張利恒，陳 新，邱智東

長春中醫(yī)藥大學 長白山道地藥材藥效物質重點研究室，吉林 長春 130117

人參敗毒散始載于《太平惠民和劑局方》，由羌活、獨活、柴胡、川芎、桔梗、前胡、茯苓、枳殼、人參、甘草、生姜、薄荷組成[1-2]，此方兼顧正邪，可補不滯邪，祛邪不傷正，為治療疫病的經(jīng)典古方之一[3-4]。方中化學成分繁多復雜，主要有效成分為香豆素類、黃酮類、皂苷類等化合物。其中，香豆素類成分蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯具有較明顯的抗炎、鎮(zhèn)痛、平喘、抗病毒等藥理作用[5]；黃酮苷類成分新橙皮苷、柚皮苷具有抗氧化、抗炎等藥效作用[6-7]，甘草苷具有擴張外周血管、調節(jié)免疫功能等[8]；皂苷類成分柴胡皂苷a、b 具有抗炎、解熱、抗病毒、增強免疫力的功效[9-10]。課題組參考了《中國藥典》2020年版和相關文獻報道[11-12]，進行前期研究，發(fā)現(xiàn)人參敗毒散中蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷的含量較高且穩(wěn)定。

物理指紋圖譜法，可以直觀反映中藥方劑不同批次間各物理指標的相似及差異程度，同時能綜合表征標準湯的物理屬性，可用于中藥方劑的質量評價[13]。在物理指標中，鹽度（S）為液體中鹽類物質的質量分數(shù)，是與藥物吸收相關的影響因素；溶解性總固體（total dissolved solids，TDS）值反映了水溶液中所有固體物質的總量，具體指水中鉀、鈉、鈣等礦物質離子和有機物等；電導率（G）、動力黏度（μ）的不同可導致制劑成型過程中產生差異[14]；電位（V）反映了溶液中所有物質的宏觀氧化還原性，與藥液質量控制密切相關；pH 值為氫離子濃度指數(shù)，是溶液中氫離子活動的一種標志；標準湯中固體物質的含量（solid content，SC）是制劑研究和質量控制的重要參考指標，通常采用烘干法進行測定；表面張力（γ）反映了藥液中藥物的溶解性，折光率（n）反映了藥液的澄明度，均對制劑質量產生一定的影響[15]。

煮散粉碎粒度的確定是“遵古”開發(fā)的關鍵步驟，而有關粒度的研究報道未形成統(tǒng)一標準。對于古方中“粗末”，范佳佳等[16]提出為過20 目篩至50目篩的藥材顆粒，而焦其樹等[17]建議藥材粉碎粒度為過10 目篩。因此，本研究以S、TDS、G、V、pH、μ、SC、γ、n為物理參數(shù)構建人參敗毒標準湯物理指紋圖譜，并以蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷為指標成分，對過10、24、50 目篩的人參敗毒散制備標準湯的質量進行考察，以期為該方制劑開發(fā)和質量標準建立提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

De-100g 型高速萬能粉碎機，浙江紅景天工貿有限公司；AB265-S 型十萬分之一分析天平，瑞士梅特勒托利多公司；陶瓷煎藥壺，潮州市潮安區(qū)康雅順電器有限公司；便捷式電灶，佛山市順德區(qū)金奇電器有限公司；KQ-250B 型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；實驗室PH 計，梅特勒-托利多儀器有限公司；DDSJ-308A 型電導率儀，上海儀電科學儀器股份有限公司；接觸角表面張力測量儀，豐度儀器科技有限公司；Agilent1260 型高效液相色譜儀，DAD 型檢測器，美國Agilent 公司。

1.2 試劑

蛇床子素（批號T08M8B30733）、二氫歐山芹醇當歸酸酯（批號P13J9F65515）、新橙皮苷（批號Y28F11Y16982）對照品購自上海源葉生物科技有限公司，質量分數(shù)均大于98%；柚皮苷（批號110722-200309）、甘草苷（批號111610-200604）對照品購自中國藥品生物制品有限公司，質量分數(shù)均大于98%；磷酸、乙腈均為色譜純；其他試劑均為分析純；純化水為實驗室自制。

