蔡金秀 馬佳雯 何璐瑤 曹少謙，* 戚向陽，*

（1浙江萬里學院生物與環(huán)境學院，浙江 寧波 315100；2上海海洋大學食品學院，上海 201306）

抗凍肽是生物體為適應極端寒冷環(huán)境而產(chǎn)生的一類特異性多肽或糖肽。它能夠以非依數(shù)的方式降低冰晶生長點，而不影響其熔點來抑制冰晶生長和重結(jié)晶［1］。1969年，Devries 等［1］在南極魚的血液中首次發(fā)現(xiàn)了抗凍肽（anti-freeze peptide，AFP），之后相繼在其他物種中發(fā)現(xiàn)了AFP。目前，已在植物［2］、細菌［3］、陸生動物［4］及魚類［5］等生物體中發(fā)現(xiàn)了AFP。

膠原蛋白具有獨特的三螺旋結(jié)構(gòu)。膠原蛋白多肽鏈由Gly-X-Y 氨基酸序列重復而成，X、Y 代表除甘氨酸（Gly）之外的其他氨基酸殘基，通常為脯氨酸（Pro）和羥脯氨酸（Hyp）［6］。這一重復單元與Graham 等［7］從雪蚤中提取的2 種AFP 的重復序列-Gly-X-X-非常相似。膠原三肽重復序列中的親、疏水氨基酸可通過羥基或疏水相互作用與冰晶棱面相結(jié)合，抑制冰晶的生長；同時，膠原多肽中存在的螺旋結(jié)構(gòu)可能在冰晶表面形成獨特的平面堆積，從而影響冰晶的生長［8-9］。已有大量研究證明膠原蛋白含有具抗凍活性的多肽片段，并從諸多來源膠原蛋白水解物中分離獲得了抗凍肽［10-12］。

本研究以魷魚皮膠原蛋白為原料，從酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、復合蛋白酶中篩選最佳水解用酶，優(yōu)化魷魚皮膠原蛋白的酶解工藝，并對水解產(chǎn)物進行分離純化與鑒定，旨在獲得具有較高抗凍活性的肽段，為抗凍肽的開發(fā)與利用及魷魚皮的高值化利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魷魚皮收集于寧波路林市場，剝除吸盤，清洗。大腸桿菌一級菌液，生物工程（上海）股份有限公司；酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、復合蛋白酶，北京索萊寶科技有限公司；過氧化氫酶、乙腈、三氟乙酸、細胞色素C（MW12400）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（MW451）、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（MW189），美國Sigma 公司；甲酸，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DK-8D 數(shù)顯控溫水浴鍋，上海維城儀器有限公司；1900PC 紫外-可見分光光度計，上海析譜儀器有限公司；5804R 臺式高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；L8900 全自動氨基酸分析儀，日本日立公司；ALPHA2-4 真空冷凍干燥儀，德國CHRIST 公司；超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS）儀，上海沃特世科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 魷魚皮膠原蛋白的制備 前處理：參考夏珊珊等［13］的方法。稱取1 kg 魷魚皮粉末，按照料液比1∶10 （w/v）加入0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液浸泡6 h，紗布過濾后蒸餾水洗至中性，按照料液比1∶15（w/v）加入10%異丙醇溶液浸泡20 h。以上操作均在4 ℃下完成。

膠原蛋白的提?。簠⒖糧arai等［14］的方法并稍作修改。取經(jīng)過前處理的魷魚皮，按照料液比1∶100（w/v）加入pH 值4的檸檬酸緩沖溶液，于60 ℃水浴下提取8 h，真空抽濾取上清，鹽析、透析后冷凍干燥。

1.3.2 水解度（hydrolysis degree，DH）的測定 氨基態(tài)氮的測定：參照《GB 5009.235-2016 食品安全國家標準 食品中氨基酸態(tài)氮的測定》［15］第二法。

