吳 浩，黃蓓蓓，賈志鑫，劉 潔，陳奕君，肖紅斌*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029

2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006

隨著生物學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)等現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子對(duì)接已成為藥物靶點(diǎn)和藥效成分篩選有力的工具，其原理就是利用計(jì)算機(jī)科學(xué)技術(shù)的相應(yīng)的計(jì)算方法模擬分子的空間結(jié)構(gòu)和分子間的相互作用力，通過(guò)研究分子間的空間作用力，尋找配體與受體活性位點(diǎn)的最佳結(jié)合方式的過(guò)程，在藥物的研發(fā)中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用[1-2]。同時(shí)，得益于超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UHPLC-Q-TOF-MS/MS）的發(fā)展及其高分辨率、高靈敏度、高選擇性等優(yōu)勢(shì)，可通過(guò)優(yōu)化超高效液相色譜的色譜柱、流動(dòng)相、洗脫條件等方式，結(jié)合四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜中全面的數(shù)據(jù)采集方法及數(shù)據(jù)后處理分析策略，例如前體離子掃描，關(guān)鍵產(chǎn)物離子鑒別等，實(shí)現(xiàn)中藥單味藥、復(fù)方提取物及體內(nèi)微量成分的準(zhǔn)確高效全面的識(shí)別，為中藥（復(fù)方）成分及其代謝產(chǎn)物的分析及鑒定提供了有效的助力[3-4]。

紫菀為菊科（Compositae）多年生草本植物紫菀Aster tataricusL.f.的干燥根及根莖，別名青菀、返魂草、小辮等，生長(zhǎng)于海拔400～2000 m 的山坡濕地、低山草地及沼澤地等；在我國(guó)分布十分廣泛，主產(chǎn)于山西、河北、東北、內(nèi)蒙古東部等地區(qū)，也分布在朝鮮、日本等國(guó)。紫菀具有宣通肺氣、潤(rùn)腸通便的功效，在臨床上常配伍薏苡仁、桔梗、杏仁、枳殼、葶藶子等使用治療術(shù)后便秘、腸癰等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，紫菀還具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化活性、化痰止咳平喘等作用[5-19]。前期研究發(fā)現(xiàn)紫菀潤(rùn)腸通便的作用機(jī)制與細(xì)胞膜上的M 受體及鈣離子通道有關(guān)[20]，但是對(duì)于紫菀中發(fā)揮作用的確切效應(yīng)成分尚不清楚，需要進(jìn)一步深入的研究。因此，本研究將通過(guò) UHPLC-Q-TOFMS/MS 技術(shù)分析給藥紫菀后的腸道內(nèi)容物成分，針對(duì)與調(diào)節(jié)腸道的運(yùn)動(dòng)及平滑肌的收縮相關(guān)的M2、M3 受體蛋白和其下游信號(hào)通路中的蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）蛋白，采用分子對(duì)接技術(shù)篩選與受體蛋白結(jié)合性較好的中藥單體成分，進(jìn)而闡明紫菀中潤(rùn)腸通便的效應(yīng)成分，為后期的深入研究以及新藥開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

本研究中使用的動(dòng)物方案由北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)（批準(zhǔn)號(hào)No.4-2018010103-10045）基于倫理程序和科學(xué)護(hù)理對(duì)其進(jìn)行審核和批準(zhǔn)。SD大鼠（180～220 g）購(gòu)自北京維通利華動(dòng)物科技有限公司。所有的動(dòng)物均被飼養(yǎng)在恒溫（25±2）℃，相對(duì)濕度（50±10）%和12 h 光/暗周期的環(huán)境下。

乙腈，LC/MS 級(jí)，F(xiàn)isher 公司；甲醇，LC/MS級(jí)，F(xiàn)isher 公司；甲酸，LC/MS 級(jí)，Sigma 公司；去離子水，Milli-Q 水凈化系統(tǒng)自制；對(duì)照品均購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司，色譜純，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%以上。

