劉欣欣,黃甜甜,付婧欣,李 鑫,王向濤*
1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150076
2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所,北京 100193
3.首藥控股(北京)股份有限公司,北京 102600
小豆蔻明(cardamonin,Car)主要存在于姜科山姜屬植物草豆蔻AlpiniakatsumadaiHayata 種子中的黃酮類單體化合物,化學(xué)結(jié)構(gòu)為2,4-雙羥基-6 甲氧査耳酮[1]。小豆蔻明及其衍生物主要具有抗炎[2]、抗氧化[3]、松弛血管平滑肌[4]等多種生物活性。近些年發(fā)現(xiàn)小豆蔻明可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移[5]、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[6],并表現(xiàn)出廣譜抗腫瘤作用,對(duì)多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[5]、Lewis 肺癌[7]、乳腺癌[6,8]、結(jié)腸癌[9]、卵巢癌[10]、胃癌[11]、骨肉瘤[12]、黑色素瘤[13]等細(xì)胞的生長(zhǎng)均有抑制作用。在抗腫瘤機(jī)制方面,小豆蔻明能夠靶向多種信號(hào)分子、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子和酶,如雷帕霉素靶蛋白(target of rapamy,cinTOR)、對(duì)核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子 3(signal transducer and activator of transcription,STAT3)、Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin ,Wnt/β-catenin) 和環(huán)氧化酶 2(cyclooxygenase,COX2)等,有望成為一種多靶點(diǎn)的抗腫瘤分子實(shí)體[2,4,6,14]。但小豆蔻明幾乎不溶于水(溶解度<2.7 μg/mL),難于給藥、生物利用度低,限制了其進(jìn)一步的體內(nèi)研究和臨床應(yīng)用[15]。
許多制劑手段可以改善難溶性藥物溶解性,如增溶、潛溶、環(huán)糊精包合、固體分散體、納米給藥系統(tǒng)等方法[16]。其中,納米給藥系統(tǒng)備受關(guān)注,其不但可以解決藥物的難溶性問題,而且可通過改善藥物溶出、擴(kuò)大與小腸吸收部位接觸面積、延長(zhǎng)藥物在小腸微絨毛的停留時(shí)間等多種途徑提高藥物的口服生物利用度,此外,基于實(shí)體瘤的高通透性和滯留效應(yīng)(enhanced permeability and retention effect,EPR)提高難溶性抗腫瘤藥物在腫瘤中的分布[17-18]。
納米混懸劑(nanosuspensions,NPs)是指采用少量的表面活性劑穩(wěn)定“純”藥物粒子所形成的一種亞微米級(jí)別(200~500 nm)的膠體分散體系[19]。通過減小粒徑,能增加藥物的飽和溶解度和溶出速率[20],非常符合小豆蔻明需要大劑量給藥的要求。因此,本研究以簡(jiǎn)單的反溶劑沉淀法聯(lián)合高壓均質(zhì)法制備小豆蔻明納米混懸劑(cardamonin NPs,Car-NPs),從泊洛沙姆188(P188)、維生素E 聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、二硬脂?;字R掖及?聚乙二醇 2000(DSPEmPEG2000)中篩選出合適的穩(wěn)定劑,采用Box-Behnken效應(yīng)面法對(duì)藥物與穩(wěn)定劑的比例、高壓均質(zhì)參數(shù)等進(jìn)行了優(yōu)化,并對(duì)其進(jìn)行了體外表征與體外抗腫瘤效果研究,Car-NPs 展現(xiàn)出了巨大的抗腫瘤潛力。
Meppler Toledo AL204 電子天平,梅特勒-托利多儀器有限公司;Purelab Classic 綜合純水儀,英國(guó)ELGA 公司;KQ3200DB 數(shù)控超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;RE52CS 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;Zetasizer-nanozs 90 納米粒度及Zeta 電位分析儀,馬爾文儀器有限公司;Plphr-2-4 LD Plus 低溫凍干機(jī),德國(guó)Christ 有限公司;RMCO18AC 二氧化碳培養(yǎng)箱,日本Sanyo 公司;JEM-1400 透射電子顯微鏡(TEM),日本電子珠式會(huì)社;Tecan Infinite M1000 PRO 多功能酶標(biāo)儀,力臻卓越科學(xué)儀器有限公司;UltiMate 3000 高效液相色譜儀,賽默飛世爾科技有限公司。
