曾瓊?cè)郑?劉澤峰， 王文娟， 黃雪蓮， 黎鳳炎， 夏雨艷， 張 國

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的發(fā)病率和病死率在國內(nèi)外均呈上升趨勢[1-2]，其中超過半數(shù)的病例發(fā)生在我國。HCC的治療受到較多局限性，除了患者確診較晚外，還與HCC的異質(zhì)性、化療耐受等特點相關(guān)。索拉非尼(sorafenib)作為一種酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors，TKI)，長期以來一直是唯一被批準用于晚期HCC治療的藥物，但大多數(shù)患者顯示出原發(fā)性或獲得性耐藥，使其療效受限[3]。近年，也有其他多激酶抑制劑(樂伐替尼、卡博替尼、瑞戈非尼)、人單克隆抗體(雷莫蘆單抗)和免疫檢查點抑制劑(納武單抗、派姆單抗)被批準用于全身治療[4-6]。但盡管如此，患者的中位生存期并未顯著增加[7]。因此，迫切需要了解HCC索拉非尼耐藥性的分子機制，以提高當前藥物的療效，并開發(fā)更有效的藥物。為此，本課題組在體外成功構(gòu)建了兩種耐索拉非尼肝癌細胞株，并對索拉非尼的耐藥機制進行了探索，為HCC治療提供理論模型和基礎。

1 材料與方法

1.1主要實驗試劑 索拉非尼(MCE，HY-10201)，高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco，C11995500BT)，澳洲胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS；Gibco，10099-141)，青鏈霉素(penicillin-streptomycin，PS；索萊寶，PI400-100)，CCK8試劑盒(MCE，HY-K0301)，Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒(賽默飛，88-8005-72)，TRIzol(賽默飛，15596-026)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(莫納，MR05101)，SYBR Green qPCRMix(莫納，MQ10301S)。兔單克隆一抗：caspase-3、自噬受體蛋白P62、LC3、β-actin(Abcam公司)。山羊抗兔二抗(Affinity公司)。PCR所用引物均由上海生工設計。

1.2野生型HCC細胞株HepG2、Huh7的培養(yǎng) 野生型人肝癌細胞株HepG2、Huh7，購自中國科學院上海細胞所，以含10% FBS+1% PS的DMEM培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件設置為37 ℃、5% CO2。

1.3耐索拉非尼人肝癌細胞株的建立 采用濃度遞增法構(gòu)建耐藥株，具體流程如下：穩(wěn)定培養(yǎng)野生型人肝癌細胞株HepG2、Huh7至P3代，密度達30%時進行傳代，貼壁后加入含3 μM索拉非尼的完全培養(yǎng)基(含15% FBS)。培養(yǎng)3 d后更換為不含索拉非尼的完全培養(yǎng)基，待細胞長滿后，再次以30%進行傳代。細胞貼壁后加入4 μM索拉非尼，培養(yǎng)3 d后更換成不含索拉非尼的完全培養(yǎng)基，待細胞長滿再次以30%進行傳代。細胞貼壁后加入5 μM索拉非尼，培養(yǎng)3 d后更換成不含索拉非尼的完全培養(yǎng)基。待細胞長滿后再以30%進行傳代。以此類推，直至加入含10 μM索拉非尼的完全培養(yǎng)基經(jīng)3 d培養(yǎng)細胞可長滿。之后以含5 μM的索拉非尼的完全培養(yǎng)基維持培養(yǎng)1個月以上，所得細胞株即耐索拉非尼人肝癌細胞株(HepG2-SR和Huh7-SR)，以含15% FBS+1% PS的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，并用于后續(xù)實驗。

1.4CCK8實驗方法 取對數(shù)生長期細胞株HepG2、Huh7、HepG2-SR和Huh7-SR，以5 000 cells/孔接種至96孔板，培養(yǎng)過夜，更換含梯度濃度索拉非尼(2.5、5.0、10.0、20.0 μM)的完全培養(yǎng)基，另設等體積不加藥物處理的陰性對照組和空白對照組，每組3個復孔。培養(yǎng)24 h后，小心吸棄舊培養(yǎng)基，然后向每個孔加入90 μl的10 % FBS DMEM和10 μl的CCK8試劑，37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育3 h。應用酶標儀檢測每個孔450 nm處的吸光度值(OD值)。細胞存活率=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.5細胞形態(tài)學觀察 將細胞接種于6 cm培養(yǎng)皿中，密度為2×105cells/孔，在附有電荷耦合原件圖像傳感器的顯微鏡下觀察細胞輪廓和形態(tài)，并拍照記錄。