標準曲線的制作：取0.472 0 g 干燥硫酸銨溶液溶于蒸餾水后定容至1 000 mL 配置成0.1 mg·mL-1的氨氮標準液，再依次移取標準液稀釋成0、2、4、6、8、10 μg·mL-1的溶液用于標準曲線的制作。各取1 mL 稀釋液于具塞比色管中，依次加入2 mL 乙酸鈉-乙酸緩沖溶液（pH 值4.8）及2 mL 顯色劑（15 mL 37%甲醛與7.8 mL 乙酰丙酮混合，加蒸餾水定容至100 mL），振蕩混勻。置于沸水浴中水浴15 min，取出冷卻至室溫，于400 nm 波長處測定吸光度值。以吸光度為縱坐標，氨氮稀釋液濃度為橫坐標繪制標準曲線。

樣品的測定：取蛋白水解液1 mL定容至50 mL，取1 mL 稀釋液于具塞試管中，加入2 mL 乙酸鈉-乙酸緩沖溶液及2 mL 顯色劑振蕩混勻，沸水浴15 min，冷卻至室溫，于400 nm 波長處測定吸光度值，同時以蒸餾水為對照做空白試驗。氨基態(tài)氮計算公式如下：

式中，X為水解液中氨基酸態(tài)氮的含量，g·100 mL-1；m為試樣測定液中氨基態(tài)氮的質(zhì)量，μg；V為測定用試樣溶液體積，mL。

水解度（DH）的計算如下：

1.3.3 抗凍肽對過氧化氫酶活的低溫保護活性的測定 參照洪燕婷等［16］的方法并稍作修改。稱取一定量過氧化氫酶溶于0.05 mol·L-1KH2PO4-NaOH緩沖液（pH 值7.0）中，使最終濃度為0.5 mg·mL-1。將過氧化氫酶液和2 mg·mL-1魷魚皮膠原蛋白抗凍肽溶液等體積混合，測定初始酶活力。剩余混合液于-33 ℃冰箱冷凍24 h，取出后在25 ℃下解凍，再放入-33 ℃冰箱冷凍6 h，反復凍融4 次，測定凍融后酶活力。采用凍融后酶活力和初始酶活力比值（過氧化氫酶殘余活力）來表示抗凍活力，酶殘余活力越大，表明待測樣品的抗凍活性越大。

過氧化氫酶活力的測定：在石英比色皿中加入1.9 mL 蒸餾水、0.1 mL 過氧化氫酶與魷魚皮膠原蛋白抗凍肽混合液和1 mL 0.1 mol·mL-1過氧化氫溶液，立即搖勻，放入分光光度計樣品池中，于240 nm 波長下記錄初始吸光值（ΔA240），每隔1 min 記錄一次吸光值，共計時5 min。以1 min 內(nèi)吸光度值減少0.1 酶量為1 個酶活力單位（U）。過氧化氫酶活力和過氧化氫酶殘余活力計算公式如下：

1.3.4 魷魚皮膠原蛋白抗凍肽制備工藝優(yōu)化

1.3.4.1 蛋白酶的篩選 在各酶最適溫度和pH 值下，用木瓜蛋白酶（55 ℃，pH 值7.0）、堿性蛋白酶（40 ℃，pH 值10.0）、中性蛋白酶（40 ℃，pH 值7.0）、酸性蛋白酶（50 ℃，pH 值2.2）、復合蛋白酶（45 ℃，pH 值7.0），在底物濃度為1%、加酶量為4 000 U·g-1條件下酶解2 h，以過氧化氫酶低溫保護活性為主要指標、DH為參考篩選出酶解最佳用酶。

1.3.4.2 單因素試驗 用篩選出的最佳酶進行酶解，考察在加酶量為4 000 U·g-1、底物濃度為1%條件下，酶解時間分別為0.5、1、2、3、4、5 h；底物濃度為1%、酶解時間為3 h 條件下，加酶量分別為2 000、4 000、6 000、8 000 U·g-1；加酶量為4 000 U·g-1、酶解時間為3 h 條件下，底物濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%時所得魷魚皮膠原蛋白酶解產(chǎn)物對過氧化氫酶低溫保護活性及水解度的影響。