小豆蔻明對(duì)照品,質(zhì)量分?jǐn)?shù) 98%,批號(hào)C58635E93,上海吉至生化有限公司;小豆蔻明原料藥,質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%,批號(hào)20220715,上海金穗生物科技有限公司;維生素 E 聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS),上海海斯夫生物有限公司;二硬脂?;字R掖及?聚乙二醇2000(DSPE-mPEG2000),山東岱罡生物有限公司;泊洛沙姆188(P188),Sigma公司;十二烷基硫酸鈉(SDS),西安海斯夫生物科技有限公司;聚乙烯吡咯烷酮(PVP),無錫科技實(shí)驗(yàn)二廠;麥芽糖,北京蘭博利德商貿(mào)有限公司;葡萄糖,上海吉至有限公司;甘露醇,北京索萊寶科技有限公司;色譜甲醇,上海吉至生物科技有限公司;實(shí)驗(yàn)用水為去離子水,其余試劑或藥品均為分析純,購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
小鼠乳腺癌4T1 細(xì)胞、人肝癌HepG2 細(xì)胞,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心;RPMI 1640 培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素雙抗,美國(guó)Gibco 公司;96 孔無菌培養(yǎng)板,美國(guó)Corning 公司。
將小豆蔻明分別與不同的穩(wěn)定劑(P188、TPGS、SDS、DSPE-mPEG2000)以一定的比例共同溶于丙酮中,在超聲條件(25 ℃、250 W)下,勻速緩慢地滴入到去離子水中,35 ℃下減壓旋蒸除去丙酮,高壓均質(zhì)數(shù)次,即得Car-NPs 混懸液。
空白小豆蔻明納米粒供試品溶液同法制備。
2.2.1 供試品溶液的配制 精密量取Car-NPs 混懸液1 mL 至25 mL 量瓶中,加入10 mL 甲醇,超聲5 min 以破壞Car-NPs,放置至室溫,甲醇定容至刻度,即得Car-NPs 供試品溶液。
2.2.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取小豆蔻明對(duì)照品10.0 mg,置于10 mL 量瓶中,甲醇溶解并加至刻度,即得質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 的對(duì)照品溶液。
2.2.3 色譜條件 色譜柱為Venusil XBP C18(L)(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相為甲醇-水(75∶25);檢測(cè)波長(zhǎng)為343 nm;體積流量為1 mL/min;柱溫為25 ℃;進(jìn)樣量為20 μL;理論塔板數(shù)以小豆蔻明計(jì)算不低于10 000。
2.2.4 專屬性考察 分別取小豆蔻明對(duì)照品溶液、Car-NPs 混懸液、空白納米粒溶液,過0.22 μm 微孔濾膜,在“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC 檢測(cè)。由圖1 可知,Car-NPs 混懸液與對(duì)照品溶液在相同時(shí)間出峰(7.67 min 左右),空白納米粒樣品溶液未出現(xiàn)色譜峰,故確定空白納米粒對(duì)小豆蔻明測(cè)定無干擾。
圖1 小豆蔻明對(duì)照品(A)、Car-NPs 混懸液(B)、空白納米粒(C)的HPLC 圖Fig.1 HPLC of cardamonin reference substance(A),Car-NPs suspension(B),and blank nanoparticles(C)
2.2.5 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液適量,用甲醇稀釋,分別配制成質(zhì)量濃度分別為0.25、0.50、5.00、10.00、25.00、50.00、75.00、100.00、200.00、250.00 μg/mL 的小豆蔻明對(duì)照品溶液。按照“2.2.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,分別記錄峰面積。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y),進(jìn)行線性回歸分析,得回歸方程Y=1.877 6X+2.067 4,R2=0.999 6,結(jié)果表明小豆蔻明在0.25~250 μg/mL 與峰面積線性關(guān)系良好。
2.2.6 精密度試驗(yàn) 取高、中、低(250.00、50.00、0.25 μg/mL)3 個(gè)質(zhì)量濃度的小豆蔻明對(duì)照品溶液,按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件下分別連續(xù)進(jìn)樣6 次。測(cè)定結(jié)果顯示,高、中、低質(zhì)量濃度下小豆蔻明峰面積的RSD 分別為0.34%、0.98%、0.67%,結(jié)果表明儀器精密度良好。
2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批凍干粉,用適量甲醇溶解,平行制備6 份供試品溶液,分別于0、2、4、8、12、24 h,按照“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,測(cè)得小豆蔻明峰面積的RSD 為1.44%,表明Car-NPs的凍干粉供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 按照“2.2.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份Car-NPs 凍干粉供試品溶液,分別進(jìn)樣測(cè)定。測(cè)定結(jié)果顯示,小豆蔻明質(zhì)量濃度的RSD 為1.81%,因此該方法重復(fù)性良好。
