陳亞明 李勇生 高生智 張 莉 徐庚全 潘陽陽 余四九 ，*

（1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，甘肅 蘭州 730070；2甘肅省動物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 蘭州 730070）

牦牛是分布于高原地區(qū)的重要畜種，是當(dāng)?shù)卦S多牧民家庭的主要生活和經(jīng)濟來源，并且在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要作用［1］。牦牛在放牧飼養(yǎng)過程中通常會感染各類寄生蟲，且寄生蟲感染多呈慢性持續(xù)感染，臨床癥狀不易觀察；雖然牦牛抵抗力強，寄生蟲感染的致死率不高，但牦牛的生產(chǎn)性能和生長發(fā)育都會受到影響［2］。弓形蟲（Toxoplasma gondii）、環(huán)形泰勒蟲（Theileria annulata）和新孢子蟲（Neospora caninum）是嚴重危害養(yǎng)牛業(yè)的常見寄生蟲，家畜寄生蟲感染，不僅給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，更對人類健康造成嚴重危害［3］。因此檢測弓形蟲、環(huán)形泰勒蟲和新孢子蟲的感染和流行情況對這3種疾病的防治具有十分重要的意義。

弓形蟲和新孢子蟲均為牛體內(nèi)的常見寄生蟲，牛群感染后臨床癥狀相似，且發(fā)生混合感染的情況日趨嚴重，主要引起母畜出現(xiàn)木乃伊胎、死胎、流產(chǎn)以及神經(jīng)系統(tǒng)障礙［4-5］。新孢子蟲病和弓形蟲病分別由新孢子蟲和剛地弓形蟲寄生于宿主所引起［6］，犬科動物和貓科動物分別是新孢子蟲和弓形蟲的終末宿主［7］。其中新孢子蟲對牛造成的危害最為嚴重，而弓形蟲病是一種人獸共患寄生蟲病，牛和其他反芻動物是弓形蟲的主要中間宿主［8］，這兩種寄生蟲具有水平和垂直傳播兩種傳播方式。環(huán)形泰勒蟲感染牛的紅細胞、淋巴細胞等，主要表現(xiàn)為淋巴結(jié)腫大、貧血、消瘦、高熱和食欲不振［9］，重癥可出現(xiàn)死亡病例，我國已將此病定為二類疫?。?0］。但目前尚無可用于預(yù)防弓形蟲、環(huán)形泰勒蟲和新孢子蟲的成熟疫苗［11-12］。當(dāng)前，弓形蟲和新孢子蟲在世界各主要的養(yǎng)牛國家普遍流行［13-15］，造成了巨大的經(jīng)濟損失。迄今，弓形蟲、新孢子蟲在我國大多數(shù)省份均有報道［16-17］，部分省份也有牛群中存在環(huán)形泰勒蟲的相關(guān)報道［18］。

綜合上述進展表明，準(zhǔn)確判斷弓形蟲和新孢子蟲感染須經(jīng)實驗室病原檢測和診斷。迄今，鑒別檢測弓形蟲、新孢子蟲和環(huán)形泰勒蟲的常用方法有PCR、實時熒光定量PCR、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)（Lamp）等檢測方法，其中已有同時檢測新孢子蟲和弓形蟲的雙重PCR 檢測方法［19］。但是，鑒別檢測弓形蟲、環(huán)形泰勒蟲、新孢子蟲的多重PCR 方法仍鮮有報道。因此，本試驗針對弓形蟲、環(huán)形泰勒蟲和新孢子蟲設(shè)計特異性引物，建立弓形蟲、環(huán)形泰勒蟲和新孢子蟲的三重PCR 方法，以期為臨床流行病學(xué)調(diào)查提供后備支持，從而掌握甘肅省甘南地區(qū)3 種寄生蟲的流行狀況。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

弓形蟲DNA、環(huán)形泰勒蟲DNA 和新孢子蟲DNA均為甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心實驗室保存。試驗所用牦牛629 份血清樣品均采自甘南地區(qū)牦牛養(yǎng)殖區(qū)。

