錢家連，李迎超，許慧慧，王 茜，秦愛麗，任俊杰，王利兵，于海燕

（1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)研究所 國家林業(yè)和草原局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091；2.河北邢臺市信都區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北 邢臺 054000；3.中國林業(yè)科學(xué)研究院 森林生態(tài)環(huán)境與自然保護(hù)研究所，北京 100091；4.河北省洪崖山國有林場，河北 易縣 074200）

扦插繁殖是無性繁殖的重要技術(shù)手段之一，操作簡單，應(yīng)用廣泛，后代很好地保持了親本的優(yōu)良遺傳性狀，但受母樹年齡影響較大。對雙色櫟Quercus bicolor、使君子Quisqualis indiaca及水黃皮Pongamia pinnata等樹種的研究發(fā)現(xiàn)[1?3]：誘導(dǎo)插穗產(chǎn)生不定根是植物扦插成功的關(guān)鍵，隨著母樹年齡的增加，林木插穗生根能力出現(xiàn)下降，插穗生根率隨母樹年齡的增加逐漸降低[4?5]。解剖結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)：不同年齡母樹的插穗組織結(jié)構(gòu)不同；植物開花度過幼年期后進(jìn)入到成年期，是生理老化的開始，植物內(nèi)部生根抑制物質(zhì)增加，生根促進(jìn)物質(zhì)減少，再生作用降低、生活力下降[6]。一般來說，幼年期是無性繁殖采條的最佳時(shí)期。扦插生根過程中，吲哚乙酸氧化酶(IAAO)通過影響內(nèi)源生長素(IAA)氧化及含量的變化來影響生根[7]，過氧化物酶(POD)活性升高被認(rèn)為是誘導(dǎo)生根啟動的信號，多酚氧化酶(PPO)在根起始階段與酚類的代謝有關(guān)[8]。栓皮櫟Quercus variabilis是殼斗科Fagaceae櫟屬Q(mào)uercus植物，是中國重要的珍貴用材樹種，經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值極高[9?10]。近年來，學(xué)者利用扦插繁殖對栓皮櫟嫩枝扦插進(jìn)行了相關(guān)研究[11?12]，但對不同母樹年齡的栓皮櫟扦插生根研究報(bào)道并不多。本研究以1年生、5年生及10年生栓皮櫟母樹的半木質(zhì)化嫩枝為插穗材料，測定插穗的生根率、生根數(shù)量、根直徑和根長等特征變化，觀察不同時(shí)期插穗莖段的組織結(jié)構(gòu)和酶活性變化，旨在揭示不同母樹年齡栓皮櫟不定根誘導(dǎo)形成的相關(guān)機(jī)制，為不同年齡栓皮櫟的扦插繁殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

栓皮櫟扦插繁殖試驗(yàn)在中國林業(yè)科學(xué)研究院科研溫室進(jìn)行。該溫室頂部設(shè)有天窗和遮陽網(wǎng)，室內(nèi)有風(fēng)扇和濕簾。扦插期間室溫為25～31 ℃，相對空氣濕度≥85%，晴天9:00—11:00的光合有效輻射為800 μmol·m?2·s?1，二氧化碳 (CO2)摩爾分?jǐn)?shù)約 380 μmol·mol?1[13]。試驗(yàn)苗床為南北走向，規(guī)格 21.0 m×1.5 m，試驗(yàn)時(shí)間為2019年7—9月。

1.2 方法

1.2.1 插穗來源 2019年7月16日分別在中國林業(yè)科學(xué)研究荒漠化研究所1年生、5年生和10年生的栓皮櫟母樹上采集樹冠中下部生長勢良好、無病蟲害的當(dāng)年生嫩枝。將嫩枝修剪為8～10 cm的插穗，每個(gè)插穗頂端保留1～2個(gè)葉片，每個(gè)葉片保留1/3面積；每個(gè)插穗預(yù)留2～3個(gè)腋芽，插穗枝的頂端在距上端芽1 cm處平切，底端斜切。

