陳玉靜 丁一倩 周明兵

（浙江農(nóng)林大學，省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，竹子研究院，浙江 杭州 311300）

植物細胞中，除可編碼蛋白的信使RNA（mRNA）以外，還存在著諸多類型的非編碼RNA，包含核糖體RNA（rRNA）、轉(zhuǎn)運RNA（tRNA）、反式作用tasiRNA、小干擾RNA（siRNA）、小核仁RNA（snoRNA）、小核RNA（snRNA）長鏈非編碼RNA（lncRNA）、微小RNA（miRNA）和環(huán)狀RNA（circRNA）等［1］。其中circRNA廣泛參與脅迫響應，逐漸成為近幾年的研究熱點。

circRNA 第一次被發(fā)現(xiàn)是在高等植物的類病毒中［2-3］。隨著高通量測序和生物信息學的發(fā)展，在古菌、秀麗線蟲、小鼠、大鼠和人類中同樣發(fā)現(xiàn)了大量環(huán)狀RNA［4-5］。雖然circRNA 在植物中被首次鑒定［6］，但植物circRNA 的研究相對落后。近幾年circRNA 在單子葉植物水稻［7］、小麥［8］和玉米［9］，雙子葉植物擬南芥［10］、茶樹［11］、沙棘［12］、苧麻［13］等植物中相繼被發(fā)現(xiàn)。為了大規(guī)模鑒定circRNA，很多預測circRNA 的軟件被開發(fā)出來，如CIRI2［14］、CIRI-full［15］、CircAST［16］、find_circ［17］、CircRNAwrap［18］等均為用于預測動物circRNA 的軟件；CircPlant［19］和PCirc［20］是特異性針對植物circRNA 的鑒定軟件，能更準確、有效地識別植物中的circRNA。

目前已有研究表明，circRNA 在受到非生物脅迫時會發(fā)生差異表達。例如，擬南芥在弱光和強光脅迫后，circRNA發(fā)生明顯的差異表達［1］；在鹽脅迫下，對黃瓜進行circRNA 分析，發(fā)現(xiàn)有差異表達［21］；在高溫脅迫下，circRNA 在番茄葉片中的表達量也有所上升或者下降［22］。非生物脅迫不僅會使circRNA 表達量發(fā)生改變，而且會影響前體mRNA 的選擇性剪接，進而影響circRNA的形成［16］。

有證據(jù)表明circRNA是細胞不同RNA互作的網(wǎng)絡重要組成部分。所有包含miRNA 結(jié)合位點的RNA 轉(zhuǎn)錄本可以通過競爭共享與miRNA 的相互作用［6］。與miRNA 競爭性結(jié)合，從而調(diào)控mRNA 的非編碼RNA稱為競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）［23-25］。第一個ceRNA 是在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的，該研究表明非編碼RNA IPS1 可以通過與miR399 結(jié)合來影響PHO2的表達水平［26］。近期同樣有研究表明circRNA 是ceRNAs的重要成員，通過miRNA 調(diào)節(jié)靶基因的表達。例如，有報道發(fā)現(xiàn)CircFN1可以通過CircFN1-miR-19a/b-3p-ATF2網(wǎng)絡調(diào)控氧化應激誘導的滋養(yǎng)細胞凋亡以及增殖和遷移［27］。

毛竹在我國分布極其廣泛，是集眾多功能于一體的筍材兩用竹種。目前，關于circRNA 參與毛竹生長發(fā)育的研究已經(jīng)取得了一定進展。轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，毛竹的開花植株比3 周齡幼苗、1 歲植株、明年開花植株和小花中存在數(shù)量更多的circRNA；circRNA 的側(cè)邊內(nèi)含子在長末端重復（long terminal repeat，LTR）反轉(zhuǎn)座子中存在高甲基化和富集，說明circRNA 參與了毛竹開花的調(diào)控［28］。另有研究也發(fā)現(xiàn)，circRNA 可以通過與miRNA 和mRNA 的調(diào)控網(wǎng)絡相互作用，參與毛竹竹筍的生長［29］。

吳佳軍［30］前期構建了低溫、高溫、紫外、高鹽等4種脅迫全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫。為研究毛竹響應脅迫機制，本研究利用上述4種脅迫全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，篩選并鑒定在紫外（ultar-violet，UV）脅迫和高溫下都差異表達的1個circRNA，命名為PhcircRNA1；分析與PhcircRNA1協(xié)同表達的miRNA 和mRNA，構建circRNA - miRNA - mRNA調(diào)控網(wǎng)絡，研究PhcircRNA1參與毛竹脅迫響應和根尖中生長發(fā)育調(diào)控的機制，以期為circRNA 調(diào)控毛竹的生長發(fā)育提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

毛竹（Phyllostachys edulis）種子均采自廣西桂林市靈川縣同一株母竹。剝好的種子用反滲透水浸泡3 d后，再用10%次氯酸鈉浸泡消毒，之后在墊上濾紙的培養(yǎng)皿中催芽培養(yǎng)后，再移栽到盆里，培養(yǎng)基質(zhì)為泥炭：蛭石：珍珠巖，體積比例為3∶1∶1。