1.2 儀器與試劑

全血基因組DNA 提取試劑盒、Taq 聚合酶、PCR 試劑、DNA Marker（DL 2000），寶生物工程（大連）有限公司；T100 型PCR 儀，美國Bio-Rad 公司；BioSpectrum 310 凝膠成像系統(tǒng)，美國UVP 公司；高速離心機，德國Eppendorf公司。

1.3 引物的設(shè)計合成

根據(jù)弓形蟲hypothetical protein基因（GenBank 登錄號：MG003442.1）、環(huán)形泰勒蟲Tams1基因（GenBank登錄號：LC549654.1）和新孢子蟲Nc-p43（GenBank 登錄號：EF469765.1），應(yīng)用Primer premier 6.0 軟件各設(shè)計一對特異性引物，擴增的目的片段長度分別為520、341 和156 bp（表1）。引物由天津卡梅德生物科技有限公司合成。

表1 多重PCR引物序列Table 1 Multiplex PCR primer sequences

1.4 單重PCR方法的建立

PCR 體系共25 μL：牛弓形蟲、環(huán)形泰勒蟲和新孢子蟲的基因組DNA 模板各1 μL，2×Taq Master Mix 12 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 補足至25 μL，混合均勻后進行PCR 反應(yīng)。擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。對PCR 產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，并在凝膠成像系統(tǒng)下觀察。

1.5 多重PCR方法的建立與優(yōu)化

利用1.4 的反應(yīng)體系，以弓形蟲、環(huán)形泰勒蟲和新孢子蟲的基因組DNA為模板。根據(jù)設(shè)計的3對引物擴增溫度的參考值，分別設(shè)置55、56、57、58、59 ℃共5 個梯度進行退火溫度優(yōu)化，以篩選最佳反應(yīng)溫度。

1.6 多重PCR特異性試驗

采用優(yōu)化后的多重PCR方法，分別對弓形蟲、環(huán)形泰勒蟲、新孢子蟲、牛雙芽巴貝斯蟲（Babesia bigemina）和牛卵形巴貝斯蟲（Babesia ovata）單一DNA 及其不同組合進行核酸樣品擴增，以檢測該方法的特異性。

1.7 多重PCR敏感性試驗

將弓形蟲、環(huán)形泰勒蟲和新孢子蟲3 種原蟲的DNA 模板濃度稀釋到相同數(shù)量級，按優(yōu)化后的條件進行多重PCR擴增，以檢測該方法的敏感性。

1.8 重復(fù)性試驗

應(yīng)用建立的多重PCR 方法，對弓形蟲+環(huán)形泰勒蟲、牛雙芽巴貝斯蟲、弓形蟲+環(huán)形泰勒蟲+新孢子蟲、環(huán)形泰勒蟲+新孢子蟲、牛卵形巴貝斯蟲、弓形蟲+新孢子蟲、環(huán)形泰勒蟲、弓形蟲、環(huán)形泰勒蟲、弓形蟲+環(huán)形泰勒蟲+新孢子蟲、弓形蟲+新孢子蟲、陰性對照和環(huán)形泰勒蟲樣本進行重復(fù)試驗，驗證多重PCR 方法穩(wěn)定性。

1.9 流行病學(xué)調(diào)查

將采集到的629 份甘南地區(qū)牦牛血清樣本，提取DNA 模板，應(yīng)用本試驗所建立的多重PCR 方法檢測。出現(xiàn)預(yù)期大小520、341、156 bp 條帶為陽性，未出現(xiàn)相應(yīng)條帶為陰性。

1.10 數(shù)據(jù)分析

運用F檢驗和卡方檢驗判定季節(jié)和年齡與牦牛感染3 種原蟲之間存在的相關(guān)風(fēng)險關(guān)系。P＞0.05 代表差異無統(tǒng)計學(xué)意義，即該因素不是感染寄生蟲的風(fēng)險因素。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR引物的確定

分別以弓形蟲、環(huán)形泰勒蟲和新孢子蟲的DNA 模板進行擴增。結(jié)果顯示，獲得與預(yù)期片段大小一致的目的片段520（弓形蟲）、341（環(huán)形泰勒蟲）和156 bp（新孢子蟲），未見非特異性條帶出現(xiàn)（圖1），說明本試驗所設(shè)計的3對引物特異性良好，可對3種目標(biāo)蟲體的DNA進行有效擴增。