1.2.2 扦插基質(zhì) 珍珠巖和泥炭按體積比7∶3配制成基質(zhì)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%高錳酸鉀滅菌后裝入輕基質(zhì)無紡布育苗袋中，育苗袋高9.0 cm，上下內(nèi)徑均為3.8 cm。

1.2.3 插穗處理 參照 ABT 生根粉使用說明，以 200 mg·L?1植物生長調(diào)節(jié)劑 ABT-1 號 (北京艾比蒂生物科技有限公司)浸泡2 h處理插穗。①解剖結(jié)構(gòu)觀察試驗(yàn)。以1年生、5年生和10年生插穗為試驗(yàn)材料，各年齡母樹的插穗設(shè)置3次重復(fù)，各重復(fù)45個(gè)插穗，共135個(gè)。②酶活性測定試驗(yàn)。各年齡母樹的插穗設(shè)置3次重復(fù)，各重復(fù)150個(gè)插穗，共450個(gè)。③生根率統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)。各年齡母樹的插穗設(shè)置3次重復(fù)，各重復(fù)105個(gè)插穗，共315個(gè)。所有年齡處理共900個(gè)插穗，采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，在相對一致的環(huán)境下，進(jìn)行統(tǒng)一浸泡處理。

1.2.4 扦插與管理 扦插前用小棒在基質(zhì)內(nèi)引孔，深度為2～3 cm。每個(gè)容器扦插1根插穗。扦插后用小棒將插穗周邊的基質(zhì)稍加壓實(shí)，澆透水，將容器擺放在塑料托盤中。扦插完成后在插床搭建高約45 cm白色塑料薄膜拱棚，扦插基質(zhì)濕度保持為55%～65%，拱棚內(nèi)相對空氣濕度保持為85%以上，天氣晴朗時(shí)插穗上方30 cm處覆蓋50%遮陽網(wǎng)。

1.2.5 插穗生根指標(biāo)統(tǒng)計(jì) 扦插60 d后，統(tǒng)計(jì)各處理的生根株數(shù)和每個(gè)插穗的生根數(shù)量，測量各插穗不定根的直徑與長度。計(jì)算扦插生根率(%)。從各處理已生根插穗中隨機(jī)抽取5個(gè)插穗，計(jì)算平均不定根數(shù)量、不定根長及不定根直徑。

1.2.6 插穗解剖結(jié)構(gòu)觀察 栓皮櫟生根過程中，扦插前進(jìn)行第1次取樣，每個(gè)處理隨機(jī)取3根插穗，重復(fù)取樣3次，取其基部2～3 cm莖段部分。10 d后再次取樣，之后隔7 d取樣1次，直到9月1日結(jié)束取樣工作。所有樣品均保存在FAA溶液(V甲醛∶V冰醋酸∶V70%酒精=1∶1∶18) 里，抽真空。常規(guī)石蠟切片，切片厚度為10～12 μm，甲苯胺藍(lán)染色，在光學(xué)顯微鏡(Olympus BX51)下觀察插穗基部組織結(jié)構(gòu)并拍照。

1.2.7 插穗酶活性的測定 栓皮櫟生根過程中，扦插前第 1 次取樣，取其基部 3～4 cm 范圍內(nèi)的韌皮部，每次取樣10根，設(shè)置3次重復(fù)，用錫箔紙包好后放入液氮中，再轉(zhuǎn)移至?80℃冰箱進(jìn)行保存；10 d后再次取樣，之后7 d取樣1次，直至9月1日結(jié)束。參考李墨野[14]和劉俊芳[15]方法測定樣品PPO和POD活性，參考王小虎[16]測量IAAO活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用單因素方差分析和Duncan法進(jìn)行多重比較，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 栓皮櫟生根表型觀察及生根率情況