1.3.4.3 復合酶解 根據(jù)單因素結(jié)果選取最佳條件進行組合酶解試驗，酶解條件如表1所示。

表1 復合酶酶解條件Table 1 Conditions of composite enzyme hydrolysis

1.3.5 相對分子質(zhì)量分布分析 標樣配制：稱取細胞色素C（MW12400）、桿菌酶（MW1450）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（MW451）、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（MW189）標準品，用流動相溶解配制成0.2 mg·mL-1的標準分子量溶液。

樣品制備：稱取樣品100 mg，溶于流動相定容至10 mL，用0.45 μm微孔過濾膜過濾后進樣。

色譜條件［17］：色譜柱：TSKgel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm；流動相：乙腈/水/三氟乙酸=45/55/0.1（v/v）；檢測波長：UV220 nm；流速：0.5 mL·min-1；柱溫：30 ℃。

1.3.6 氨基酸組成分析 參照Su等［18］的方法。稱取20 mg 樣品于水解管中，加入5 mL 6 mol·L-1鹽酸，真空密封，110 ℃水解24 h。用2 mol·L-1NaOH 溶液將水解液pH 值調(diào)至2.2，離心取上清液，用0.02 mol·mL-1HCl定容至50 mL，取1 mL定容液于試管中，氮氣吹干后加入2 mL 0.02 mol·mL-1HCl，過0.22 μm 濾膜后用全自動氨基酸分析儀測定樣品氨基酸含量。

1.3.7 凝膠柱層析分離 利用Sephadex G-25（1 cm×100 cm I.D.）凝膠柱對在最優(yōu)水解條件下水解所得魷魚皮膠原蛋白抗凍肽進行分離。以蒸餾水為洗脫液，流速0.5 mL·min-1，平衡柱子后上樣1 mL，上樣濃度100 mg·mL-1，在220 nm 波長處檢測，收集各分離峰組分，測定各組分的熱滯活性、對過氧化氫酶低溫保護活性和對大腸桿菌低溫保護活性。

1.3.8 UPLC-MS 分析 色譜條件：色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18 colum（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）。洗脫條件：流動相A 為去離子水（含0.1%甲酸），流動相B 為乙腈。洗脫程序：40 min 內(nèi)B 由0 變?yōu)?0%，40～42 min B 由40%變回到0。流速：0.3 mL·min-1。上樣量：5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離源，正離子模式，掃描分子量范圍：100～2 000 Da。

質(zhì)譜參數(shù)：毛細管電壓：3 000 V，錐孔電壓：40 V，噴霧35 psi，脫氣溫度：350 ℃，離子源溫度：120 ℃，N2流速：900 L·h-1。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad Prism 軟件繪圖，SPSS 軟件進行Duncan（D）方差分析，顯著性水平為P＜0.05，數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差（mean±SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

由圖1 可知，魷魚皮膠原蛋白經(jīng)酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解所得產(chǎn)物的過氧化氫酶殘余活力較強，但堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度顯著高于酸性蛋白酶酶解產(chǎn)物。綜合考慮，本研究選擇堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶進行復合酶解試驗，旨在得到抗凍活性較高的肽段。

圖1 不同酶對水解度和過氧化氫酶殘余活力的影響Fig.1 Effect of different enzyme hydrolysis on hydrolysis degree and residual activity of catalase

