林曉陽 趙洪平 柳海東 杜德志

（青藏高原種質資源研究與利用實驗室/青海大學農林科學院/春油菜遺傳改良重點實驗室/國家油菜改良中心青海分中心/農業(yè)農村部春油菜科學觀測實驗站/青海省春油菜研究開發(fā)中心/青海省春油菜工程技術研究中心，青海 西寧 810016）

油菜作為我國重要的油料作物，年種植面積達667萬公頃［1-3］。我國油菜分為春油菜、半冬性油菜及冬油菜三個生態(tài)型，有白菜型、甘藍型、芥菜型三種栽培類型［1］。春油菜主要分布在青海、甘肅、新疆、內蒙古和西藏等氣溫較低、無霜期較短的地區(qū)，冬油菜主要分布在長江流域［3］。在春油菜區(qū)，三個油菜栽培類型均有種植，其中甘藍型油菜面積約43萬公頃，主要分布在低海拔、無霜期較長的地區(qū)；白菜型油菜面積約20萬公頃，主要分布在高海拔、無霜期較短的地區(qū)；芥菜型油菜約3.3萬公頃，主要分布在較干旱地區(qū)［4］。白菜型油菜產量低、品質差，甘藍型油菜產量和品質都優(yōu)于白菜型油菜。因此，選育能在高海拔區(qū)正常成熟的特早熟甘藍型油菜來替代白菜型油菜，對高海拔春油菜產區(qū)的油菜產量和品質改良意義重大，是我國特早熟春油菜育種的重要目標。

雜種優(yōu)勢是指雜種F1代在產量等方面都優(yōu)于雙親的現(xiàn)象，普遍存在于生物界，且現(xiàn)代農業(yè)利用雜種優(yōu)勢現(xiàn)象實現(xiàn)了作物產量的大幅提高。油菜具有較強的雜種優(yōu)勢，利用雜種優(yōu)勢選育的油菜雜交種在產量等方面具有重大突破［5-7］。傅廷棟等［8］于1972年發(fā)現(xiàn)了波里馬甘藍型油菜細胞質雄性不育系（pol-CMS），該不育系在國內和國際均得到了廣泛研究和利用，例如華中農業(yè)大學在此基礎上培育出華雜2號、華雜3號等優(yōu)質三系雜交種［9-10］。李殿榮等［11］通過油菜三系配套選育出油菜雜交種秦油2 號，比對照品種增產27.4%，是國際上第一個增產顯著并大面積推廣應用的雜交油菜品種。官春云等［12］選育高產雜交種湘雜油1號，具有明顯的雜種優(yōu)勢，比常規(guī)品種增產15%左右。早熟油菜品種可以避開高溫逼熟，提高油菜種植效益［13］；同時早熟油菜品種具有矮稈、抗倒和少分枝等適合機械收獲特征，有利于推進我國油菜機械化生產進程［14］，因此早熟性成為油菜重要優(yōu)勢性狀之一。我國高海拔、高緯度春油菜區(qū)約有20 萬公頃白菜型油菜，因而具有早熟特性的甘藍型油菜品種具有廣闊的應用前景。杜德志等［4］利用高海拔地區(qū)正常成熟的優(yōu)質特早熟甘藍型油菜資源作親本選育出青雜3 號、青雜4 號、青雜7 號等特早熟甘藍型油菜雜交品種，大幅度提高了高海拔地區(qū)油菜產量和品質，在保障我國植物油脂、餅粕蛋白供給安全和促進高海拔地區(qū)經濟發(fā)展方面發(fā)揮了重要作用。

特異酶切位點擴增片段測序（specific length amplification fragment sequencing，SLAF-seq）技術的測序通量高、準確性和重復性好，在遺傳圖譜、關聯(lián)圖譜構建和分子育種、系統(tǒng)進化、種質資源鑒定等方面應用廣泛［15-16］。十字花科植物雜種優(yōu)勢預測方法主要包括配合力法、生理生化法和分子標記法等［17-18］；利用DNA分子標記技術可以預測雜種優(yōu)勢，如利用特異分子標記計算材料間遺傳差異、聚類分析了解不同個體間遺傳差異，從而指導雜交親本選配［19-20］。趙緒濤等［1］利用SLAF-seq 技術對121 份甘藍型油菜進行雜種優(yōu)勢分析，獲得了強優(yōu)勢春油菜雜交組合，證實SLAF-seq技術可用于雜種優(yōu)勢預測。