圖1 單一PCR引物的特異性檢測Fig.1 Specific detection of a single PCR primer

2.2 多重PCR反應(yīng)體系的建立及退火溫度優(yōu)化

以單一PCR 反應(yīng)條件為基礎(chǔ)構(gòu)建多重PCR，反應(yīng)體系為3 種原蟲的模板和引物，優(yōu)化退火溫度。結(jié)果顯示，在56、57、58 ℃都有特異性條帶出現(xiàn)，57 ℃時3種PCR產(chǎn)物亮度最高。因此，該多重PCR 反應(yīng)最佳溫度為57 ℃（圖2）。

圖2 多重PCR反應(yīng)體系的建立及退火溫度優(yōu)化Fig.2 Establishment of multiplex PCR reaction system and optimization of annealing temperature

2.3 多重PCR特異性試驗

采用優(yōu)化后的PCR 反應(yīng)體系及擴增程序，用3 對引物分別對弓形蟲、環(huán)形泰勒蟲和新孢子蟲的單一DNA模板進行擴增，均可擴增出相應(yīng)的目的片段（圖3，泳道1～3）；對弓形蟲、環(huán)形泰勒蟲和新孢子蟲3種原蟲的混合DNA 模板，擴增出3 條目的片段（圖3，泳道4）；對弓形蟲、環(huán)形泰勒蟲和新孢子蟲的DNA 模板進行不同組合擴增，分別擴增出2條目的條帶（圖3，泳道5～7），且無其他非特異性條帶；而對牛雙芽巴貝斯蟲、牛卵形巴貝斯蟲DNA 和水為模板（圖3，泳道8～10）時均無條帶出現(xiàn)，表明該多重PCR方法具有良好的特異性。

圖3 多重PCR的特異性試驗Fig.3 Specificity of multiplex PCR

2.4 多重PCR敏感性試驗

檢測弓形蟲、環(huán)形泰勒蟲和新孢子蟲的DNA 濃度，并將上述3 份DNA 分別稀釋到相同數(shù)量級后進行PCR擴增。該方法可檢測到弓形蟲、環(huán)形泰勒蟲和新孢子蟲DNA的最低濃度分別是0.01、0.02和0.01 ng·μL-1（圖4）。說明該多重PCR 反應(yīng)敏感性良好，且敏感性能夠滿足對臨床3種蟲體DNA濃度的要求。

圖4 多重PCR敏感性試驗Fig.4 Multiplex PCR sensitivity assay

2.5 多重PCR重復(fù)性試驗

用建立的多重PCR 方法對12 份樣本以及陰性對照進行檢測，均能擴增出與預(yù)期大小相符的目的條帶（圖5），且無其他非特異性條帶的出現(xiàn)。此外，該多重PCR 方法對牛雙芽巴貝斯蟲、牛卵形巴貝斯蟲的擴增效果均為陰性，表明該多重PCR穩(wěn)定性較好。

圖5 多重PCR 重復(fù)性試驗結(jié)果Fig.5 Multiplex PCR repeatability test results

2.6 臨床樣品檢測結(jié)果

應(yīng)用所建立的多重PCR 方法，檢測采集自甘南地區(qū)的629 份血清，結(jié)果如表2 所示。弓形蟲陽性率為4.29%，環(huán)形泰勒蟲陽性率為3.66%，新孢子蟲的陽性率為5.88%。3 種原蟲血清陽性率之間差異不顯著（P＞0.05）。

表2 629份臨床樣品檢測結(jié)果統(tǒng)計表Table 2 Statistical table of test results of 629 clinical samples

2.7 混合感染情況匯總

將629 份臨床樣品的混合感染情況進行統(tǒng)計分析，結(jié)果如表3 所示。弓形蟲和環(huán)形泰勒蟲的混合感染率為2.23%，弓形蟲和新孢子蟲的混合感染率為3.50%，新孢子蟲和環(huán)形泰勒蟲的混合感染率為4.13%，3種原蟲的混合感染率為3.82%?；旌细腥镜目傆嫺腥韭蕿?3.68%。

表3 629份臨床樣品檢測結(jié)果混合感染統(tǒng)計表Table 3 Statistical table of mixed infection of 629 clinical samples