2.2 酶解工藝優(yōu)化

2.2.1 木瓜蛋白酶酶解魷魚皮膠原蛋白單因素試驗由圖2 可知，木瓜蛋白酶酶解魷魚皮膠原蛋白所得產(chǎn)物的水解度隨溫度的升高先上升后下降，在40 ℃時最高；隨底物濃度的增加而降低；隨加酶量的增加和酶解時間的延長而顯著升高。酶解產(chǎn)物的過氧化氫酶殘余活力受溫度的影響不明顯，在45 ℃時有最大值；在底物濃度為4%時最高；隨加酶量的增大先升高后下降，在加酶量為4 000 U·g-1時最高；隨酶解時間延長先降低后上升，但在酶解3 h后無顯著性變化。綜合考慮酶解產(chǎn)物的水解度及對過氧化氫酶殘余活力，認為在底物濃度4%、加酶量4 000 U·g-1條件下，于45 ℃酶解3 h可獲得分子量較小且抗凍活性較高的酶解產(chǎn)物。

圖2 溫度（A）、底物濃度（B）、加酶量（C）和酶解時間（D）對木瓜蛋白酶酶解的影響Fig.2 Effect of temperature（A），substrate concentration（B），amount of enzyme（C） and enzymelysis time（D） on Papain enzymatic hydrolysis

2.2.2 堿性蛋白酶酶解魷魚皮膠原蛋白單因素試驗 由圖3 可知，堿性蛋白酶酶解魷魚皮所得產(chǎn)物水解度隨溫度和底物濃度的升高呈先上升后下降的趨勢，在40～50 ℃時無顯著性差異，在底物濃度為3%時最高；隨加酶量增大以及酶解時間的延長而升高。酶解產(chǎn)物的過氧化氫酶殘余活力在溫度為50 ℃、底物濃度為4%時分別有最大值；隨著加酶量的增加先升高后下降，在酶添加量為4 000 U·g-1時最大；隨酶解時間的延長先升高后下降，在酶解2 h 后顯著降低。綜上，堿性蛋白酶酶解魷魚皮膠原蛋白的最佳條件為：在底物濃度4%、加酶量4 000 U·g-1條件下，于50 ℃酶解2 h。

圖3 溫度（a）、底物濃度（b）、加酶量（c）和酶解時間（d）對堿性蛋白酶酶解的影響Fig.3 Effect of temperature（a），substrate concentration（b），amount of enzyme（c） and enzymelysis time（d） on alkaline protease enzymatic hydrolysis

2.2.3 復合酶解試驗 根據(jù)上述單因素試驗結(jié)果，在木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶的最佳條件下進行復合酶解試驗，對比了雙酶分步酶解及雙酶復合酶解與單酶酶解所得產(chǎn)物的水解度和過氧化氫酶殘余活力。由圖4可知，組合4所得產(chǎn)物的過氧化氫酶殘余活力最高，即底物濃度為4%，先由堿性蛋白酶在加酶量4 000 U·g-1、pH值8、50 ℃條件下，酶解2 h；滅酶后由木瓜蛋白酶在加酶量為4 000 U·g-1，pH值6，45 ℃條件下酶解3 h。此條件下所得酶解產(chǎn)物與過氧化氫酶混合，凍融后過氧化氫酶殘余活力可達90.23%，得率為88.36%±0.41%，純度為94.90%±0.85%。

圖4 復合酶酶解對水解度和過氧化氫酶殘余活力的影響Fig.4 Effect of using mixed enzymes hydrolysis on degree of hydrolysis and residual activity of catalase

2.3 氨基酸分析

魷魚皮膠原蛋白酶解產(chǎn)物的氨基酸組成含量如表2所示，其中與多肽抗凍活性密切相關的甘氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸含量豐富，分別占17.11%、8.15%、6.29%；其次谷氨酸含量較高（12.99%），谷氨酸含有強極性羥基，這與酶解產(chǎn)物的冰親和力有關，可增強多肽吸附冰晶表面作用力［19］。同時，酶解產(chǎn)物中天冬氨酸（9.29%）、丙氨酸（6.27%）、精氨酸（8.11%）等脂肪族氨基酸含量也較豐富，脂肪族氨基酸的存在可增強抗凍活性［20］。