甘藍型油菜在高海拔地區(qū)的推廣種植受其生育期的限制。選育特早熟甘藍型春油菜，有助于增加高海拔春油菜產區(qū)的種植面積，對油菜產量和品質的改善具有重要意義。因此，本研究分析了98份特早熟甘藍型油菜品系遺傳差異，明確恢復系與不育系的遺傳關系，以期通過分析雜交種產量性狀、雜種優(yōu)勢和雜種優(yōu)勢模式，為后續(xù)特早熟甘藍型油菜雜交種選育提供親本選擇的分子依據，促進春油菜區(qū)特早熟雜交育種進程。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

優(yōu)質早熟甘藍型春油菜D9946，青藏高原極早熟白菜型農家品種浩油11 號，波里馬細胞質特早熟甘藍型春油菜不育系64-1；97份特早熟甘藍型春油菜恢復系材料來自D9946×浩油11 號的偏甘藍型株系高世代自交后代；2020年，根據前期恢復系聚類和核心種質構建結果，選取44 份恢復系材料與不育系64-1 配制雜交組合；選取青雜4 號為對照材料。以上材料均由青海省農林科學院春油菜研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 田間試驗 2020年，將44 份特早熟恢復系品系、不育系64-1 的保持系、44 個F1雜交種及對照青雜4 號按隨機區(qū)組種植于試驗田（青海省西寧市，36°43＇N，101°45＇E），3 次重復，每重復3 行區(qū)，行長2 m、行距0.3 m、株距0.15 m。常規(guī)大田管理。

1.2.2 系統(tǒng)進化樹構建與遺傳距離計算 與2019年97恢復系材料分析方法一致［21］，苗期取幼嫩葉片1～2 cm2提取基因組DNA，送至北京百邁客生物科技有限公司進行SLAF 測序、分析，開發(fā)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）標記。使用MEGA X［22］軟件，對得到的SNP位點進行遺傳分析，基于neighborjoining 的算法（Kimura 2-parameter 模型，1 000 次bootstrap），計算97 份恢復系與1 份不育系材料之間的遺傳距離，并構建98 份特早熟甘藍型油菜種質資源的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 雜種表現(xiàn)、雜種優(yōu)勢及雜優(yōu)模式分析方法 待植株成熟后，每個小區(qū)隨機選取6 株進行考種，考種性狀包括每角果粒數、全株有效角果數、千粒重、小區(qū)產量。其中，每角果粒數為主花序中部相同部位摘取10個角果測得的平均值；全株有效角果數指整株包括主花序和分枝的有效角果數的總數；千粒重按照《GB/T 5519-2008 谷物與豆類 千粒重的測定》［23］的方法進行稱重；小區(qū)產量為該小區(qū)進行考種單株的產量及其剩余單株的小區(qū)統(tǒng)計產量之和。雜種優(yōu)勢計算公式如下：

其中，F(xiàn)1值代表雜種一代性狀表現(xiàn)的平均值，高親值為最優(yōu)親本性狀的表現(xiàn)值，對照值為對照組性狀表現(xiàn)值，中親值是雙親性狀表現(xiàn)的平均值。分析小區(qū)產量排位前20 的雜交組合組配方式，結合聚類分析的結果，探究雜種優(yōu)勢模式。采用DPS軟件分析數據。

2 結果與分析

2.1 系統(tǒng)進化樹構建及遺傳距離計算

構建98 份特早熟甘藍型油菜種質資源的系統(tǒng)發(fā)育樹，分析不同樣品之間的遺傳進化關系和研究材料的群體結構。根據遺傳距離繪制系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1），結合97 份恢復系分類情況［21］，將98 份材料同樣分為五類：第一類，只包含1份恢復系品系；第二類，包含26份恢復系品系；第三類，包含18 份恢復系品系；第四類，包含17份恢復系品系和1份不育系品系64-1；第五類，包含35份恢復系品系。

圖1 基于SLAF-seq技術分析甘藍型春油菜97份恢復系和1份不育系的進化關系Fig.1 Evolutionary relationship between 97 restorer lines and 1 sterile line of Brassica napus L.based on SLAF-seq technology

基于neighbor-joining 算法，恢復系與不育系64-1之間遺傳距離介于0.01～0.52，平均遺傳距離為0.35。與不育系遺傳距離值排列前十的恢復系（表1）全部位于第五類，遺傳距離介于0.45～0.52之間，均值為0.48。綜合特早熟甘藍型春油菜恢復系與不育系聚類及遺傳距離分析結果表明，春性甘藍型油菜中導入特早熟白菜型油菜遺傳成分可有效拓寬甘藍型春油菜遺傳差異，且不育系材料與第五類恢復系遺傳距離較大。

表1 甘藍型油菜1份不育系與97份恢復系排位前二十遺傳距離Table 1 The top 20 lines with higher genetic distance between sterile line 64-1 and 97 restorer lines of Brassica napus L.