1.3 藥材

羌活（批號20210125～20210130，四川）、獨活（批號20201104～20201109，湖北）、北柴胡（批號20210103～2021011，陜西）、川芎（批號20201031、20201102～20201108，四川）、前胡（批號20200526～20200532，浙江）、枳殼（批號20210322～20210330，湖南）、桔梗（批號20210106～20210114，河北）、茯苓（批號20210121～20210129，湖南）、人參（批號 20210316～20210323，吉林）、甘草（批號20210109～20210117，甘肅）藥材飲片均購于吉林省北藥藥材加工有限公司；羌活（批號200402～200404，青海）、獨活（批號210401～210409，四川）、北柴胡（批號210404～210409，山西）、川芎（批號02221010～02221016，四川）、前胡（批號24320006～24320013，浙江）、枳殼（批號202102～202107，江西）、桔梗（批號38620017～38620022，安徽）、茯苓（批號210504～210509，安徽）、人參（批號39021007～39021013，吉林）、甘草（批號210501～210506，甘肅）藥材飲片均購于吉林省宏檢大藥房有限公司；羌活（批號201101～201106，四川）藥材飲片均購于豪州普潤藥業(yè)有限公司。羌活、獨活、柴胡、川芎、前胡、枳殼、桔梗、茯苓、人參、甘草藥材均經(jīng)長春中醫(yī)藥大學肖井雷教授鑒定，分別為傘形科羌活屬植物羌活NotopterygiumincisumTing ex H.T.Chang 的干燥根莖和根、傘形科當歸屬植物重齒毛當歸Angelica pubescensMaxim.f.biserrataShan et Yuan 的干燥根、傘形科柴胡屬植物柴胡Bupleurum chinenseDC.的干燥根、傘形科川芎屬植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.的干燥根莖、傘形科前胡屬植物白花前胡Peucedanum praeruptorumDunn 的干燥根、蕓香科柑橘屬植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種的干燥未成熟果實、桔梗科桔梗屬植物桔梗Platycodon grandiflorum(Jacq.)A.DC.的干燥根、多孔菌科茯苓屬真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf 的干燥菌核、五加科人參屬植物人參Panax ginsengC.A.Mey.的干燥根和根莖、豆科甘草屬植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根莖的炮制加工品。

根據(jù)隨機數(shù)表法對每批人參敗毒標準湯的各藥材進行隨機排序組合，藥材飲片批號信息見表1。

表1 15 批人參敗毒標準湯藥材飲片批號信息Table 1 Lot number information of 15 batches of Renshen Baidu standard decoction

2 方法與結果

2.1 人參敗毒散的制備

根據(jù)《太平惠民和劑局方》記載，人參敗毒散的制法為“上十味，各三十兩，為粗末，每服二錢，水一盞，入生姜、薄荷各少許，同煎七分，去滓”[18]。在“遵古”核心思想下，經(jīng)查閱文獻報道[19-20]，明確宋代的“一兩”約為40 g，“一錢”約為4 g，“一盞”相當于350 mL。生姜常用量為2～5 片[16]，“少許”生姜取2 片。

為了避免因方劑藥材用量不同導致的差異，根據(jù)宋代藥用情況結合課題組前期試驗結果，確定標準湯劑中生姜用量為1 g，薄荷用量為0.5 g。選取過10、24、50 目篩的人參敗毒散制備其標準湯劑，考察不同粉碎粒度對人參敗毒散煎出物的影響。結果見表2，各批煮散的細粉含量均小于20%[21]。

表2 人參敗毒散的粒度Table 2 Particle size of Renshen Baidu powder

2.2 人參敗毒標準湯的制備

取羌活、獨活、柴胡、川芎、桔梗、前胡、茯苓、枳殼（麩炒）、人參、甘草（炙）10 味藥材飲片各40 g，粉碎，混勻。取混勻后的10 味藥材飲片粉末16 g，生姜1 g，薄荷0.5 g，加入700 mL 水，武火煮沸，文火煎至藥液490 mL，趁熱濾過，即得人參敗毒標準湯。按上述方法制備15 批人參敗毒標準湯（編號為S1～S15）。

2.3 物理指紋圖譜研究

2.3.1 物理指標的測定 將人參敗毒標準湯冷卻至室溫，分別測定其S、TDS、G、V、pH、μ、SC、γ、n的值，結果見表3。

表3 標準湯物理質量屬性檢測結果Table 3 Detection results of physical parameters of standard decoction