2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取Car-NPs 的凍干粉溶液9 份,每份均為0.5 mL,分別加入小豆蔻明對(duì)照品儲(chǔ)備液(質(zhì)量濃度為1 mg/mL)3、5、7 mL,制備成供試品溶液。取供試品溶液在“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定小豆蔻明含量并計(jì)算回收率。結(jié)果顯示,小豆蔻明的平均加樣回收率為100.45%,RSD 為1.23%。
以制備得到的Car-NPs 的平均粒徑、多分散系數(shù)(polydispersity index,PDI)以及ζ 電位為評(píng)價(jià)指標(biāo),對(duì)處方工藝進(jìn)行單因素考察。
2.3.1 穩(wěn)定劑種類 嘗試以TPGS、P188、SDS 和DSPE-mPEG2000為穩(wěn)定劑,藥載比為1∶1,藥物終質(zhì)量濃度為1 mg/mL,60 MPa 下高壓均質(zhì)10 次,通過單因素試驗(yàn)考察不同穩(wěn)定劑對(duì)Car-NPs 的粒徑、PDI和ζ 電位的影響。結(jié)果見表1,P188 為穩(wěn)定劑制備的Car-NPs 粒徑最小、PDI最集中。這可能原因是與P188 的巨大位阻效應(yīng)有關(guān),使得其較小的用量就使得納米混懸劑均一且穩(wěn)定,故后續(xù)選擇P188 為穩(wěn)定劑制備Car-NPs。
表1 穩(wěn)定劑種類的篩選(±s,n = 3)Table 1 Screening of stabilizer types(±s,n = 3)
表1 穩(wěn)定劑種類的篩選(±s,n = 3)Table 1 Screening of stabilizer types(±s,n = 3)
穩(wěn)定劑 粒徑/nm PDI ζ 電位/mV TPGS 268.0±11.7 0.240±0.035-14.2±0.8 P188 197.0±9.7 0.203±0.049-19.7±0.5 SDS 259.4±15.1 0.209±0.033-20.0±0.1 DSPE-mPEG2000 336.1±4.9 0.283±0.038-13.4±0.3
2.3.2 藥物質(zhì)量濃度 以P188 為穩(wěn)定劑,藥載比為1∶1,藥物終質(zhì)量濃度為2、4、5、10 mg/mL,60 MPa 下高壓均質(zhì)10 次,通過單因素試驗(yàn)考察藥物質(zhì)量濃度對(duì)Car-NPs 的粒徑、PDI值和ζ 電位的影響(表2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)藥物質(zhì)量濃度為2 mg/mL 時(shí)制備的Car-NPs 粒徑和PDI值均最小,ζ 電位最高,增大藥物質(zhì)量濃度后粒徑均在250 nm 以內(nèi),但PDI變化較大,可能原因是藥物質(zhì)量濃度的增加影響了載體對(duì)藥物的包裹。
表2 藥物質(zhì)量濃度的影響(±s,n = 3)Table 2 Effects of drug concentration(±s,n = 3)
表2 藥物質(zhì)量濃度的影響(±s,n = 3)Table 2 Effects of drug concentration(±s,n = 3)
藥物質(zhì)量濃度/(mg·mL-1)粒徑/nm PDI ζ 電位/mV 2 192.8±3.9 0.190±0.029-19.7±0.1 4 227.4±2.6 0.266±0.013-18.2±0.3 5 192.5±1.5 0.317±0.022-18.9±0.3 10 178.4±3.7 0.333±0.034-16.7±0.9
2.3.3 藥物與穩(wěn)定劑用量比例 以P188 為載體,制備藥物終質(zhì)量濃度為2 mg/mL 的Car-NPs,于60 MPa 下高壓均質(zhì)10 次,通過單因素實(shí)驗(yàn)考察藥物與穩(wěn)定劑的比例對(duì)Car-NPs 的粒徑、PDI值和ζ 電位的影響(表3)。隨著藥載比的不斷變化,粒徑及PDI也隨之改變,當(dāng)藥載比較小時(shí),PDI也較小但粒徑較大,在藥載比5∶1 時(shí)粒徑最小且分布較集中,故選擇藥載比5∶1 用來后續(xù)研究。
表3 穩(wěn)定劑與藥物用量比例的影響(±s,n = 3)Table 3 Effect of ratio of stabilizer to drug dosage(±s,n = 3)
表3 穩(wěn)定劑與藥物用量比例的影響(±s,n = 3)Table 3 Effect of ratio of stabilizer to drug dosage(±s,n = 3)
藥載比 粒徑/nm PDI ζ 電位/mV 1∶1 288.5±3.0 0.138±0.030-23.2±0.3 2∶1 246.0±3.7 0.139±0.030-18.8±0.2 3∶1 250.9±2.2 0.147±0.022-18.5±0.6 5∶1 195.5±1.7 0.196±0.068-19.2±0.6 6∶1 227.7±5.9 0.220±0.007-14.6±0.9 7∶1 207.9±0.9 0.240±0.056-14.3±0.5 8∶1 283.9±5.4 0.158±0.034-15.0±0.8
2.3.4 均質(zhì)壓力 以P188 為載體,藥物終質(zhì)量濃度為2 mg/mL、藥載比為1∶1,在不同均質(zhì)壓力(10、30、90、100 MPa)下,高壓均質(zhì)10 次,通過單因素試驗(yàn)考察不同均質(zhì)壓力對(duì)Car-NPs 的粒徑、PDI值和ζ 電位的影響(表4)。隨著均質(zhì)壓力的增加,Car-NPs 粒徑減小,壓力為60 MPa 時(shí)粒徑較小且分布較均一,繼續(xù)增加壓力,所得納米粒的粒徑略有減小但分布寬度增加。在100 MPa 時(shí),粒徑和PDI明顯增加,這可能原因是較大的均質(zhì)壓力將Car-NPs 結(jié)構(gòu)改變。