1.6流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 按照Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒說明書進行細胞凋亡檢測。取生長良好的細胞株HepG2、Huh7、HepG2-SR和Huh7-SR接種至6孔板中，貼壁后以5 μM索拉非尼干預24 h，收獲細胞并用PBS洗滌2次，采用胰酶消化細胞，室溫下1 000 r/min離心5 min，吸棄上清液。每管加入2 ml PBS，重懸洗滌細胞，再次離心(1 000 r/min，5 min)吸棄上清液。用1×binding buffer緩沖液洗滌、離心1次后每管加入1×binding buffer溶液400 μl、AnnexinⅤ-FITC 5 μl，室溫下避光染色10～15 min。上機前5 min加入5 μl PI染色5min，再補加200 μl 1×binding buffer溶液，2～8 ℃避光孵育約2 h，應用流式細胞儀進行分析檢測。

1.7Western blot實驗 取生長良好的細胞株HepG2、Huh7、HepG2-SR和Huh7-SR接種至6孔板中，貼壁后以5 μM索拉非尼干預24 h，應用RIPA裂解液提取細胞總蛋白。電泳后將SurePAGE凝膠上的條帶轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜，在室溫下用5%脫脂奶粉液封閉2 h，用TBST洗膜3次，5 min/次。在4 ℃下孵育一抗過夜，TBST洗滌3次，8 min/次。室溫下孵育二抗1 h，用TBST洗滌3次，10 min/次。應用增強化學發(fā)光檢測系統(tǒng)掃描，以β-actin為內(nèi)參計算目標蛋白的相對表達量。

1.8實時熒光定量RT-PCR 取生長良好的細胞株HepG2、Huh7、HepG2-SR和Huh7-SR接種至6孔板中，貼壁后以5 μM索拉非尼干預24 h。通過TRIzol法提取細胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作步驟將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以cDNA為模板進行實時熒光定量RT-PCR，反應體系為：MonAmp GreenTMqPCR Mix 10 μl，上下引物各0.4 μl，dH2O 7.2 μl，cDNA 2 μl。反應程序：95 ℃預變性30 s；90 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s擴增40個循環(huán)。所用引物序列見表1。以GAPDH為內(nèi)參，應用2-△△Ct法計算目標因子的相對表達量。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1索拉非尼耐藥細胞株的構(gòu)建結(jié)果 CCK8實驗結(jié)果顯示，索拉非尼對HepG2-SR、HepG2、Huh7-SR、Huh7細胞株均有抑制作用，且隨著干預藥物濃度升高，細胞存活率逐漸降低。經(jīng)索拉非尼干預24 h后計算4組細胞株的半數(shù)抑制濃度(half inhibitory concentration,IC50)，結(jié)果顯示，HepG2-SR細胞的IC50顯著高于HepG2細胞[(15.74±0.38)μM vs (7.27±0.44)μM；t=5.450，P<0.001]；Huh7-SR細胞的IC50顯著高于Huh7細胞[(11.73±0.27)μM vs (4.92±0.31)μM；t=4.807，P<0.001]。提示索拉非尼耐藥細胞株構(gòu)建成功。見圖1。

?不同濃度索拉非尼干預下HepG2-SR、HepG2細胞的存活率對比；?不同濃度索拉非尼干預下Huh7-SR、Huh7細胞的存活率對比；?HepG2-SR與HepG2細胞株對索拉非尼的IC50比較；?Huh7-SR與Huh7細胞株對索拉非尼的IC50比較；*P<0.05圖1 CCK8實驗結(jié)果圖