2.3.2 物理參數(shù)標準化轉換和相似度評價 由于物理指標的量綱之間存在差異，需將每個指標進行標準化至同一尺度，繪制指紋圖譜。

根據(jù)藥典標準以及文獻報道[22-23]，將測得的物理指標數(shù)值控制在0～10，各物理指標轉換公式見表4。將測定的各物理指標按轉換公式標準化（表5），運用Origin 軟件形成物理指紋圖譜（圖1），并對不同批次的標準湯進行相似度分析[24]，結果見表6。結果顯示，標準湯S1～S5 的物理指紋圖譜相似度為0.962～0.999，S6～S10 的物理指紋圖譜相似度為0.969～1.000，S11～S15 的物理指紋圖譜相似度為0.957～0.999，其他批次間的物理指紋圖譜相似度均小于0.950。

表6 相似度評價Table 6 Similarity evaluation

圖1 15 批人參敗毒標準湯的物理指紋圖譜Fig.1 Physical fingerprints of 15 batches of Renshen Baidu standard decoction

表4 標準湯物理質量指標的標準化轉換方法Table 4 Standardization conversion method of physical quality index of standard decoction

表5 標準湯物理質量的標準化數(shù)值Table 5 Standard values of physical quality index of standard decoction

2.3.3 物理指紋圖譜聚類分析 以15 批人參敗毒標準湯的物理指紋圖譜數(shù)據(jù)為變量，使用SPSS 20.0軟件中的系統(tǒng)聚類法以平均歐氏距離為度量標準，進行層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA），結果見圖2。結果可知，當距離為5 時，15批標準湯聚為3 類，標準湯S1～S5、S6～S10、S11～S15 各為一類，與相似度分析結果一致。

圖2 15 批人參敗毒標準湯的物理指紋圖譜聚類分析Fig.2 HCA of physical fingerprints of 15 batches of Renshen Baidu standard decoction

2.3.4 物理指紋圖譜的主成分分析（principal component analysis，PCA） 通過SIMCA-P 11.5 軟件對15 批人參敗毒標準湯的指紋圖譜數(shù)據(jù)進行PCA。結果顯示，特征值＞1 的主成分有3 個，方差貢獻率分別為88.33%、9.32%、1.85%，累積方差貢獻率為99.50%，基本可以客觀反映供試品信息。Hotelling’sT2和DModX控制圖（圖3）顯示，15 批人參敗毒標準湯均在T2臨界值（95%）警戒限和D臨界值（0.05）控制限內，表明未出現(xiàn)異常批次的標準湯[15]。繪制PCA 得分圖（圖4），15 批標準湯可分為3 類，S1～S5 位于中間、S6～S10 位于右側、S11～S15 位于左側，與HCA 結果一致。

圖3 15 批人參敗毒標準湯的Hotelling’s T2 和DMod X 控制圖Fig.3 Hotelling’s T2 and DMod X control charts of 15 batches of Renshen Baidu standard decoction

圖4 15 批人參敗毒標準湯PCA 得分圖Fig.4 PCA score diagram of 15 batches of Renshen Baidu standard decoction

由載荷圖（圖5）可知，物理指標TDS、G、V、pH、μ、SC、γ、n對主成分1 的貢獻較大；主成分2 中μ具有較大載荷，與其關聯(lián)性較強。表明人參敗毒標準湯的物理指紋圖譜中TDS、G、V、pH、μ、SC、γ、n是其物理質量的差異性指標。

圖5 15 批人參敗毒標準湯的載荷圖Fig.5 Loading diagram of 15 batches of Renshen Baidu standard decoction

2.4 多指標成分的含量測定

2.4.1 蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯色譜條件Agilent Zorbax Extend-C18（150 mm×4.6 mm，5.0 μm）色譜柱；以乙腈-水（49∶51）為流動相；體積流量1.0 mL/min；檢測波長為330 nm；柱溫25 ℃；進樣量10 μL。

2.4.2 甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷色譜條件 Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）色譜柱；以乙腈-0.05%磷酸水溶液（20∶80）為流動相；體積流量1.0 mL/min；檢測波長為237 nm（甘草苷）、283 nm（柚皮苷、新橙皮苷）；柱溫25 ℃；進樣量10 μL。