表4 均質(zhì)壓力的影響(±s,n = 3)Table 4 Effects of homogenization pressure(±s,n = 3)
表4 均質(zhì)壓力的影響(±s,n = 3)Table 4 Effects of homogenization pressure(±s,n = 3)
均質(zhì)壓力/MPa 粒徑/nm PDI ζ 電位/mV 10 402.1±12.3 0.287±0.008-17.7±0.4 30 255.6±4.7 0.277±0.072-18.6±0.9 60 197.4±3.5 0.325±0.055-19.5±0.3 90 163.5±0.5 0.212±0.016-20.0±0.2 100 248.5±0.5 0.435±0.052-19.1±0.5
2.3.5 均質(zhì)次數(shù) 以P188 為載體,藥物終質(zhì)量濃度為2 mg/mL,藥載比為1∶1,均質(zhì)壓力為60 MPa,分別均質(zhì)5、10、15 次,通過單因素試驗(yàn)考察不同均質(zhì)次數(shù)對(duì)Car-NPs 的粒徑、PDI值和ζ 電位的影響(表5),可發(fā)現(xiàn)隨著均質(zhì)次數(shù)增加,Car-NPs 的粒徑逐漸減小,表面電位略有增高。
表5 均質(zhì)次數(shù)的影響(±s,n = 3)Table 5 Effects of homogenization times(±s,n = 3)
表5 均質(zhì)次數(shù)的影響(±s,n = 3)Table 5 Effects of homogenization times(±s,n = 3)
均質(zhì)次數(shù) 粒徑/nm PDI ζ 電位/mV 5 227.4±3.5 0.287±0.008-17.7±0.5 10 199.6±4.7 0.277±0.072-18.6±0.4 15 157.4±3.5 0.325±0.055-19.5±0.5
2.4.1 設(shè)計(jì)方案 以P188 為穩(wěn)定劑制備的Car-NPs,由于藥載比、均質(zhì)壓力及均質(zhì)次數(shù)對(duì)Car-NPs的影響較為復(fù)雜,因此采用Box-Behnken效應(yīng)面法對(duì)Car-NPs 處方進(jìn)行優(yōu)化;以藥載比(X1)、均質(zhì)壓力(X2)及均質(zhì)次數(shù)(X3)為自變量,以平均粒徑(Y1)及PDI(Y2)為主要評(píng)價(jià)指標(biāo),進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
2.4.2 回歸模型方差分析及顯著性檢驗(yàn) 以Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化其工藝參數(shù)[21],因素水平及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6。采用Design-Expert V8.0.6 軟件進(jìn)行數(shù)學(xué)模型擬合。Y1和Y2作為響應(yīng)值,X1、X2、X3為自變量,建立的2 次回歸方程為Y1=667.95-16.69X1-6.311X2-41.006X3-0.267 92X1X2-1.072 5X1X3-0.064 833X2X3+5.664 38X12+0.062 286X22+2.186 3X32,R2=0.984 4,P<0.000 1;Y2=1.162-0.132 14X1-6.863 3×10-3-0.086 855X2+1.833 33×10-4X1X2+1.925×10-3X1X3+8.333 33×10-5X2X3+0.011 244X12+4.525×10-5X22+3.259×10-3X32,R2=0.988 8,P<0.000 1;結(jié)果表明各因素之間具有良好的相關(guān)性。自變量與響應(yīng)值的三維圖如圖2所示。Y1是評(píng)價(jià)納米粒的主要指標(biāo),理想的納米粒應(yīng)具有盡可能小的粒徑以最大限度實(shí)現(xiàn)其尺寸效應(yīng),同時(shí)應(yīng)分布均勻,具有較高載藥量,且制備簡(jiǎn)單的特點(diǎn),因此,最佳處方確定條件為X1=4∶1,X2=65.37 MPa,X3=11 次,預(yù)測(cè)平均粒徑為194.8 nm,PDI為0.187。
圖2 自變量與響應(yīng)值的三維圖Fig.2 Three-dimensional plot of independent variable and response values
表6 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果(n = 3)Table 6 Experimental design and results of Box-Behnken(n = 3)
2.4.3 工藝驗(yàn)證 根據(jù)優(yōu)化后的處方工藝制備3 批Car-NPs,平均粒徑為(198.5±5.4)nm,PDI為0.191±0.020,見圖3;且表面成正電位,呈現(xiàn)良好的穩(wěn)定性。與預(yù)測(cè)值方差相差小于5%,說明該模型可信度良好,預(yù)測(cè)性較優(yōu),可用于處方工藝優(yōu)化。
圖3 Car-NPs 的粒徑分布圖(n = 3)Fig.3 Size distribution of Car-NPs(n = 3)
Car-NPs 外觀呈黃色,無沉淀和不溶性微粒存在(圖4-a)。采用TEM 觀察Car-NPs 的形態(tài)。將1滴Car-NPs 滴在銅網(wǎng)上,用2%磷鎢酸染色5 min。室溫下將銅網(wǎng)晾干,放置TEM 下觀察。Car-NPs 呈現(xiàn)圓球形,大小分布較為均勻,粒子之間無黏連和聚集現(xiàn)象(圖4-b)。