2.2索拉非尼耐藥細胞與野生型細胞的形態(tài)比較

在倒置顯微鏡下可見索拉非尼耐藥細胞株的形態(tài)與野生型細胞株比較發(fā)生了明顯變化，HepG2呈上皮樣的片狀形態(tài)，而HepG2-SR形態(tài)上呈明顯的梭形；Huh7呈上皮樣，而Huh7-SR細胞邊緣也呈現(xiàn)出不規(guī)則的擴張。見圖2。

圖2 四組細胞光學顯微鏡下所見(×200)

2.3索拉非尼耐藥細胞與野生型細胞的遷移能力比較 細胞劃痕實驗結(jié)果顯示，與0 h時間點為對照，48 h后觀察到索拉非尼耐藥細胞的遷移愈合速率比野生株更快，提示索拉非尼耐藥細胞的遷移能力更強。見圖3。

圖3 細胞劃痕實驗結(jié)果圖(×100)

2.4索拉非尼耐藥細胞與野生型細胞的凋亡率及caspase-3蛋白表達水平比較 流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，經(jīng)5 μM索拉非尼干預24 h后，索拉非尼耐藥細胞的細胞凋亡率均顯著低于其野生型細胞[HepG2-SR vs HepG2：(6.07±0.12)% vs (9.53±0.18)%；t=12.860，P=0.002。Huh7-SR vs Huh7：(8.52±0.20)% vs (14.71±0.33)%；t=10.005，P=0.008]。見圖4?。另外，Western blot實驗結(jié)果顯示，HepG2-SR細胞和Huh7-SR細胞的caspase-3的蛋白表達水平也分別低于HepG2細胞和Huh7細胞(t=3.980，P=0.016；t=5.497，P=0.005)。見圖4?。提示耐藥細胞的抗索拉非尼凋亡能力比野生細胞更強。

?流式細胞術(shù)實驗結(jié)果；?Western blot實驗結(jié)果；*P<0.05圖4 索拉非尼耐藥細胞和野生型細胞的凋亡率及caspase-3蛋白表達水平比較圖

2.5索拉非尼耐藥細胞與野生型細胞的自噬相關(guān)因子表達水平比較 實時熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，相比于野生型細胞HepG2、Huh7，HepG2-SR細胞和Huh7-SR細胞的P62 mRNA表達水平更低，LC3 mRNA表達水平均更高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Western blot實驗結(jié)果也顯示，相比于野生型細胞HepG2、Huh7，HepG2-SR細胞和Huh7-SR細胞的P62蛋白表達水平更低，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化增加，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的相對表達量升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示耐藥細胞比野生型細胞具有更高的自噬水平，HCC的索拉非尼耐藥機制可能與自噬途徑有關(guān)。見圖5。

?實時熒光定量RT-PCR實驗結(jié)果；?Western blot實驗結(jié)果；*P<0.05圖5 索拉非尼耐藥細胞與野生型細胞的自噬相關(guān)因子表達水平比較圖

3 討論

3.1HCC仍是全球常見癌癥相關(guān)死亡病因之一。近年來，免疫轉(zhuǎn)化治療在中晚期HCC患者中有重大突破[8]。索拉非尼作為靶向多種TKI(血管內(nèi)皮生長因子受體、血小板衍生生長因子受體、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族)的抑制劑，可作用于眾多靶點以抑制癌細胞增殖和腫瘤血管生成，可有效降低HCC患者的死亡率[9]。然而，臨床試驗表明只有約30%的患者對索拉非尼敏感，并且由于對索拉非尼耐藥，HCC通常會在6個月內(nèi)進展[10]。因此，建立索拉非尼耐藥模型有助索于拉非尼耐藥機制的研究，以開發(fā)能夠增強HCC對索拉非尼敏感性的方法。