表2 魷魚皮膠原蛋白抗凍肽的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of collagen antifreeze peptide from the squid skin

2.4 相對分子質(zhì)量分布分析

對最佳酶解條件下制備的酶解產(chǎn)物進行相對分子質(zhì)量分析，結(jié)果如圖5、表3 所示。魷魚皮膠原蛋白酶解產(chǎn)物的總重均分子量為5 310 Da，主要分布于1 000～5 000 Da 之間，占總重的45.58%，其中3 000～5 000 Da 占總重的21.24%。關于高活性的膠原蛋白抗凍肽分子量大小，各研究結(jié)論不一。據(jù)報道，明膠水解物中分離出的較高抗凍活性組分，分子量分布分別為700～1 400、2 000～5 000 Da［3，21］。本研究魷魚皮膠原蛋白酶解產(chǎn)物中高抗凍活性組分分子量分布需通過分離純化及鑒定進一步分析。

表3 魷魚皮膠原蛋白抗凍肽分子量分布Table 3 The molecular distribution of collagen antifreeze peptide from the squid skin

圖5 魷魚皮膠原蛋白抗凍肽相對分子質(zhì)量分布圖Fig.5 Molecular mass distribution of collagen antifreeze peptide from the squid skin

2.5 凝膠柱層析分離

根據(jù)相對分子質(zhì)量分析選用SephadexG-25 凝膠柱對魷魚皮膠原蛋白酶解產(chǎn)物進行分離純化，其在Sephadex G-25 凝膠柱上的洗脫曲線如圖6 所示。經(jīng)凝膠過濾分離后，分成F1、F2和F33 個組分。由圖7 可知，經(jīng)Sephadex G-25 凝膠柱分離得到的3 個組分中，F(xiàn)2的過氧化氫酶殘余活力顯著高于分離前酶解產(chǎn)物及F1和F3組分，將F2組分與過氧化氫酶混合，凍融后過氧化氫酶殘余活力為95.75%。

圖6 凝膠過濾色譜圖Fig.6 Chromatogram of gel filtration column

圖7 各級分抗凍活性Fig.7 Antifreeze activity of different fractions

2.6 質(zhì)譜分析

對具有較高活性的F2進行UPLC-MS分析發(fā)現(xiàn)，其中主要含有一種抗凍肽（圖8），分子離子峰為［M］+1 021 m/z，8個碎片離子峰分別為963 m/z（［M-57］+）、866 m/z（［M-57-97］+）、703 m/z（［M-57-97-163］+）、606 m/z（［M-57-97-163-97］+）、535 m/z（［M-57-97-163-97-71］+）、464 m/z（［M-57-97-163-97-71-71］+）、331 m/z（［M-57-97-163-97-71-71-114-18］+）、226 m/z（［M-57-97-163-97-71-71-114-18-87-18］+），推測這些碎片離子峰分別為失去1 個Gly、Pro、Try、Pro、Ala、Ala、Asn、Ser、Pro 基團形成的，碎片離子峰129 m/z可能為Glu。由此推測此物質(zhì)可能為10 肽，其氨基酸序列可能為Gly-Pro-Try-Pro-Ala-Ala-Asn-Ser-Pro-Glu或Glu-Pro-Ser-Asn-Ala-Ala-Pro-Try-Pro-Gly。

圖8 魷魚皮膠原蛋白抗凍肽主成分質(zhì)譜圖Fig.8 MS spectra of major ingredient of collagen antifreeze peptide from squid skin