由圖1可知：栓皮櫟生根部位為插穗基部，不定根從皮層長出。1年生栓皮櫟嫩枝插穗在扦插17 d后發(fā)現(xiàn)白色不定根突出(圖1A1)，31 d不定根形成(圖1A2)，38 d不定根由白色發(fā)育為褐色，并出現(xiàn)根伸長的現(xiàn)象(圖1A3)，44 d不定根數(shù)目增多(圖1A4)。5年生栓皮櫟嫩枝插穗在扦插44 d才發(fā)現(xiàn)白色的不定根形成(圖1B4)，此前的插穗葉子長勢良好，插穗頂部有愈傷組織形成。10年生栓皮櫟插穗在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間未見不定根形成，且葉子逐漸干枯，部分插穗變黑，直至死亡(圖1C4)。

圖1 不同年齡栓皮櫟母樹插穗在生根期間的外部形態(tài)Figure 1 External morphological of mother cuttings of Q.variabilis at different ages during rooting

從表1可以看出：栓皮櫟嫩枝扦插生根率及其根系特征存在明顯的年齡效應(yīng)。栓皮櫟嫩枝扦插生根率和平均不定根數(shù)量從多到少依次均為1年生、5年生、10年生，各年齡插穗差異顯著(P＜0.05)，平均不定根長和根直徑從大到小依次均為5年生、1年生、10年生，各年齡插穗差異顯著(P＜0.05)。

表1 栓皮櫟不同年齡母樹插穗的生根情況Table 1 Rooting of cuttings of Q.variabilis mother tree at different ages

2.2 栓皮櫟插穗組織解剖結(jié)構(gòu)特征的變化

解剖學(xué)觀察(圖2)可知：插穗基部由外向內(nèi)依次為表皮、皮層、厚壁組織、韌皮部、形成層及木質(zhì)部等。扦插0 d時(shí)3個(gè)年齡的栓皮櫟厚壁組織寬度不一，表現(xiàn)為5年生和10年生較大，1年生較小(圖2A1、圖2B1和圖2 C1)。1年生栓皮櫟嫩枝扦插生根約需44 d，經(jīng)歷誘導(dǎo)期—表達(dá)期—形成期—伸長期等階段；5年生栓皮櫟嫩枝扦插44 d后插穗生根才進(jìn)入形成期，而10年生栓皮櫟嫩枝則一直處于誘導(dǎo)期，未發(fā)生生根跡象。1年生和5年生栓皮櫟嫩枝最終都形成了不定根，其根原基是在不定根形成后期產(chǎn)生，由此判斷栓皮櫟根原基為誘生型。1年生栓皮櫟嫩枝扦插10 d時(shí)，插穗沒有發(fā)現(xiàn)根原基的存在，處于不定根誘導(dǎo)期(圖2A2)；扦插17 d后靠近表皮位置出現(xiàn)不定根，此時(shí)為不定根表達(dá)期(圖2A3)；扦插31 d后不定根明顯形成，此時(shí)為不定根形成期。不定根主要由靠近形成層附近的薄壁細(xì)胞分化而來，依次向外突破韌皮部、厚壁組織、皮層及表皮(圖2A4)。扦插44 d后，不定根向外延伸，處于伸長階段(圖2A5)。5年生栓皮櫟嫩枝扦插44 d后不定根出現(xiàn)，其由維管形成層附近的薄壁細(xì)胞分化而來，向外伸展，處于不定根的形成期(圖2B5)。10年生栓皮櫟嫩枝在整個(gè)生根過程中插穗基部的組織沒有任何明顯變化。

圖2 1年生、5年生及10年生栓皮櫟解剖學(xué)結(jié)構(gòu)觀察Figure 2 Anatomical structure of 1, 5 and 10-year-old Q.variabilis