2.2 雜種表現(xiàn)

根據聚類結果，除去僅包含1 份恢復系材料的第一類，從剩余四類中按照45%的比例隨機選取44份恢復系材料（其中18 份恢復系為前期構建的核心種質資源）與不育系組配雜交組合，收獲F1，產量相關性狀雜種表現(xiàn)見表2。小區(qū)產量顯著超過對照青雜4 號的組合有23個，組合（64-1）×16D3小區(qū)產量最高，達422.01 g；組合（64-1）×58的角果粒數最多，達33.62個；組合（64-1）×67的全株有效角果數最多，達212.94 個；組合（64-1）×3286千粒重最大，達4.52 g。各性狀排名前二十組合中，不育系×第五類恢復系組合數量占組合總數一半，說明不育系×第五類恢復系組配出高產組合的可能性大。

表2 產量相關性狀的雜種表現(xiàn)Table 2 Yield-related traits of hybrids

44 個F1組合產量相關性狀變異分析（表3）表明，4 個產量相關性狀變異系數整體較小，其中每角果粒數最大值33.62 粒，最小值23.10 粒，平均值28.33 粒，變異系數最?。?.84%），四性狀中最?。恍^(qū)產量最大值422.01 g，最小值158.23 g，平均值285.78 g，變異系數最高（20.41%）。

表3 F1產量相關性狀的描述統(tǒng)計Table 3 Descriptive statistics of yield-related traits in F1

對親本和F1的4個產量性狀進行方差分析，結果如表4 所示。親本和F1在每角果粒數、千粒重和小區(qū)產量之間存在極顯著差異（P＜0.01）。

表4 44個雜交組合產量相關性狀方差分析Table 4 Variance of yield-related traits of 44 hybrids

2.3 雜種優(yōu)勢分析

2.3.1 超親優(yōu)勢分析 44 個雜交組合中，每角果粒數超親優(yōu)勢正向的有23 個組合，優(yōu)勢值分布在0.94%～21.65%，優(yōu)勢最強的組合為（64-1）×28；全株有效角果數超親優(yōu)勢中有9 個正向的組合，優(yōu)勢值分布在0.97%～38.38%，超親優(yōu)勢最強的組合為（64-1）×67；千粒重超親優(yōu)勢有22 個組合為正向優(yōu)勢，優(yōu)勢值分布在0.49%～18.14%，最強正向優(yōu)勢組合為（64-1）×12；小區(qū)產量有29 個，優(yōu)勢值分布范圍為1.29%～91.98%，組合（64-1）×26 的正向優(yōu)勢最強。（64-1）×32、（64-1）×69、（64-1）×79 和（64-1）×16D5 等四個組合，四項農藝性狀均為正向優(yōu)勢（表5、附表1）。

表5 44個雜交組合雜種優(yōu)勢的分布情況Table 5 Percentage of positive heterosis in 44 hybrids

附表1 農藝性狀超親優(yōu)勢Table 1 OPH of agronomic traits/%

2.3.2 超標優(yōu)勢分析 44個雜交組合中，每角果粒數超標優(yōu)勢正向的有23 個組合，優(yōu)勢值分布在0.79%～20.20%，優(yōu)勢最強的組合為（64-1）×28；全株有效角果數超標優(yōu)勢中有3 個正向的組合，優(yōu)勢值分布在0.05%～2.32%，超標優(yōu)勢最強的組合為（64-1）×67；千粒重超標優(yōu)勢有29 個組合為正向優(yōu)勢，優(yōu)勢值分布在0.77%～22.29%，最強正向優(yōu)勢的組合為（64-1）×16D3；小區(qū)產量超標優(yōu)勢有23 個組合為正向優(yōu)勢，優(yōu)勢值分布范圍為4.26%～52.55%，（64-1）×3286 的組合正向優(yōu)勢最強（表5、附表2）。