3 討論

低溫貯藏技術是長期保存食物常用的手段，在低溫環(huán)境中，冰晶的生長和重結(jié)晶作用是損壞食品品質(zhì)的最主要因素，添加抗凍劑是緩解食品在低溫貯藏過程中品質(zhì)劣變的有效方法之一。目前，商業(yè)上使用的抗凍劑多為糖醇類和多聚磷酸鹽類，但因其具有一定副作用而在使用中受限。已有研究表明，抗凍肽能有效減少凍藏過程中由冰晶對組織造成的機械損傷并抑制蛋白變性，具有高活性的抗凍肽成為近年來的研究熱點［8］。已有大量研究證明膠原蛋白含有具抗凍活性的多肽，魷魚皮富含膠原蛋白，本研究以魷魚皮膠原蛋白為原料，采用可控酶解技術制備了膠原蛋白抗凍肽，并對其進行分離純化與鑒定。蛋白酶酶切位點的差異性導致產(chǎn)物氨基酸組成結(jié)構(gòu)的差異，肽的抗凍機制主要包括吸附冰晶表面抑制冰晶生長及改變冰晶形態(tài)，這與肽段中的親水基團和疏水基團密切相關［22-24］。為了得到較高活性的抗凍肽，本研究采用復合酶解法從酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、復合蛋白酶中篩選出堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶，結(jié)果表明，先堿性蛋白酶后木瓜蛋白酶分步酶解所得產(chǎn)物的過氧化氫酶殘余活力顯著高于雙酶混合酶解及先木瓜蛋白酶酶解；且酶解產(chǎn)物的過氧化氫酶殘余活力與其水解度隨酶解時間的變化趨勢不一致，說明抗凍肽的活性可能與其分子量大小不相關，但孫麗潔等［25］認為分子量較小的肽段抗凍活性較高，對于抗凍活性與肽段分子量大小的相關性有待進一步驗證。酶解所得抗凍多肽富含甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸，經(jīng)分離純化后3 個組分均具有較高的過氧化氫酶殘余活力，其中F2組分高于分離前多肽及F1和F3，將過氧化氫酶與F2組分混合，凍融后過氧化氫酶殘余活力可達95.75%。李曉坤［26］研究發(fā)現(xiàn)，從豬皮明膠中制備抗凍肽可使過氧化氫酶保留88.2%的活力，而洪燕婷等［16］研究發(fā)現(xiàn)，從食源魚皮明膠中制備抗凍肽可使其保留91.8%活力，抗凍活性均低于本試驗所制備抗凍肽。F2組分中主要肽段氨基酸序列可能是Gly-Pro-Try-Pro-Ala-Ala-Asn-Ser-Pro-Glu 或 Glu-Pro-Ser-Asn-Ala-Ala-Pro-Try-Pro-Gly。該肽段中含有膠原蛋白典型重復序列-Gly-X-Y，其中X、Y分別為脯氨酸和酪氨酸，脯氨酸含量豐富。前人研究發(fā)現(xiàn)脯氨酸的烷基側(cè)鏈能夠提供非極性環(huán)境，穩(wěn)定氫鍵，增強多肽與冰晶的結(jié)合［27-28］。本研究所得肽段中含有3 個脯氨酸殘基，這可能是此肽段對過氧化氫酶低溫保護活性強于李曉坤［26］和洪燕婷［16］所得肽段的原因。

4 結(jié)論

本研究表明，魷魚皮膠原蛋白酶解的最佳條件為：當?shù)孜餄舛葹?%、加酶量為4 000 U·g-1時，先由堿性蛋白酶于pH 值8、50 ℃條件下酶解2 h；滅酶后由木瓜蛋白酶于pH 值6、45 ℃條件下酶解3 h，該條件下所得酶解產(chǎn)物與過氧化氫酶混合，凍融后過氧化氫酶殘余活力可達90.23%。經(jīng)分離純化及質(zhì)譜鑒定，推測魷魚皮膠原蛋白抗凍多肽中具有較高抗凍活性肽段的氨基酸序列是Gly-Pro-Try-Pro-Ala-Ala-Asn-Ser-Pro-Glu 或Glu-Pro-Ser-Asn-Ala-Ala-Pro-Try-Pro-Gly。綜上，魷魚皮膠原蛋白抗凍多肽有較高抗凍活性，具備作為新型抗凍劑的潛力。