3.2本研究通過濃度遞增法成功構(gòu)建了HepG2-SR、Huh7-SR兩種耐索拉非尼肝癌細胞系；CCK8、流式細胞術(shù)實驗結(jié)果表明，野生型和耐藥細胞株均對索拉非尼有劑量依賴性，并且相較于野生型細胞株，耐藥細胞株具有更強的遷移性、抗抑制性、抗凋亡等特點，提示耐藥細胞株HepG2-SR、Huh7-SR構(gòu)建成功。這也說明臨床中長期使用索拉非尼治療的HCC患者在治療后期容易出現(xiàn)耐藥性，從而影響抗癌效果。CCK8實驗結(jié)果顯示，HepG2-SR和Huh7-SR對索拉非尼的IC50分別為(15.74±0.38)μM和(11.73±0.27)μM，相較于李明遠等[11]構(gòu)建的耐藥細胞模型具有更強的耐藥性。

3.3在腫瘤細胞耐藥性鑒定中，耐藥相關(guān)蛋白鑒定也是其中之一。P-糖蛋白是一種多藥轉(zhuǎn)運蛋白，在腫瘤多藥耐藥性(multidrug resistance，MDR)中起主要作用。ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白G2(ATP binding cassette transporter G2，ABCG2)是ATP結(jié)合盒超家族成員之一，也是一種P-糖蛋白。有研究發(fā)現(xiàn)，P-糖蛋白在多種耐藥腫瘤中表達水平上調(diào)[12]，且ABCG2在獲得性索拉非尼耐藥株中呈高表達[13]。耐藥相關(guān)基因在不同腫瘤中有著各自的表達特點，探尋不同腫瘤耐藥基因的共同規(guī)律也許能為今后制定更為有效的惡性腫瘤MDR的分子癌癥治療提供參考。本研究Western blot實驗結(jié)果顯示，凋亡相關(guān)蛋白caspase-3在耐藥細胞株中的剪切作用減少。在其他癌癥研究中已發(fā)現(xiàn)通過抑制KLF5/Bcl-2/caspase-3信號通路可恢復癌細胞對化療藥物的敏感性[14]，這或許能成為解決索拉非尼耐藥的突破口。本研究還發(fā)現(xiàn)自噬標志蛋白P62及LC3的表達水平在耐藥細胞株和野生型細胞株間存在差異，P62在耐藥細胞株中表達下調(diào)，且LC3-Ⅱ自噬流增加，提示耐藥細胞株有著更高的自噬通量。自噬與多種疾病的轉(zhuǎn)歸具有關(guān)聯(lián)性，而P62作為一種選擇性自噬受體，其活性的擾動也與許多肝病的發(fā)病機制相關(guān)[15]，包括酒精性脂肪性肝炎(alcoholic steatohepatitis，ASH)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)和HCC等。許多研究團隊也正嘗試將P62作為預測性生物標志物和治療肝臟疾病的潛在靶點[16-17]，但在HCC中的研究進展仍緩慢。LC3在自噬過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，LC3被半胱氨酸蛋白酶ATG4裂解形成胞質(zhì)異形體LC3-Ⅰ，接著LC3-Ⅰ通過ATG7及ATG3參與泛素樣反應，與磷脂酰乙醇胺(PtdEth，PE)結(jié)合，最終轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ，促進自噬體膜擴增[18]。因此，LC3-Ⅰ 和LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化是判斷自噬流改變的重要指標[19-20]。在本研究中，耐藥株LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的蛋白表達升高，提示耐藥細胞株的自噬水平比野生型細胞株更高。有研究表明，自噬可以通過影響多種化療藥物的協(xié)同作用來提高對HCC細胞的致死率[21]。索拉非尼可誘導HCC保護性自噬反應的激活[22-23]。然而，索拉非尼誘導的自噬作為促生存反應并非一成不變的，也有研究在HCC中觀察到相反的結(jié)果。目前，自噬和索拉非尼耐藥的機制仍然有待進一步闡明，筆者將就此繼續(xù)深入研究。本實驗研究也存在著一些不足，實驗使用的細胞株及評估自噬水平檢測方法單一，且實驗所用的兩種肝癌野生細胞株均不是來源于我國患者，因此后續(xù)需要使用多種肝癌細胞株進行實驗，同時可增加透射電鏡實驗以檢測細胞自噬小體的生成情況。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了兩種耐索拉非尼肝癌細胞株HepG2-SR、Huh7-SR，并初步探討了HCC對索拉非尼可能的耐藥機制，為HCC治療方案的開發(fā)提供參考。