圖4 Car-NPs 的實(shí)物照片(a)和透射電鏡照片(b)Fig.4 Photo(a)and TEM photograph(b)of Car-NPs
2.6.1 放置穩(wěn)定性考察 將制備好的Car-NPs 于室溫25 ℃放置,測(cè)定15 d 內(nèi)的粒徑變化。結(jié)果Car-NPs 在15 d 內(nèi)粒徑變化較小(表7),Car-NPs 室溫放置15 d 內(nèi)粒徑較為穩(wěn)定。
表7 室溫放置粒徑變換(±s,n = 3)Table 7 Particle size transformation of Car-NPs when stored at room temperature(±s,n = 3)
表7 室溫放置粒徑變換(±s,n = 3)Table 7 Particle size transformation of Car-NPs when stored at room temperature(±s,n = 3)
t/d 平均粒徑/nm t/d 平均粒徑/nm t/d 平均粒徑/nm 1 197.7±1.4 7 207.8±1.1 13 212.3±0.9 3 204.5±1.3 9 205.2±1.3 15 207.7±2.1 5 200.8±1.3 11 209.5±2.0
2.6.2 在生理介質(zhì)中的穩(wěn)定性考察 精密吸取Car-NPs 1 mL,與2×PBS(2 倍濃度的磷酸鹽緩沖溶液,pH 7.4)、1.8% NaCl 溶液和10%葡萄糖溶液等體積混合,得到等滲的Car-NPs 的0.9% NaCl 溶液、5%葡萄糖溶液和PBS 溶液;與人工胃液、人工腸液按體積比1∶4 混合,37 ℃孵育,分別在0、1、3、5、7 h 間點(diǎn)取樣測(cè)定平均粒徑及PDI變化[22]。結(jié)果見表8,可知Car-NPs 在PBS、5%葡萄糖、0.9%NaCl、和人工胃液腸液中孵育7 h 后平均粒徑和PDI變化均較小,沒有出現(xiàn)任何渾濁或沉淀現(xiàn)象,說明Car-NPs 在這些生理介質(zhì)中穩(wěn)定性好,Car-NPs 或可以調(diào)成PBS、生理鹽水、5%葡萄糖等滲溶液,為Car-NPs 注射給藥提供參考依據(jù)。實(shí)驗(yàn)中制備的Car-NPs在人工胃腸液中連續(xù)孵育7 h 均能保持粒徑?jīng)]有明顯增大,滿足口服給藥的條件,為提高Car-NPs 的口服生物利用度提供可能。
表8 Car-NPs 在不同生理介質(zhì)中的粒徑變化(±s,n = 3)Table 8 Characterization of Car-NPs particle size transformation in different physiological media(±s,n = 3)
表8 Car-NPs 在不同生理介質(zhì)中的粒徑變化(±s,n = 3)Table 8 Characterization of Car-NPs particle size transformation in different physiological media(±s,n = 3)
生理介質(zhì) 平均粒徑/nm PDI0 h 1 h 3 h 5 h 7 h 0 h 1 h 3 h 5 h 7 h PBS 199.2±2.7 206.3±1.8 203.2±2.5 215.7±2.8 211.9±2.8 0.158±0.013 0.159±0.012 0.167±0.022 0.156±0.014 0.153±0.023 5%葡萄糖 203.4±2.0 198.6±0.6 200.0±2.4 209.5±1.6 212.8±1.9 0.153±0.014 0.230±0.016 0.193±0.017 0.196±0.016 0.191±0.012 0.9% NaCl 206.9±1.8 199.9±4.7 205.1±2.4 202.1±2.6 216.0±3.8 0.183±0.011 0.152±0.005 0.214±0.014 0.210±0.013 0.168±0.024人工胃液 206.8±1.8 197.0±2.0 203.1±7.9 214.2±1.2 211.3±1.8 0.177±0.012 0.219±0.007 0.179±0.011 01.74±0.016 0.185±0.010人工腸液 202.8±1.8 210.3±2.6 205.7±2.2 199.1±3.0 216.5±2.7 0.198±0.015 0.215±0.017 0.241±0.011 0.177±0.009 0.233±0.017
2.7.1 紅細(xì)胞懸浮液的配制 將新鮮大鼠全血3500 r/min 離心(離心半徑9.8 cm)10 min,去除上清。紅細(xì)胞沉淀用0.9% NaCl 溶液吹打洗滌,3500 r/min離心(離心半徑9.8 cm)10 min 去除上清液,重復(fù)2~3 次,直至上清無色透明。最終用0.9% NaCl 溶液將紅細(xì)胞調(diào)節(jié)成濃度為4%的紅細(xì)胞懸浮液。
2.7.2 Car-NPs 溶血性的考察 將Car-NPs 用一定濃度的NaCl 溶液調(diào)成質(zhì)量濃度分別為2.00、1.00、0.50、0.25 mg/mL 的生理鹽水等滲液,取等滲液與紅細(xì)胞懸浮液體積比1∶1(使紅細(xì)胞終濃度為2%)混合后37 ℃孵育4 h,3500 r/min 離心(離心半徑9.8 cm)5 min。小豆蔻明溶液組同法制備。上清液用酶標(biāo)儀在540 nm 測(cè)吸光度(A)值,每一質(zhì)量濃度平行實(shí)驗(yàn)3 次,以0.9% NaC1 為空白對(duì)照,以蒸餾水為陽性對(duì)照,計(jì)算溶血率,溶血率隨質(zhì)量濃度變化結(jié)果如表9所示。