2.4.3 蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯混合對照品溶液的制備 精密稱取蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯對照品適量，分別加甲醇制成含蛇床子素38.5 μg/mL、二氫歐山芹醇當歸酸酯40.4 μg/mL 的混合對照品溶液，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.4 甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷混合對照品溶液的制備 精密稱取甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷對照品適量，分別加甲醇制成含甘草苷180 μg/mL、柚皮苷1211 μg/mL、新橙皮苷782 μg/mL 的混合對照品溶液，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.5 供試品溶液的制備 精密量取標準湯（相當于生藥量4 g），蒸至近干，硅藻土分散，置100 mL圓底燒瓶中，加甲醇50 mL，稱定質量，回流1 h，放冷后稱定質量，甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液20 mL，置于蒸發(fā)皿中，蒸干，殘渣用甲醇溶解，定容至5 mL，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.6 線性關系考察 分別精密稱取蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯對照品適量，加甲醇并分別稀釋成蛇床子素質量濃度為76.93、38.47、15.39、7.69、3.85、1.92 μg/mL 的對照品溶液，二氫歐山芹醇當歸酸酯質量濃度為101.82、50.91、25.45、12.72、6.36、3.18 μg/mL 的對照品溶液。分別精密量取混合對照品（質量濃度為甘草苷430 μg/mL、柚皮苷3010 μg/mL、新橙皮苷1946 μg/mL）1、2、4、6、8、10 mL 置于10 mL 量瓶中，甲醇定容到刻度。分別按“2.4.1”“2.4.2”項下色譜條件，重復進樣3 次，以平均峰面積為縱坐標（Y），質量濃度為橫坐標（X）進行線性回歸，計算線性回歸方程，結果分別為蛇床子素Y＝34.542X＋42.92，r＝0.999 4，線性范圍1.92～76.93 μg/mL；二氫歐山芹醇當歸酸酯Y＝26.955X＋27.892，r＝0.999 7，線性范圍3.18～101.82 μg/mL；甘草苷Y＝20 059X－29.005，r＝0.999 2，線性范圍43～430 μg/mL；柚皮苷Y＝16 263X＋74.471，r＝0.999 3，線性范圍301～3010 μg/mL；新橙皮苷Y＝18 936X－95.863，r＝0.999 3，線性范圍194.6～1946.0 μg/mL。

2.4.7 精密度試驗 取“2.4.3”“2.4.4”項下制備的混合對照品溶液各1 份，分別按“2.4.1”“2.4.2”項下色譜條件，連續(xù)進樣6 次，計算各對照品峰面積的RSD 值，結果蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷的RSD 分別為0.77%、0.46%、1.32%、1.71%、1.33%，表明該方法的精密度良好。

2.4.8 重復性試驗 按“2.4.5”項下方法制備供試品溶液6 份，分別按“2.4.1”“2.4.2”項下色譜條件進樣測定，計算蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷質量分數(shù)的RSD 值，結果RSD 分別為2.54%、2.09%、1.38%、1.07%、1.70%，表明該方法的重復性良好。

2.4.9 穩(wěn)定性試驗 按“2.4.5”項下方法制備供試品溶液1 份，分別按“2.4.1”“2.4.2”項下色譜條件，在制樣后0、2、4、6、8、10、12、24 h 進行測定，通過計算得出蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷峰面積的RSD 值，結果分別為1.14%、1.53%、1.89%、0.51%、1.76%，表明供試品溶液在24 h 內穩(wěn)定。

2.4.10 加樣回收率試驗 精密量取已知含量的標準湯適量（相當于生藥量2 g），分別精密加入各對照品溶液，按“2.4.5”項下方法平均制備6 份供試品溶液，測得峰面積，計算平均加樣回收率，結果蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷的平均加樣回收率分別為98.20%、98.82%、100.37%、99.67%、99.51%，RSD 分別為3.10%、2.90%、2.31%、2.49%、1.90%，結果表明該方法準確度良好。