2.3 栓皮櫟插穗酶活性的變化

不同年齡栓皮櫟嫩枝生根過程中的POD、PPO及IAAO活性變化規(guī)律存在差異。由圖3可知：不同年齡插穗POD活性水平1年生和5年生要高于10年生；PPO活性水平從大到小依次為1年生、5年生、10年生；扦插17 d之前IAAO活性水平10年生大于5年生和1年生，17 d后從大到小依次為1年生、5年生、10年生。1年生和5年生插穗POD活性整體呈先上升后下降的單峰趨勢，1年生在扦插17 d時(shí)達(dá)到峰值；5年生在扦插31 d時(shí)達(dá)到峰值，此時(shí)插穗都處于不定根的表達(dá)期(圖2 A3、圖2B4)。10年生插穗POD活性呈先下降后上升的趨勢，在扦插17 d時(shí)達(dá)最低值。

圖3 栓皮櫟扦插生根過程中酶活性變化Figure 3 Changes of enzyme activities during the rooting process of Q.variabilis cuttings

1年生插穗的PPO活性呈先上升后下降的單峰趨勢，在扦插17 d時(shí)出現(xiàn)峰值，此時(shí)PPO活性顯著高于5年生和10年生插穗；5年生插穗的PPO活性則出現(xiàn)了雙峰趨勢，最大值出現(xiàn)在扦插31 d時(shí)，此時(shí)PPO活性與1年生插穗差異不顯著，卻顯著高于10年生插穗；10年生插穗的PPO活性整體變化趨勢不明顯。

1年生和5年生插穗的IAAO活性整體上呈先上升后下降的單峰趨勢，在扦插31 d時(shí)出現(xiàn)峰值，1年生IAAO活性顯著高于5年生和10年生。此時(shí)1年生栓皮櫟進(jìn)入不定根形成期(圖2 A4)，5年生進(jìn)入不定根表達(dá)期(圖2 B4)。10年生插穗IAAO活性整體變化呈現(xiàn)先下降后上升趨勢。

3 討論

3.1 栓皮櫟母樹年齡對插穗生根率的影響

本研究發(fā)現(xiàn)：1年生和5年生栓皮櫟扦插均產(chǎn)生了不定根，10年生無不定根；插穗生根率從高到低依次為1年生、5年生、10年生，且差異顯著?？梢娭参锊逅氲哪笜淠挲g越小，不定根形成時(shí)間越短，生根率也越高。原因可能是母本年齡越小，代謝更加活躍，酶活性含量會增加，POD活性增加有利于增加細(xì)胞壁的強(qiáng)度[17]，能更好地抵御病原體入侵，有助于插穗生根，這與十月櫻Prunus subhirtella‘Autumnalis’和夏櫟Quercus robur的研究類似[4, 18]。母樹年齡越大，插穗的組織分化程度會更高，進(jìn)行再分化的能力下降[19]；而隨著年齡增加，韌皮纖維厚度會加大，韌皮纖維細(xì)胞壁厚，會增加生根的機(jī)械阻力[20]，這些都會影響不定根的生成。

3.2 栓皮櫟插穗不定根的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)變化特征

對插穗組織解剖結(jié)構(gòu)的觀察發(fā)現(xiàn)：栓皮櫟的不定根根原基是在生根過程中形成的，由此判定栓皮櫟根原基類型為誘生型。通常來說，誘生型根原基的出現(xiàn)需要一定時(shí)間，導(dǎo)致植物插穗難以生根[20]，這可能是栓皮櫟插穗生根難的原因之一。栓皮櫟插穗的皮層和韌皮部間存在連續(xù)的環(huán)狀厚壁組織，觀察發(fā)現(xiàn)5年生和10年生厚壁組織的寬度大于1年生，這可能也是造成栓皮櫟5年生和10年生生根率低的原因。在沙棘Hippophae rhamnoide[21]及冬青l(xiāng)lex×altaclerensis‘Belhica Aurea’[22]扦插繁殖過程中也發(fā)現(xiàn)厚壁組織的存在和生根率不高存在一定相關(guān)性。