附表2 農藝性狀超標優(yōu)勢Table 2 OSH of agronomic traits/%

2.3.3 中親優(yōu)勢分析 44個雜交組合中，每角果粒數中親優(yōu)勢正向的有37 個組合，優(yōu)勢值分布在0.07%～26.98%，優(yōu)勢最強的組合為（64-1）×28；全株有效角果數中親優(yōu)勢中有20 個正向組合，優(yōu)勢值分布在2.44%～50.55%，中親優(yōu)勢最強的組合為（64-1）×67；千粒重中親優(yōu)勢有34 個組合為正向優(yōu)勢，優(yōu)勢值分布在0.07%～21.92%，最強正向優(yōu)勢的組合為（64-1）×12；小區(qū)產量的中親優(yōu)勢41 個組合為正向優(yōu)勢，優(yōu)勢值分布范圍為1.56%～99.51%，組合（64-1）×26 正向優(yōu)勢最高。每角果粒數的中親優(yōu)勢前二十組合中：恢復系位于第二類的有4 個，位于第三類的有4 個，位于第四類的有3個，位于第五類的有9個（表5、附表3）。

附表3 農藝性狀中親優(yōu)勢Table 3 MPH of agronomic traits/%

2.4 遺傳距離與雜優(yōu)模式分析

為了探索遺傳距離與雜種產量之間的關系，本研究分析了小區(qū)產量排前二十的雜交組合及其恢復系與不育系的遺傳距離，結果如表6 所示。在所有組合中，恢復系與不育系的遺傳距離變幅為0.19～0.52，其中小區(qū)產量排名最高組合為（64-1）×16D3（第五類恢復系），親本間遺傳距離同樣最高，為0.52。

表6 小區(qū)產量排前20組合的恢復系與不育系的遺傳距離及其組配方式Table 6 Genetic distance and combining pattern of 20 crosses with higher plant block yield and the genetic distance between restorer lines and sterile line

第二類至第五類恢復系與不育系的遺傳距離依次分別為：0.37～0.42，平均值0.40；0.30～0.34，平均值0.32；0.19～0.32，平均值0.26；0.30～0.52，平均0.41。由此可見，第五類恢復系材料與不育系平均遺傳距離最大。

進一步分析雜種優(yōu)勢及產量排前二十的雜交組合的組配模式數量，結果發(fā)現(xiàn)，超親優(yōu)勢中，除第一類，各恢復系類別所占個數如下：每角果粒數中各類依次分別有4、3、3 和10 個；全株有效角果數中各類依次分別有5、3、4和8個；千粒重中各類依次分別有5、4、2和9個；小區(qū)產量中各類依次分別有5、4、2 和9 個。超標優(yōu)勢中，各恢復系類別所占個數如下：每角果粒數各類依次分別有5、4、3和8個；全株有效角果數中各類依次分別有6、1、3和10個；對千粒重而言，各類依次分別有4、3、4和9個；小區(qū)產量中各類依次分別有4、2、5和9個。中親優(yōu)勢排前二十組合中，上述4 個性狀的恢復系來自第五類的數量都多于來自其他各類的恢復系數量，各恢復系類別所占個數如下：每角果粒數中各類依次分別有3、5、2 和10 個；全株有效角果數中各類依次分別有5、5、1 和9 個；千粒重中各類依次分別有7、2、4 和7個；小區(qū)產量中各類依次分別有2、7、0 和11 個。以上各項數據中，除千粒重的中親優(yōu)勢表現(xiàn)外，不育系×第五類恢復系的占比均在40%以上，說明該組合模式配出強優(yōu)勢組合的潛力較大。對于小區(qū)產量的雜種表現(xiàn)、恢復系與不育系遺傳距離分析結果顯示，前二十排名的組合中，恢復系位于第二、第三、第四及第五類的組合個數分別有3、4、3和10個。小區(qū)產量排前十的雜交組合組配模式中，不育系×第五類恢復系模式的組合也占到一半，且第五類群恢復系與不育系之間平均遺傳距離最大。上述結果表明，遺傳背景一致性高的情況下，遺傳距離越大，雜種優(yōu)勢越強；本研究中不育系×第五類恢復系的組配模式能產生強優(yōu)勢雜交種的潛力最大，為最優(yōu)組配模式。