2.4.11 含量測定 取“2.4.3”“2.4.4”項下制備的混合對照品溶液、“2.4.5”項下制備的供試品溶液，采用“2.4.1”“2.4.2”項下色譜條件，測定15 批人參敗毒標準湯中蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷的含量，結果見表7?？芍瑯藴蕼玈1～S5 中蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷的質量分數(shù)分別為0.063～0.072、0.109～0.116、0.436～0.451、2.861～2.971、1.839～1.888 mg/g，標準湯S6～S10中蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷的質量分數(shù)分別為0.168～0.189、0.270～0.299、0.582～0.632、3.551～3.855、2.220～2.431 mg/g，標準湯S11～S15 中蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷的質量分數(shù)分別為0.058～0.066、0.108～0.126、0.420～0.444、2.427～2.522、1.492～1.525 mg/g。

表7 15 批人參敗毒標準湯中指標成分的含量測定結果Table 7 Determination results of index components in 15 batches of Renshen Baidu standard decoction

2.5 指標成分HCA

以15 批人參敗毒標準湯中蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷的質量分數(shù)為變量，使用SPSS 20.0 軟件進行HCA，結果見圖6。結果可知，當距離為5 時，15 批標準湯中S1～S5、S6～S10、S11～S15 各聚為一類，與物理指紋圖譜HCA 結果一致。

圖6 15 批人參敗毒標準湯的指標成分含量HCA 圖Fig.6 HCA of index component content of 15 batches of Renshen Baidu standard decoction

2.6 相關性分析

采用SPSS 20.0 軟件對物理指紋圖譜中S、TDS、G、V、pH、μ、SC、γ、n與蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷的含量之間進行相關性分析。由表8 可知，物理指標TDS、G、V、pH、μ、SC、γ、n與蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷的含量之間存在相關關系。其中，蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯、甘草苷與TDS、G、V、μ、SC、γ、n極顯著相關（P＜0.01），柚皮苷、新橙皮苷與TDS、G、V、pH、μ、SC、γ、n極顯著相關（P＜0.01）；蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷的含量與物理指標TDS、G、pH、μ、SC、γ、n呈顯著正相關，與V呈顯著負相關。

表8 物理指標與指標成分含量的相關性Table 8 Correlation analysis of physical indexes and content of index components

3 討論

標準湯劑是經(jīng)典名方復方制劑的工藝優(yōu)化和質量控制的物質基準[25]，而制備標準湯的散劑粒度是影響其質量的關鍵因素。本研究對人參敗毒標準湯的S、TDS、G、V、pH、μ、SC、γ、n進行測定，構建其物理指紋圖譜。由圖譜可知，不同粉碎粒度煮散的物理參數(shù)之間有明顯的差異，過24 目篩的各批次人參敗毒標準湯的TDS、G、μ、SC、γ均相對較高。圖譜相似度分析結果表明，過10、24、50目篩的人參敗毒散制備標準湯的物理質量屬性之間存在差異，HCA 結果進一步驗證了不同粉碎粒度的煮散之間的差異性。經(jīng)PCA 可知，15 批人參敗毒標準湯未出現(xiàn)異常批次，不同粉碎粒度的人參敗毒標準湯物理質量屬性的差異性指標主要有TDS、G、V、pH、μ、SC、γ、n。15 批人參敗毒標準湯中蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷的含量測定結果表明，過24 目的煮散中各指標成分含量均高于過10、50 目的煮散。經(jīng)HCA發(fā)現(xiàn)不同粉碎粒度的煮散各聚為一類，與物理指紋圖譜分析結果一致。分析其原因，可能是過10 目篩的人參敗毒散粉碎粒度過大，不利于有效成分的浸出，使其溶出率較低；而過50 目篩的人參敗毒散粉碎粒度較小，易聚集成塊，在煎煮過程中容易產生糊化，導致有效成分損失。因此，過24 目篩是人參敗毒散最佳的粉碎粒度。物理指標S、TDS、G、V、pH、μ、SC、γ、n與蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷的含量之間相關性分析結果顯示，TDS、G、V、pH、μ、SC、γ、n與各指標成分的含量之間有顯著相關性，表明標準湯的物理指標的變化與有效成分含量的增減之間存在密切關系。

本研究以物理指紋圖譜、多指標成分含量結合多元統(tǒng)計分析的模式，從粉體學性質和化學成分兩方面對不同粉碎粒度的人參敗毒標準湯關鍵質量屬性進行評價，為人參敗毒散現(xiàn)代劑型開發(fā)及質量標準研究提供理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突