2.8 不同季節(jié)檢測結(jié)果匯總

對629 份臨床樣品的檢測結(jié)果按季節(jié)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果如表4所示。春季、夏季、冬季檢測牦牛3種原蟲陽性率總計分別為29.34%、23.12%、29.37%?？傮w不同季節(jié)的陽性率差異不顯著（P＞0.05）。

表4 629份臨床樣品檢測結(jié)果時間統(tǒng)計表Table 4 Time statistics table of test results of 629 clinical samples

2.9 不同年齡牦牛檢測結(jié)果匯總

629 份血清樣品按照牦牛不同年齡檢測結(jié)果進行匯總，結(jié)果如表5 所示。0～3 歲的牦牛感染3 種原蟲的總計陽性率為27.83%，大于3 歲感染3 種原蟲的總計陽性率為27.46%。總體2 組不同年齡牦牛間的陽性率差異不顯著（P＞0.05）。

表5 不同年齡牦牛檢測結(jié)果統(tǒng)計表Table 5 Statistical table of detection results of yaks of different ages

2.10 影響牦牛弓形蟲、環(huán)形泰勒蟲和新孢子蟲的風(fēng)險因素

運用F檢驗和卡方檢驗判定牦牛的年齡和不同季節(jié)與其感染這3 種原蟲之間存在的相關(guān)聯(lián)系。結(jié)果如表6所示，季節(jié)和年齡均不是牦牛感染3種原蟲的風(fēng)險因素（P＞0.05）。

表6 年齡和季節(jié)與牦牛感染弓形蟲、環(huán)形泰勒蟲和新孢子蟲的風(fēng)險關(guān)系Table 6 Odds ratio of age and season of yak as risk factors for T.gondii，T.annulata and N.caninum

3 討論

由于弓形蟲與新孢子蟲的混合感染加重了治療的復(fù)雜性［20-21］，加之環(huán)形泰勒蟲在牛群中的普遍存在對牛具有的潛在危害［22］。為此，本研究建立了檢測弓形蟲、環(huán)形泰勒蟲和新孢子蟲的多重PCR 方法，可為預(yù)防上述3種寄生蟲感染提供參考。

在多重PCR 建立過程中，引物的設(shè)計對試驗的特異性和擴增效率起著至關(guān)重要的作用［23］。因此，本研究根據(jù)弓形蟲、環(huán)形泰勒蟲和新孢子蟲的保守序列，分別設(shè)計3 對特異性引物，且擴增弓形蟲（520 bp）、環(huán)形泰勒蟲（341 bp）、新孢子蟲（156 bp）的片段大小差異大于100 bp，便于電泳后觀察條帶。此外，對多重PCR反應(yīng)的退火溫度、循環(huán)數(shù)進行優(yōu)化［24］。本試驗首先優(yōu)化單重PCR 反應(yīng)體系，確定多重PCR 反應(yīng)體系中最佳循環(huán)數(shù)為35個循環(huán)，最佳退火溫度為57 ℃，并且弓形蟲、環(huán)形泰勒蟲和新孢子蟲最低檢出下限分別達到0.01、0.02和0.01 ng·μL-1，成功建立了弓形蟲、環(huán)形泰勒蟲和新孢子蟲3種常見寄生蟲的多重PCR檢測方法。