紫菀藥材購(gòu)自北京同仁堂藥業(yè)有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)王學(xué)勇教授鑒定為紫菀A.tataricusL.f.的干燥根及根莖，藥材（CMAT-AT-201904）存放在北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院中藥分析與轉(zhuǎn)化研究中心。

1.2 樣品的制備

1.2.1 紫菀藥材提取液的制備 紫菀藥材200 g，料液比1∶10，50%的乙醇回流提取2 次，煮沸后，保持微沸1.5 h，用200 目濾布濾過(guò)，合并續(xù)濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（溫度60 ℃、轉(zhuǎn)速45 r/min）旋蒸至無(wú)醇味，得質(zhì)量濃度為0.8 g/mL（生藥量）的紫菀提取液。

1.2.2 腸道內(nèi)容物供試品溶液的制備 SD 大鼠，3只，禁食18 h 后，ig 0.8 g/mL 的紫菀提取液，30 min后，水合氯醛麻醉，取出整段小腸，將腸內(nèi)容物放入15 mL 離心管中，渦旋5 min 混勻，超聲處理15 min，高速離心15 min（12 000 r/min、4 ℃），取上清液；加入4 倍量乙腈沉蛋白，渦旋5 min 后，高速離心15 min（12 000 r/min、4 ℃），取上清液，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜；用真空旋轉(zhuǎn)濃縮儀濃縮至干，50%的甲醇200 μL 復(fù)溶，渦旋5 min 后，高速離心15 min（12 000 r/min、4 ℃），取上清液，稀釋10倍檢測(cè)。

1.3 樣品分析

液相色譜條件：樣品的分離采用ACQUITY UPLC?HSS T3柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm，Waters公司），柱溫箱設(shè)定為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為220、254、275、315 和360 nm；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～1 min，5%B；1～5 min，5%～15% B；5～15 min，15%～30%B；15～23 min，30%～75% B；23～25 min，75%～95%B，，進(jìn)樣體積為2 μL，體積流量為0.4 mL/min。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），正負(fù)離子模式檢測(cè)，詳細(xì)的質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 正、負(fù)離子模式下的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrum parameters in positive and negative ion modes

1.4 分子對(duì)接

1.4.1 小分子配體的準(zhǔn)備 小分子配體是基于“1.3”項(xiàng)中鑒定的腸道內(nèi)容物的化學(xué)成分，通過(guò)TCMSP、Chemspider、Pubchem 等網(wǎng)站查找并下載化合物的結(jié)構(gòu)式，保存為mol 格式。然后利用Chemidraw 14.0軟件優(yōu)化小分子配體的結(jié)構(gòu)，采用MM2 力場(chǎng)進(jìn)行能量最小化，保存為pdb 格式。

1.4.2 受體的準(zhǔn)備 通過(guò)PDB 蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)下載蛋白的三維結(jié)構(gòu)圖，保存為pdb 格式，分辨率為0.3 nm，如圖1所示，為M2 受體、M3 受體和PKC 蛋白的三維結(jié)構(gòu)圖。

圖1 靶標(biāo)蛋白的三維結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Three-dimensional structure diagram of target protein

1.4.3 分子對(duì)接 運(yùn)用SYBYL-X 2.0 軟件將處理過(guò)的小分子配體與蛋白進(jìn)行對(duì)接，首先是設(shè)置文件保存路徑，接著導(dǎo)入對(duì)接的待測(cè)配體小分子，再導(dǎo)出待測(cè)配體小分子，選中所有的化合物，文件格式修改為SLN 格式，然后是處理靶標(biāo)蛋白，提取靶標(biāo)蛋白中與待測(cè)配體小分子相似的配體，同時(shí)移除配體外的其他配體及水分子，最后蛋白和待測(cè)配體小分子均處理完成后進(jìn)行對(duì)接。