3.3 酶活性對栓皮櫟插穗生根的影響

POD、PPO和IAAO的活性與不定根形成關(guān)系密切[7]。扦插前POD活性升高，可以保護(hù)插穗免受活性氧自由基的侵害[12]。高活性POD有利于細(xì)胞分化產(chǎn)生不定根[23]，1年生和5年生插穗在不定根表達(dá)期POD活性出現(xiàn)峰值，使得插穗內(nèi)的IAA含量降低，從而有助于不定根的形成[24]。隨后POD活性開始下降，至不定根伸長期后又開始升高。10年生插穗則出現(xiàn)先下降后上升的趨勢，其POD活性在扦插下降，預(yù)示其對插穗保護(hù)效果下降，自由基及活性氧對插穗細(xì)胞侵害加大，不利于不定根的形成。

PPO可以催化酚類物質(zhì)，在根原基誘導(dǎo)和發(fā)育過程中起至關(guān)重要作用[25]。本研究中1年生栓皮櫟生根過程中PPO活性呈單峰趨勢，在扦插17 d(不定根表達(dá)期)出現(xiàn)峰值，此時(shí)高活性的PPO有助于催化酚類物質(zhì)與IAA形成生根輔助因子“IAA-酚酸復(fù)合物”，以此促進(jìn)生根[26?27]。5年生栓皮櫟生根過程PPO活性水平呈雙峰趨勢，扦插31 d(形成期)，峰值明顯大于扦插第10 d(誘導(dǎo)期)。誘導(dǎo)期(10 d)時(shí)插穗的切口暴露在外，高水平PPO活性可降低其被細(xì)菌侵害的可能[28]；至不定根形成期(31 d)，插穗需要更高的PPO活性來形成生根輔助因子促進(jìn)生根。10年生的PPO活性整體趨勢變化不明顯，這可能是其難生根的原因。

IAAO通過調(diào)節(jié)內(nèi)源IAA的水平來影響不定根的形成。1年生和5年生IAAO活性均呈現(xiàn)單峰趨勢，且1年生的IAAO活性顯著高于5年生。IAAO活性升高有助于消除插穗體內(nèi)多余的IAA[29]，利于生根誘導(dǎo)[30]。10年生插穗IAAO的酶活性整體上趨勢變化不大，并且在31 d出現(xiàn)下降的趨勢，使得IAAO活性降低，內(nèi)源IAA水平過高，導(dǎo)致生根率低。

總體上，1年生和5年生插穗在不定根表達(dá)期不定根開始形成，這時(shí)的POD和PPO活性最高；1年生IAAO活性低，5年生IAAO活性偏高，導(dǎo)致插穗體內(nèi)IAA被大量降解，最終影響生根率。同時(shí)，ABT屬于外源激素，對內(nèi)源激素也會產(chǎn)生影響，所以IAAO活性也會受到一定影響。

4 結(jié)論

母樹年齡影響插穗不定根的生成，栓皮櫟嫩枝扦插生根率和平均不定根數(shù)量從高到低依次為1年生、5年生、10年生，平均生根率1年生為92.69%，5年生為10.79%，10年生為0。栓皮櫟的生根類型為皮部生根型，其根原基屬于誘生型根原基，不定根主要由靠近形成層附近的薄壁細(xì)胞分化而來，最終突破韌皮部、厚壁組織、皮層及表皮向外伸長，但皮層與韌皮部中間存在的連續(xù)環(huán)狀厚壁組織對不定根的形成有一定的阻礙作用。POD活性增加有利于增加細(xì)胞壁強(qiáng)度，使植物能更好地抵御病菌，有助于插穗生根；PPO活性增加能促進(jìn)生根輔助因子“IAA-酚酸復(fù)合物”的形成，IAAO活性增加有助于減少體內(nèi)IAA含量，較低質(zhì)量濃度的IAA有助于促進(jìn)生根；栓皮櫟插穗1年生和5年生POD、PPO及IAAO活性整體呈現(xiàn)“先上升后下降”趨勢，POD和PPO活性升高有利于不定根的表達(dá)，IAAO活性升高有助于不定根的生成。