ^抑制JAK2/STAT3 通路調(diào)節(jié)T 淋巴細胞亞群的平衡，在蕁麻疹動物模型中發(fā)揮抗炎作用，從而保護小鼠免受自身免疫性疾病。曹天佑等[28]研究證實，荊防顆粒可顯著抑制由炎癥導(dǎo)致的細胞凋亡。IL-1β 在多種自身炎癥性疾病中發(fā)揮重要的作用，IL-1β 能夠通過支持T 細胞存活、上調(diào)淋巴細胞上的IL-2 受體、促進B 細胞增殖和Th17 細胞分化來介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[29]。NLRP3 是先天免疫的重要組成部分，由NLRP3、ASC 和Caspase-1組成，用于誘導(dǎo)IL-1β 的釋放，在AIH 肝臟炎癥中起關(guān)鍵作用[30]。此外，IL-1β 能與IL-6 和TNF-α 產(chǎn)生協(xié)同作用，參與炎癥細胞的釋放和炎癥通路的激活。TNF-α 是一種炎癥細胞因子，可以激活固有免疫途徑并觸發(fā)炎癥反應(yīng)[31]。TNF-α 通過介導(dǎo)NF-κB的激活來刺激細胞因子的產(chǎn)生，并增強AIH 的炎癥反應(yīng)[32]。NF-κB 是一種主要轉(zhuǎn)錄因子，介導(dǎo)Con A誘導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)，并參與TNF-α 誘導(dǎo)的不同類型細胞中炎癥蛋白的表達[33]。El-Agamy 等[34]闡明了NF-κB 在Con A 誘導(dǎo)的AIH 發(fā)病機制中的作用，Con A 刺激NF-κB 的磷酸化并啟動和調(diào)節(jié)炎癥過程，促進炎癥細胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1β 和IFN-γ 的產(chǎn)生。本研究結(jié)果表明，荊防顆粒顯著抑制了AIH模型小鼠肝組織中STAT3、NLRP3 和NF-κB 信號通路相關(guān)蛋白的表達。荊防顆?？赡芡ㄟ^抑制STAT3、NLRP3 和NF-κB 信號通路的激活，在細胞凋亡和炎癥水平上對AIH 產(chǎn)生抑制作用。因此，STAT3、NLRP3 和NF-κB 信號通路是荊防顆粒治療AIH 的關(guān)鍵靶點。

AIH 早期發(fā)病原因主要為CD4+細胞活化和釋放IL-1β、IL-6、CXCL8、TNF-α 等多種細胞因子[35-37]。這些細胞因子在AIH 中被誘導(dǎo)，并導(dǎo)致相關(guān)的有害免疫反應(yīng)[38]。而Con A 誘導(dǎo)的AIH 炎癥反應(yīng)主要由TNF-α、IL-1β、IL-6 和CXCL8 的增加介導(dǎo)[36-37,39-40]。ELISA 和Western blotting 結(jié)果表明，荊防顆粒顯著抑制STAT3、NLRP3 和NF-κB 信號通路相關(guān)蛋白（IL-6、p-JAK2、p-STAT3、NLRP3、ASC、Caspase-1、

IL-1β、TNF-α、p-NF-κB p65）的表達，以上蛋白被激活后反過來刺激并調(diào)節(jié)炎癥細胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6 和CXCL8 的分泌。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和AIH 小鼠模型，探究了荊防顆粒抗炎作用機制。荊防顆粒通過多成分、多靶點、多通路的協(xié)同作用發(fā)揮抗炎、抗凋亡作用治療AIH，證實了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的結(jié)果，為荊防顆粒治療AIH 提供依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突