1.4.4 作圖分析 首先，運(yùn)用SYBYL-X 2.0 軟件做圖分析，可以得到受體-配體三維結(jié)合模式圖及配體與氨基酸殘基形成的氫鍵作用力圖；然后，運(yùn)用Discovery Studio 4.0 軟件進(jìn)行相關(guān)做圖處理與分析，可以得到二維配體與氨基酸殘基形成的所有作用力圖；最后，分析圖中配體與氨基酸殘基結(jié)合作用力的大小。

2 結(jié)果

2.1 腸道內(nèi)容物成分的鑒定

數(shù)據(jù)使用 Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis B.07.00 軟件處理系統(tǒng)進(jìn)行分析，在一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖中可獲得總離子總離子流圖（total ion chromatogram，TIC）、提取離子流圖（extracted ion chromatogram，EIC）、DAD 色譜圖、母離子及二級(jí)碎片離子等信息，并在此基礎(chǔ)上通過(guò)與文獻(xiàn)報(bào)道的紫菀藥材成分及對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)，在根據(jù)特征碎片離子（如肽類的關(guān)鍵產(chǎn)物離子m/z106.064 9，有機(jī)酸類的關(guān)鍵產(chǎn)物離子m/z191.055 6，黃酮類的關(guān)鍵產(chǎn)物離子m/z153.018 0）、保留時(shí)間和clogP值等輔助鑒定，進(jìn)而推導(dǎo)并確認(rèn)待核查化合物的名稱及結(jié)構(gòu)[21]。利用上述分析方法，共鑒定出28 個(gè)化學(xué)成分，包括14 個(gè)肽類化合物，8 個(gè)有機(jī)酸類化合物，3 個(gè)黃酮類化合物和3 個(gè)香豆素類化合物（圖2 和表2）。圖3 為28 個(gè)化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)式。

圖3 大鼠ig 紫菀提取液后腸道內(nèi)容物中化合物分子結(jié)構(gòu)式Fig.3 Molecular structure formula of compounds in intestinal contents of rats after ig A.tataricus

表2 UHPLC-Q-TOF-MS/MS 鑒定的體內(nèi)腸道內(nèi)容物成分Table 2 Components of intestinal contents identified by UHPLC-Q-TOF-MS/MS

圖2 正、負(fù)離子模式下的提取離子流圖Fig.2 Extraction ion current diagram in positive and negative ion modes

2.2 分子對(duì)接結(jié)果

在本實(shí)驗(yàn)中，配體和受體的結(jié)合穩(wěn)定性主要是基于Total Score 打分函數(shù)，Total Score 函數(shù)考慮了極性作用、疏水作用、焓和溶劑化等因素，TotalScore打分值越高結(jié)合性越好[22]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，本研究對(duì)接結(jié)果選擇Total Score 值大于5 的化合物作為候選的活性成分，進(jìn)行分子作用力的分析。

2.2.1 M2 受體與配體小分子的分子對(duì)接結(jié)果 分子對(duì)接結(jié)果如表3所示，有11 個(gè)化合物表現(xiàn)出良好的結(jié)合活性，Total Score 值均大于5，其中異綠原酸C 的Total Score 值最高，為8.077 8，其次為astin J 和山柰酚。圖4 分別為異綠原酸C、astin J、山柰酚與M2 受體分子對(duì)接結(jié)合模式圖及與氨基酸殘基的相互作用圖。根據(jù)圖4 中3D 和2D 結(jié)合模式圖，進(jìn)一步分析了這些化合物與蛋白質(zhì)的作用關(guān)系發(fā)現(xiàn)，異綠原酸C 與M2 受體的10 個(gè)氨基酸形成范德華力，與13 個(gè)氨基酸形成靜電相互作用，并與108 號(hào)和404 天冬酰胺及426 號(hào)酪氨酸形成3 個(gè)氫鍵；山柰酚與M2 受體的4 個(gè)氨基酸形成范德華力，與12 個(gè)氨基酸形成靜電相互作用，與104 號(hào)和426號(hào)酪氨酸、404 號(hào)天冬酰胺、429 號(hào)半胱氨酸形成4個(gè)氫鍵?；衔锂惥G原酸C 與M2 受體的相互作用力總數(shù)比山柰酚多6 個(gè)，說(shuō)明異綠原酸C 與M2 受體的結(jié)合性強(qiáng)于山柰酚，與表3 中打分值結(jié)果一致。