表9 Car-NPs 不同質(zhì)量濃度的溶血率(±s,n = 3)Table 9 Hemolysis rate of Car-NPs at different concentrations(±s,n = 3)
表9 Car-NPs 不同質(zhì)量濃度的溶血率(±s,n = 3)Table 9 Hemolysis rate of Car-NPs at different concentrations(±s,n = 3)
質(zhì)量濃度/(mg·mL-1)溶血率/%Car-NPs 小豆蔻明0.25-8.57±1.25 5.78±2.32 0.50-4.39±1.51 22.01±1.51 1.00 4.55±1.43 55.56±1.24 2.00 24.33±1.24 72.45±1.75
溶血率=1-A實(shí)驗(yàn)/A空白
iv 給藥時(shí),納米混懸劑的溶血率不得超過5%。表9 中可以看出,小豆蔻明溶液在0.25 mg/mL 時(shí)溶血率較低,但當(dāng)藥物質(zhì)量濃度增加,溶血率也不斷變大,在2 mg/mL 時(shí),溶血率最高為72.45%,這可能是由于小豆蔻明脂溶性很強(qiáng),它的脂肪長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)易插入紅細(xì)胞膜并且相互作用,使膜的表面張力下降從而使得膜結(jié)構(gòu)被破壞導(dǎo)致溶血,然而當(dāng)把小豆蔻明制備成納米混懸劑后,2 mg/mL 時(shí)的溶血率下降到24.33%,在藥物質(zhì)量濃度低于1 mg/mL 時(shí)完全不溶血。這可能是由于小豆蔻明被包載在P188 形成的兩親性聚合物的內(nèi)核之中,由于P188 的生物相容性很好幾乎沒有紅細(xì)胞膜毒性,因此Car-NPs的溶血率很低。故Car-NPs,在不高于1 mg/mL 時(shí)基本滿足iv 的給藥要求。
將Car-NPs 不加保護(hù)劑的情況下直接凍干,取適量精密稱定質(zhì)量為W,加入凍干前10 倍體積的甲醇充分溶解(體積V),13 000 r/min 離心(離心半徑9.8 cm)10 min,取上清液在“2.2.3”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定小豆蔻明的含量(C),按照下式計(jì)算載藥量[22]。
載藥量=CV/W
精密稱取藥物和輔料P188,按照優(yōu)化的處方工藝制備Car-NPs,定容(V總),精密量取2 mL(V樣),以截留相對(duì)分子質(zhì)量3000 的超濾離心管在6000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心(離心半徑9.8 cm)5 min,收集濾液,在“2.2.3”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定濾液中游離小豆蔻明的含量(C游離)。根據(jù)投藥量(W),計(jì)算包封率[22]。由表10 結(jié)果可知,Car-NPs 的載藥量為(62.54±0.13)%,包封率為(95.65±0.26)%,重復(fù)性良好,說明藥物被有效地包載在納米粒中。
表10 Car-NPs 的載藥量及包封率(±s,n = 3)Table 10 Drug-loading rate and encapsulation efficiency of Car-NPs(±s,n = 3)
表10 Car-NPs 的載藥量及包封率(±s,n = 3)Table 10 Drug-loading rate and encapsulation efficiency of Car-NPs(±s,n = 3)
批次 載藥量/% 包封率/%1 62.87±0.12 94.87±0.22 2 65.51±0.13 95.51±0.23 3 59.25±0.11 96.56±0.34
包封率=1-C游離V樣/W
取1 mL Car-NPs 冷凍干燥,加入1 mL 去離子水復(fù)溶,觀察復(fù)溶情況并檢測(cè)粒徑。另各取1 mL Car-NPs 于西林瓶中,分別加0.1%的PVP、葡萄糖、甘露醇和麥芽糖為凍干保護(hù)劑,冷凍干燥,凍干粉加入1 mL 去離子水振搖復(fù)溶,必要時(shí)輔以震蕩、超聲,觀察溶解情況,測(cè)定凍干復(fù)溶前后的粒徑變化。結(jié)果如表11所示,Car-NPs 直接凍干后加去離子水,振搖即可復(fù)溶,但粒徑較大且分布較寬。以0.1% PVP 為凍干保護(hù)劑時(shí),凍干復(fù)溶較其他保護(hù)劑粒徑最小,同時(shí)表現(xiàn)出良好的PDI,表面電荷呈負(fù)電穩(wěn)定狀態(tài),這和凍干前相差不大;故選用0.1%PVP 為Car-NPs 的凍干保護(hù)劑。
表11 Car-NPs 不同凍干保護(hù)劑篩選(±s,n = 3)Table 11 Screening of cryoprotectants for Car-NPs(±s,n = 3)
表11 Car-NPs 不同凍干保護(hù)劑篩選(±s,n = 3)Table 11 Screening of cryoprotectants for Car-NPs(±s,n = 3)
凍干保護(hù)劑 平均粒徑/nm PDI ζ 電位/mV無 446.4±13.9 0.318±0.011-20.2±0.4 0.1% PVP 207.7±6.7 0.171±0.028-19.2±0.2 0.1%葡萄糖 366.9±6.6 0.322±0.019-17.5±0.2 0.1%甘露醇 375.5±13.5 0.291±0.024-17.3±0.3 0.1%麥芽糖 680.2±28.3 0.575±0.052-19.8±0.6