1.2 材料處理

毛竹長至五葉一心時期，將其暗處理3 d后進行脅迫處理。脅迫處理條件：1）42 ℃高溫脅迫（4、6、8 h）［31］；2）紫外脅迫（2、4、6 h）［32］；對照（CK）培養(yǎng)條件為正常光照下28 ℃培養(yǎng)，取五葉一心葉片進行液氮速凍，存于-80 ℃冰箱。毛竹種子催芽處理后，將其水培培養(yǎng)。根據(jù)毛竹根生長的發(fā)育規(guī)律，待毛竹主根長至0.5～1 cm時，以水培15、30、35 d 的0.5 mm 左右根尖作為材料［33-35］，進行液氮速凍后于-80 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆?。提取RNA時，每管使用6株毛竹的根尖。所有樣品均設置3次生物學重復。

1.3 毛竹總RNA提取和cDNA合成

采用天根生化有限公司RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒提取RNA。RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA 的試劑盒分為兩種：Hifair?III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（gDNA digester plus）試劑盒［翌圣生物科技（上海）股份有限公司］，和miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit （by stem-loop）試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）；反轉(zhuǎn)錄miRNA 所用莖環(huán)引物：5＇-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACT GGATACGACGTGCCC-3＇，同時加入5.8S rRNA 的下游引物一起進行反轉(zhuǎn)錄。最后將得到的cDNA 保存在-20 ℃冰箱備用。

1.4 毛竹circRNA的篩選與鑒定

使用find_circ［17］軟件對毛竹中circRNA 進行預測。首先從全轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)［30］的毛竹基因組中不能比對上的序列片段（reads）兩端各取20 bp 作為錨點，將錨點作為reads 與基因組進行比對，當錨點比對位置與轉(zhuǎn)錄本中位置相反時，延長錨點read 直至找到circRNA 接合位置。選擇在兩端序列存在GT/AT 剪接信號，且片段數(shù)量（read count）大于等于2 的circRNA作為候選circRNA。利用浙江農(nóng)林大學周明兵課題組（本課題組）前期研究得到的4 種脅迫全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫［30］，在該毛竹circRNA數(shù)據(jù)庫中，以|log2 fold change|≥1且P＜0.05 作為篩選標準，篩選了1 個在紫外脅迫和高溫脅迫下都差異表達的circRNA，命名為PhcircRNA1。利用植物小RNA 標靶分析軟件psRNATarget（v2）（參數(shù)設置：最大期待值設置為5，互補性評分長度設置為19），分析得到PhcircRNA1的靶miRNA，該miRNA 與miRNA156 成熟序列［35］只相差1 個堿基，命名為PhmiR156。用TargetFinder［36］軟件對Ph-miR156 進行靶基因預測，再在4 種脅迫全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫［30］中篩選出在紫外和高溫脅迫下均差異表達的靶基因。

1.5 PhcircRNA1的成環(huán)和穩(wěn)定性分析

設計引物前，先將5＇端和3＇端各自截取300 bp 序列，將3＇端截取的序列置于5＇端頭部，形成一個新序列，用Primer 5.0 軟件設計跨環(huán)化位點的發(fā)散引物（divergent primers）。

核糖核酸酶R（ribonuclease R，RNase R）是一種來源于大腸桿菌RNR 超家族的3＇→5＇核糖核酸外切酶，可從3＇→5＇方向?qū)NA 逐步切割成二核苷酸和三核苷酸。RNase R可消化幾乎所有的線性RNA分子，但不易消化環(huán)形RNA［37］。將0.5 μL RNase R加入到2.5 μg毛竹RNA 中，37 ℃孵育30 min，把消化后的RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用發(fā)散引物鑒定PhcircRNA1穩(wěn)定性。

1.6 實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)

PhcircRNA1和靶基因用普通反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板，NTB作為內(nèi)參，用Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix 試劑盒［翌圣生物科技（上海）股份有限公司］進行PhcircRNA1和靶基因定量分析，通過Primer 5.0 軟件設計qRT-PCR 引物（表1）。miRNA（PhmiR156）用miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到的cDNA 作為模板，以5.8S rRNA 作為內(nèi)參，利用miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix 試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）進行miRNA 定量分析。利用qRT-PCR 和2-△△Ct法分析PhcircRNA1、miRNA（Ph-miR156）和mRNA 的相對表達量。反應體系共20 μL：10 μL SYBR，0.5 μL 上游引物，0.5 μL 下游引物，1 μL cDNA，8 μL ddH2O。反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃復性30 s，共40個循環(huán)。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 The sequence of the primers for qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 PhcircRNA1的鑒定