圖4 異綠原酸C、astin J 和山柰酚與M2 受體分子對(duì)接結(jié)合模式及與氨基酸殘基的相互作用Fig.4 Molecular docking binding pattern diagram and interaction diagram of amino acid residues of isochlorogenic acid C,astin J and kaempferol with M2 receptor

表3 配體與蛋白的分子對(duì)接整體打分值Table 3 Total score of ligand and protein with molecular docking

2.2.2 M3 受體與配體小分子的分子對(duì)接結(jié)果 如表3所示，與M3 受體分子對(duì)接的結(jié)果中Total Score大于5 的有13 個(gè)化合物，Total Score 值排名前3 的分別為asterin F、astin J 和異綠原酸B。圖5 分別為asterin F、astin J、異綠原酸B 與M3 受體分子對(duì)接結(jié)合模式圖及與氨基酸殘基的相互作用圖，從圖中可知，asterin F 與M3 受體的13 個(gè)氨基酸形成范德華力，與11 個(gè)氨基酸形成靜電相互作用，與148號(hào)酪氨酸、152 號(hào)天冬酰胺、238 號(hào)丙氨酸、503 號(hào)色氨酸和507 號(hào)天冬酰胺形成6 個(gè)氫鍵作用，并且與503 號(hào)色氨酸形成σ-π 超共軛和529 號(hào)酪氨酸形成π-π 共軛效應(yīng)；異綠原酸B 與M3 受體的12 個(gè)氨基酸形成范德華力，與11 個(gè)氨基酸形成靜電相互作用，與222 號(hào)異亮氨酸、426 號(hào)天冬酰胺、506 號(hào)酪氨酸和532 號(hào)半胱氨酸形成4 個(gè)氫鍵，并且與506號(hào)酪氨酸形成π-π 共軛效應(yīng)。化合物asterin F 和異綠原酸B 與M3 受體結(jié)合過(guò)程中都形成了共軛效應(yīng)，asterin F 與M3 受體的相互作用力數(shù)總數(shù)大于異綠原酸B，因此，Total Score 值更大，結(jié)合力更強(qiáng)。

圖5 Asterin F、astin J 和異綠原酸B 與M3 受體分子對(duì)接結(jié)合模式及與氨基酸殘基的相互作用Fig.5 Molecular docking binding pattern diagram and interaction diagram of amino acid residues of asterin F,astin J and isochlorogenic acid B with M3 receptor

2.2.3 PKC 蛋白與配體小分子的分子對(duì)接結(jié)果如表3所示，與PKC 蛋白分子對(duì)接的結(jié)果中Total Score 值大于5 的有23 個(gè)化合物，Total Score 值排名前3 的分別為astin J、異綠原酸C 和astin E。根據(jù)圖6 可得，astin J 與PKC 的10 個(gè)氨基酸形成范德華力，與13 個(gè)氨基酸形成靜電相互作用，與253號(hào)精氨酸、256 號(hào)酪氨酸、257 號(hào)丙氨酸、289 號(hào)色氨酸、293 號(hào)谷氨酸、371 號(hào)賴氨酸和387 號(hào)天冬氨酸形成9 個(gè)氫鍵；Astin E 與PKC 的6 個(gè)氨基酸形成范德華力，與11 個(gè)氨基酸形成靜電相互作用，與氨基酸殘基形成7 個(gè)氫鍵。在與PKC 蛋白對(duì)接中發(fā)現(xiàn)，astin J、異綠原酸C 和astin E 與PKC 蛋白的氫鍵作用力較多，Total Score 打分值更高。