采用透析法考察Car-NPs 的體外釋放情況[23]。取Car-NPs、小豆蔻明原料藥的物理混懸液(分散于0.5% CMC-Na 的去離子水)各1 mL 于截留相對(duì)分子質(zhì)量為8000~14 000 的即用型透析袋中,13 000 r/min 攪拌下對(duì)50 mL 含0.5%聚山梨酯80 的PBS透析,每個(gè)樣品平行3 份,每24 小時(shí)更換1 次釋放外液;分別于0.5、1、2、4、8、12、24、36、48、72、96、120、144、168 h 取1 mL 釋放外液,13 000 r/min 離心(離心半徑9.8 cm)20 min,取上清以HPLC 測(cè)定藥物質(zhì)量濃度,計(jì)算累積釋放率。同時(shí)補(bǔ)充相應(yīng)體積37 ℃的釋放介質(zhì)。結(jié)果如圖5所示,Car-NPs 在含0.5%聚山梨酯80 的PBS(pH 7.4)中呈兩相釋放,先是12 h 內(nèi)快速釋放,累積釋放率達(dá)52.85%,然后是12~168 h 內(nèi)緩慢釋放(累積釋放率達(dá)76.49%)。而完全相同的條件下,小豆蔻明原料藥釋放非常緩慢,168 h 累積釋放率僅22.65%??梢妼⑿《罐⒚髦瞥杉{米混懸劑后,顯著提高了藥物釋放,這將非常有利于提高小豆蔻明的口服生物利用度。
圖5 Car-NPs 體外釋放曲線(±s,n = 3)Fig.5 In vitro drug release profiles of Car-NPs and the CAR physical suspensions(±s,n = 3)
通過Origin 2021 軟件,分別應(yīng)用零級(jí)方程、一級(jí)方程和Higuchi 方程對(duì)小豆蔻明及Car-NPs 的體外釋放行為進(jìn)行擬合(表12),可知小豆蔻明和Car-NPs 的釋放符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)釋放方程。證明了二者主要通過擴(kuò)散控制方式進(jìn)行釋藥。
表12 小豆蔻明和Car-NPs 分別在PBS 下體外釋放的擬合方程Table 12 Fitting equations of in vitro release of cardamonin and Car-NPs under PBS
體外培養(yǎng)HepG2、4T1 細(xì)胞至對(duì)數(shù)期,按6.0×103/孔的細(xì)胞密度接種于96 孔板中,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后,分別用不含胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基(HepG2 細(xì)胞)、RPMI培養(yǎng)基(4T1細(xì)胞)將Car-NPs、小豆蔻明的DMSO 溶液(2.4 mg/mL)稀釋成含小豆蔻明100.0、50.0、20.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.5、0.1 μg/mL 的溶液,每孔200 μL加入到96 孔板中,空白對(duì)照組只加等體積的不含胎牛血清的DMEM、RPMI培養(yǎng)基,每個(gè)質(zhì)量濃度平行給藥6 孔,孵育24 h。隨后每孔加入CCK-8 的溶液10 μL,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h,用微孔振蕩器震蕩10 min,酶標(biāo)儀450 nm 處測(cè)其吸光度(A)值,用GraphPad Prism 7 軟件測(cè)其半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)值[23]。
細(xì)胞抑制率=(A對(duì)照-A實(shí)驗(yàn))/(A對(duì)照-A空白)
通過細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)法測(cè)定并評(píng)估小豆蔻明游離藥物溶液及Car-NPs 對(duì)HepG2 細(xì)胞、4T1 細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性。結(jié)果如表13所示,所有游離小豆蔻明及Car-NPs 組的細(xì)胞抑制率都隨著質(zhì)量濃度的增加而上升,其細(xì)胞毒性作用呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。在2~100 μg/mL 質(zhì)量濃度下,Car-NPs 組顯示出比游離小豆蔻明組顯著或非常顯著的抑瘤效果(P<0.05、0.01、0.001)。
表13 Car-NPs 和小豆蔻明(DMSO)對(duì)HepG2、4T1 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制情況(±s,n = 6)Table 13 Growth inhibition of HepG2 and 4T1 cells by Car-NPs and cardamonin(DMSO)(±s,n = 6)
表13 Car-NPs 和小豆蔻明(DMSO)對(duì)HepG2、4T1 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制情況(±s,n = 6)Table 13 Growth inhibition of HepG2 and 4T1 cells by Car-NPs and cardamonin(DMSO)(±s,n = 6)
與同種細(xì)胞的小豆蔻明(DMSO)組比較:*P<0.05 **P<0.01***P<0.001*P < 0.05 **P < 0.01 ***P < 0.001 vs the same cell group of cardamonin(DMSO)group