3 討論

分子標記技術能夠從基因組水平得到不同材料間的遺傳差異，目前已經在構建核心種質以及劃分農作物種質類群中被普遍應用［24］，其中尹祥佳等［25］利用分子標記手段指導了玉米雜交種的選育。本試驗對98份特早熟甘藍型春油菜進行分子標記開發(fā)與系統(tǒng)發(fā)育樹構建，結果顯示所有材料被分成五類，每一類中的材料與林曉陽等［21］通過97 份材料構建的系統(tǒng)發(fā)育樹基本一致，上述材料的劃分有助于指導特早熟甘藍型春油菜育種。雜種優(yōu)勢的利用是創(chuàng)建油菜品種的有效方法，華雜與秦油系列的成功選育均得益于雜交的手段［9-11］。研究親本遺傳距離與雜種優(yōu)勢的關系是對雜種優(yōu)勢預測的一種探索，利用分子標記技術對親本進行親緣關系分析，研究遺傳距離與雜種優(yōu)勢的關系能夠確定合適的雜種優(yōu)勢利用模式，可以為甘藍育種過程中的親本選配提供參考依據，提高育種效率［26］。前人通過計算遺傳距離進行雜種優(yōu)勢的預測，在產量相關性狀上得到了一定的驗證，如趙緒濤等［1］研究發(fā)現(xiàn)，遺傳距離對預測甘藍型油菜的雜種優(yōu)勢具有可行性。本研究對不育系與恢復系間的遺傳距離進行分析，可知與不育系遺傳關系較大的恢復系劃分類群；并選擇遺傳差異大的材料進行配置組合，發(fā)現(xiàn)其雜種后代各產量性狀表現(xiàn)及雜種優(yōu)勢也較強。因此，在后續(xù)育種過程中的親本選擇上，可以優(yōu)先分別從第四和第五類材料間進行選擇，有望得到雜種優(yōu)勢強的后代。

親本間遺傳的差異能夠為雜種優(yōu)勢利用提供基礎條件，以種間雜交的方式可有效拓寬甘藍型油菜的遺傳背景、提高遺傳多樣性，為雜種優(yōu)勢利用提供基礎［26-27］，油菜產量相關性狀的雜種優(yōu)勢與親本間遺傳距離表現(xiàn)顯著相關［28］。通過雜交的方式，浩油11 號的早熟基因被導入至本研究所用的甘藍型油菜恢復材料中，用于創(chuàng)建特早熟性的甘藍型油菜資源。本研究中產量及相關性狀分析結果表明，恢復系親本間在考察的農藝性狀上存在明顯差異，意味著親本間的遺傳差異較大。28、16D5（第三類）和71、49、16D3、71（第五類）在小區(qū)產量的雜種表現(xiàn)與雜種優(yōu)勢均表現(xiàn)優(yōu)異，說明這些恢復系與不育系配制的雜交種高產潛力較大。

優(yōu)質的種質資源與雜種優(yōu)勢研究相結合，是農作物良種選育的手段；高產優(yōu)質品種的選育，也是我國農業(yè)目前急需解決的問題之一［29-30］。對特早熟甘藍型油菜雜種優(yōu)勢和雜優(yōu)模式進行研究，一方面有利于選育高產優(yōu)質特早熟甘藍型春油菜雜交種，另一方面，能夠加快品種選育進程，加速品種的更新?lián)Q代。本研究中，在小區(qū)產量排前二十的雜交組合中，產量最高的組合為（64-1）×16D3（第五類），該組合有望進行下一步的區(qū)域試驗；雜交組配方式主要以不育系×第五類恢復系為主，有10 個組合。說明在第五類恢復系材料與不育系進行雜交的模式下配置組合，后代中產生強優(yōu)勢雜交種的潛力較大；不育系與第五類的遺傳距離也最遠，說明在這些材料中，遺傳距離越遠，雜種優(yōu)勢越強，今后特早熟甘藍型春油菜恢復系的選育從第五類（與不育系遺傳距離遠的類群）入手，有望快速選育出強優(yōu)勢雜交種。這些研究結果對今后特早熟甘藍型油菜雜交種的選育具有重要的指導意義。

4 結論

利用SLAF-seq 技術對97 份特早熟甘藍型春油菜恢復系和1 份不育系進行測序，通過系統(tǒng)進化和遺傳差異分析，將98 份特早熟甘藍型春油菜分為五個類群，其中不育系與第五類恢復系的遺傳差異較大。分析44個組合雜種優(yōu)勢，組合（64-1）×16D3（第五類）的小區(qū)產量優(yōu)勢最強，是選育高產雜交種的優(yōu)勢組合?！安挥怠恋谖孱惢謴拖怠钡慕M合模式不僅在小區(qū)產量前二十的雜交組合中數量最多、占比最高；同時在小區(qū)產量的超標優(yōu)勢、超親優(yōu)勢和中親優(yōu)勢中占比也最高；不育系與第五類恢復系的遺傳距離最大，說明該組配模式產生強優(yōu)勢雜交組合的潛力最大。