圖6 Astin J、異綠原酸C 和astin E 與PKC 蛋白分子對(duì)接結(jié)合模式及與氨基酸殘基的相互作用Fig.6 Molecular docking binding pattern diagram and interaction diagram of amino acid residues of astin J,isochlorogenic acid C and astin E with PKC protein

3 討論

便秘是一種常見(jiàn)的消化系統(tǒng)疾病，便秘的調(diào)節(jié)與分布在腸道上的神經(jīng)遞質(zhì)與其受體密切相關(guān)，腸道上分布有多種神經(jīng)遞質(zhì)，如Ach、NE、5-HT 等，這些神經(jīng)遞質(zhì)釋放后，通過(guò)突觸間隙，直接與其特異性受體結(jié)合發(fā)揮生理效應(yīng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)腸道的運(yùn)動(dòng)和分泌[23-25]。目前認(rèn)為，與Ach 結(jié)合的M 受體和Ca2+通道在便秘的發(fā)生中起主要的作用，M 受體分為M1、M2、M3、M4、M5 5 個(gè)亞型，但是研究發(fā)現(xiàn)M2 和M3 受體亞型在調(diào)節(jié)腸道的運(yùn)動(dòng)及平滑肌的收縮中起著更重要的作用[26]，同時(shí)，PKC 蛋白作為Ca2+通道調(diào)控機(jī)制的下游蛋白，其可被細(xì)胞質(zhì)中的Ca2+激活，從而發(fā)揮調(diào)控腸道運(yùn)動(dòng)的作用[27]。前期研究也發(fā)現(xiàn)紫菀潤(rùn)腸通便的作用機(jī)制與細(xì)胞膜上的M 受體及Ca2+通道相關(guān)[20]，但是對(duì)于紫菀中潤(rùn)腸通便的效應(yīng)物質(zhì)尚不明確，因此，本研究采用M受體中與調(diào)節(jié)腸道的運(yùn)動(dòng)及平滑肌的收縮密切相關(guān)的M2、M3 受體亞型蛋白和Ca2+依賴性的PKC 蛋白作為靶標(biāo)蛋白，通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)與給藥紫菀后的腸道內(nèi)容物成分進(jìn)行對(duì)接，篩選出紫菀中潤(rùn)腸通便的活性成分。結(jié)果表明，腸道內(nèi)容物中含有28個(gè)紫菀中的化學(xué)成分，經(jīng)分子對(duì)接篩選出astin J、asterin F、asterin A、異綠原酸C、異綠原酸A、異綠原酸B、綠原酸、槲皮素、山柰酚和木犀草素共10 個(gè)成分均可與M2 受體、M3 受體及PKC 蛋白體現(xiàn)出良好的分子對(duì)接活性，其中astin J 與3 種靶標(biāo)蛋白的Total Score 值的平均值最高，且以上10 種活性成分與3 種靶蛋白的對(duì)接區(qū)域和內(nèi)源性配體的結(jié)合位置基本相同。目前，已有文獻(xiàn)報(bào)道槲皮素通過(guò)調(diào)節(jié)M 受體及其下游信號(hào)PKC 蛋白的表達(dá)發(fā)揮治療洛哌丁胺所致的便秘[28]，在本研究篩選出的10個(gè)活性成分中，有7 個(gè)成分與3 種靶標(biāo)蛋白結(jié)合的平均打分值強(qiáng)于槲皮素，這也保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。因此，推測(cè)以上10 個(gè)潛在的化合物可能是治療便秘的最主要的活性成分，這也契合了中藥多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)，但是對(duì)于這些成分確切的治療效果還需要進(jìn)一步用細(xì)胞或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究紫菀通便的活性提供一定的理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突