質(zhì)量濃度/(μg·mL-1)HepG2 細(xì)胞抑制率/% 4T1 細(xì)胞抑制率/%小豆蔻明(DMSO)Car-NPs 小豆蔻明(DMSO)Car-NPs 0.1 1.53±0.69 1.12±0.35 0.17±0.11 1.14±0.76 0.5 4.44±0.87 5.81±0.54 2.20±0.66 4.48±0.09 1.0 6.66±0.82 9.78±0.03 5.57±0.62 9.63±0.76 2.0 9.94±0.74 13.04±1.21** 8.45±0.58 16.99±0.18***5.0 13.4±1.41 19.45±1.45* 11.14±0.69 21.75±0.26***10.0 17.6±0.99 23.10±0.96** 15.51±1.14 27.62±1.23***20.0 23.15±1.00 34.15±0.41*** 26.78±1.06 39.67±0.59***50.0 27.78±2.21 43.78±2.33*** 32.22±1.44 54.14±1.03***100.0 52.20±1.34 69.20±1.48*** 53.11±1.36 72.30±0.57***
通過GraphPad Prism 7 軟件擬合了小豆蔻明和Car-NPs 的IC50曲線并計(jì)算得到IC50值。小豆蔻明游離藥物對(duì)HepG2 細(xì)胞的IC50值為126.4 μg/mL,而Car-NPs 對(duì)HepG2 細(xì)胞殺傷作用提高1.39 倍(IC50值降到52.94 μg/mL);小豆蔻明游離藥物對(duì)4T1細(xì)胞的IC50值為113.2 μg/mL,Car-NPs對(duì)HepG2細(xì)胞殺傷作用提高2.34 倍(IC50值降到33.89 μg/mL)。這可能原因是納米粒子能夠通過非特異性吸附等多種途徑和腫瘤細(xì)胞表面發(fā)生相互作用,并通過被動(dòng)靶向等途徑被細(xì)胞攝取,從而把藥物帶入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部發(fā)揮藥效[24-26]。
小豆蔻明難溶于水,在目前的工作中大多數(shù)研究停留在細(xì)胞層面,有限的體內(nèi)研究也僅涉及藥物配制,如小豆蔻明與阿拉伯膠[27]或CMC-Na[28]的物理混懸液配制。由于物理混懸液尺寸較大,一般在0.5~10 μm,使得藥物顆粒容易聚集,藥物溶出和吸收緩慢、不規(guī)則,且只能口服給藥,使得小豆蔻明的生物利用度較低,限制了小豆蔻明的臨床應(yīng)用。
本研究采用反溶劑蒸發(fā)聯(lián)合高壓均質(zhì)方法,以P188 為穩(wěn)定劑,成功制備了Car-NPs,使得小豆蔻明抗腫瘤效果得到明顯改善。本實(shí)驗(yàn)采用的穩(wěn)定劑P188 為FDA 批準(zhǔn)的可靜脈注射的輔料,且低廉易得,作為兩親性嵌段共聚物,可吸附在納米粒子表面,形成空間位阻,阻礙納米粒子彼此靠近和聚集,從而產(chǎn)生良好的穩(wěn)定作用。
由于NPs 本身是一種熱力學(xué)不穩(wěn)定體系,長(zhǎng)期放置會(huì)出現(xiàn)粒徑變大、聚集甚至沉淀等現(xiàn)象,而冷凍干燥后能將NPs 的結(jié)構(gòu)以固態(tài)的形式“凍結(jié)固化”,便于運(yùn)輸和較長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存,臨用前再加水復(fù)溶。Car-NPs 以1%的PVP 為保護(hù)劑凍干后可長(zhǎng)期保存,復(fù)溶后粒徑幾乎不變,表現(xiàn)出其良好的應(yīng)用前景。原因可能是PVP 是親水性高分子,在納米顆粒間形成親水鏈段的空間位阻,阻礙顆粒間的黏附聚集。在凍干過程中PVP 包圍在納米粒左右,阻止了納米顆粒的聚集和黏附,利于維持空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。
將小豆蔻明制備成Car-NPs 后,由于比表面積的急劇增加,藥物的溶出和釋放度也大幅度增加;體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)表明Car-NPs 顯著提高了小豆蔻明對(duì)4T1 細(xì)胞和HepG2 細(xì)胞的殺傷作用,主要的原因可能是NPs 可以通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞、胞膜窖介導(dǎo)的內(nèi)吞、巨胞飲作用等多種途徑與腫瘤細(xì)胞相互作用,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞攝取,除此之外,以P188為包衣的Car-NPs 可延長(zhǎng)藥物在血液中的滯留時(shí)間,實(shí)現(xiàn)體內(nèi)長(zhǎng)效循環(huán),并提高對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性,從而表現(xiàn)出較原藥更強(qiáng)的腫瘤殺傷作用。
綜上所述,Car-NPs 的成功制備,使小豆蔻明在水相中的藥物質(zhì)量濃度提高到10 mg/mL(原藥溶解度<2.7 μg/mL),同時(shí)滿足po給藥和iv 給藥的要求,有效解決了其難溶和難給藥的問題。本研究做了大量的處方優(yōu)化工作以及體外抗腫瘤活性研究,為小豆蔻明納米制劑的改良提供了參考依據(jù),也為其體內(nèi)研究,尤其在抗腫瘤研究和藥物研發(fā)方面奠定基礎(chǔ)。
利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突