本研究應(yīng)用該多重PCR 檢測方法，對甘南地區(qū)2021年采集的629份樣品進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)弓形蟲、環(huán)形泰勒蟲和新孢子蟲混合感染率分別為4.29%、3.66%、5.88%，表明弓形蟲、環(huán)形泰勒蟲和新孢子蟲在甘南牦牛中均有感染，其中新孢子蟲單一陽性率最高，環(huán)形泰勒蟲陽性率最低，混合感染率高達13.67%。本試驗在甘南地區(qū)采集的629 份牦牛血清中，新孢子蟲陽性率為5.88%，這與Koiwai等［25］對日本的2 420份牛血清進行研究，陽性率為5.8%的結(jié)果接近。趙鵬等［26］報道長春地區(qū)牛感染弓形蟲的總體陽性率為6.00%；王芝英等［27］研究發(fā)現(xiàn)重慶市牛弓形蟲平均陽性率為27.25%；而巴西米納斯吉拉斯地區(qū)的牛弓形蟲血清陽性率高達60.29%［28］。本研究發(fā)現(xiàn)甘南地區(qū)牦牛環(huán)形泰勒蟲的陽性率為3.66%，低于其他研究，但環(huán)形泰勒蟲對牛群的危害仍不能輕視。此外，本試驗對甘南地區(qū)的牦牛血清檢測，發(fā)現(xiàn)弓形蟲、環(huán)形泰勒蟲和新孢子蟲陽性率整體低于我國各個地區(qū)的平均值［29］，說明不同地區(qū)、不同國家牛群間的弓形蟲、環(huán)形泰勒蟲和新孢子蟲感染率差異較大。甘南地區(qū)牦牛弓形蟲、環(huán)形泰勒蟲和新孢子蟲感染水平較低的原因可能與該地區(qū)氣候條件有關(guān)。甘南地處高原，大部分地區(qū)海拔在3 000 m 以上，常年氣溫較低，晝夜溫差大，日照強烈，這些環(huán)境因素均不利于弓形蟲、環(huán)形泰勒蟲和新孢子蟲卵囊的生長和繁殖，這與Sarvi 等［30］研究結(jié)果不同。與寒冷干燥地區(qū)相比，弓形蟲卵囊通常在溫暖、潮濕的氣候和低海拔地區(qū)更普遍，存活時間更長［31］。對于弓形蟲、環(huán)形泰勒蟲和新孢子蟲的混合感染，國內(nèi)外研究報道較少，而本研究發(fā)現(xiàn)2021年甘南地區(qū)牦牛弓形蟲和環(huán)形泰勒蟲的混合感染率為2.23%，弓形蟲和新孢子蟲的混合感染率為3.50%，新孢子蟲和梨形蟲的混合感染率為4.13%，3 種原蟲的混合感染率為3.82%，其中二重感染為混合感染的主要模式，占混合感染的9.86%?；旌细腥绢愋统识鄻踊?，臨床不易區(qū)分，傳統(tǒng)或單一PCR 檢測方法可易造成漏檢和誤診。當(dāng)前甘南地區(qū)牦牛3 種血液原蟲的混合感染嚴重程度較低，混合感染的總計感染率為13.68%，應(yīng)密切監(jiān)測流行現(xiàn)狀和趨勢，防止牦牛出現(xiàn)大規(guī)模混合感染。

本研究還分析了3 種原蟲血清陽性率和季節(jié)、年齡之間的關(guān)系。結(jié)果表明，隨著春、夏、冬季節(jié)的變化，3 種原蟲的單一感染率逐漸增加，3 種原蟲均為冬季的血清陽性率最高，其次是夏季，春季血清陽性率最低。同一季節(jié)中，均表現(xiàn)為新孢子蟲的血清陽性率最高，其次是弓形蟲，環(huán)形泰勒蟲血清陽性率最低，這與于晉海等［32］的研究結(jié)果相符。但風(fēng)險因素分析發(fā)現(xiàn)季節(jié)不是牦牛感染3 種原蟲的風(fēng)險因子（P＞0.05）。其次，弓形蟲、環(huán)形泰勒蟲和新孢子蟲的陽性率在不同年齡之間差異不顯著（P＞0.05），可知年齡不是牦牛感染弓形蟲、環(huán)形泰勒蟲和新孢子蟲的風(fēng)險因素，說明3種原蟲均可感染各個年齡階段的牦牛，推測牦牛感染寄生蟲的主要原因是牦牛放牧的牧場有其他動物（馬、牛、狗）并與其頻繁接觸。不同地區(qū)的環(huán)境差異可能是造成牦牛弓形蟲、環(huán)形泰勒蟲和新孢子蟲感染率不同的原因。

4 結(jié)論

本研究建立了一種靈敏性好、特異性強的弓形蟲、環(huán)形泰勒蟲和新孢子蟲多重PCR 檢測方法，并對甘肅省甘南地區(qū)牦牛感染弓形蟲、環(huán)形泰勒蟲和新孢子蟲進行了流行病學(xué)調(diào)查，其混合感染率為13.68%，在風(fēng)險因素方面，耗牛感染3 種血液原蟲均與季節(jié)、年齡無關(guān)。