使用find_circ［35］軟件對毛竹中circRNA 預測后，結(jié)合4種脅迫全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫［30］，以|log2 fold change|≥1且P＜0.05作為篩選標準，篩選出在紫外脅迫和高溫脅迫下都差異表達的1 個circRNA，其前體序列位于moso_draft_hic_scaffold_16 染 色 體 （80360941～0361611、80385866～80388941），經(jīng)過反向剪接形成了由6 個外顯子和4 個內(nèi)含子組成的外顯子-內(nèi)含子型circRNA（exon-intron circular RNA，EIciRNA），并命名為PhcircRNA1（圖1-A）。利用植物小RNA 標靶分析軟件psRNATarget鑒定出與PhcircRNA1有17個互補配對堿基的1 個靶miRNA（圖1-B），該miRNA 與水稻miRNA156 相差1 個堿基（圖1-C），命名為PhmiR156。用TargetFinder［36］軟件對Ph-miR156 進行靶基因預測后，篩選出紫外脅迫和高溫脅迫（42 ℃）下均差異表達的4 個靶基因（圖1-D）：PH02Gene02319（Glutamate Receptor - Like Gene 3.1，GLR3.1），PH02Gene31266（Ubiquitin-conjugating enzyme，UBC28），PH02Gene28384（Cyclic Nucleotide-Gated Channel 8，CNGC8）和PH02Gene33036（Vernalization Insensitive 3-Like 1，VIL1）（圖2）。

圖1 PhcircRNA1的鑒定Fig.1 Identification of PhcircRNA1

圖2 PhcircRNA1- Ph-miR156-mRNA在不同脅迫處理下的表達分析Fig.2 Expression analysis of PhcircRNA1- Ph-miR156-mRNA in different stress treatments

2.2 PhcircRNA1成環(huán)驗證

在RNase R 消化處理后反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，分別用內(nèi)參NTB的定量引物和PhcircRNA1的發(fā)散引物進行PCR。結(jié)果顯示，RNase R 消化組中的NTB條帶明顯變淡，表明RNase R 對total RNA 中線性RNA 具有消化作用，而PhcircRNA1基本上沒有變化（圖3-A）。將PhcircRNA1的PCR 擴增片段進行膠回收，測序比對結(jié)果證實了PhcircRNA1首尾相連的特征（圖3-B），進一步證明PhcircRNA1符合環(huán)狀RNA特征。

圖3 PhcircRNA1成環(huán)驗證Fig.3 Verification of PhcircRNA1 cyclization

2.3 PhcircRNA1在紫外脅迫下的表達模式

為研究PhcircRNA1在紫外脅迫下的表達模式，對不同時間紫外處理下的PhcircRNA1進行差異表達分析。結(jié)果表明，在紫外脅迫（2、4、6 h）時，PhcircRNA1表達量呈先下降后上升趨勢，而4 個靶基因PH02Gene 02319（GLR3.1）、PH02Gene31266（UBC28）、PH02Gene2 8384（CNGC8）和PH02Gene33036（VIL1）表達量也先降低后升高，與PhcircRNA1表達趨勢一致，而Ph-miR156表達量呈先上升后下降趨勢，與PhcircRNA1和靶基因表達趨勢相反（圖4）。表明PhcircRNA1表達量下降會引起Ph-miR156 表達量升高，進一步降低4 個靶基因的表達量。說明在紫外脅迫下，PhcircRNA1-PhmiR156-mRNA調(diào)控通路符合競爭性內(nèi)源RNA機制。

圖4 PhcircRNA1- Ph-miR156-mRNA在紫外脅迫下的表達模式Fig.4 Expression patterns of PhcircRNA1-Ph-miR156-mRNA under ultraviolet stress

2.4 PhcircRNA1在高溫脅迫下的表達模式

為研究PhcircRNA1在高溫脅迫下的表達模式，對不同時間高溫脅迫下的PhcircRNA1進行差異表達分析（圖5）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在高溫脅迫（4、6、8 h）下PhcircRNA1表達量隨著高溫脅迫時間延長而降低，Ph-miR156 表達量呈升高趨勢，而4 個靶基因PH02Gene02319（GLR3.1）、PH02Gene31266（UBC28）、PH02Gene28384（CNGC8）和PH02Gene33036（VIL1）表達量呈降低趨勢，與PhcircRNA1表達趨勢一致。結(jié)合上文PhcircRNA1在紫外脅迫下的變化，進一步證實了PhcircRNA1- Ph-miR156-mRNA調(diào)控通路的真實性。

圖5 PhcircRNA1- Ph-miR156-mRNA在高溫脅迫下的表達模式Fig.5 Expression patterns of PhcircRNA1-Ph-miR156-mRNA under high temperature stress

2.5 PhcircRNA1在毛竹根尖中的表達模式

取毛竹生長不同時期（0、15、30、35 d）的根尖作為研究對象（圖6-A）。通過qRT-PCR 分析GLR3.1表達模式的變化，在0～15 d 時，PhcircRNA1和GLR3.1表達量下降，15～30 d時表達量上升，30～35 d時表達量再次下降，Ph-miR156表達趨勢與PhcircRNA1和GLR3.1表達趨勢相反（圖6-B），說明PhcircRNA1可能通過調(diào)控Ph-miR156和GLR3.1參與毛竹根尖的生長發(fā)育。

圖6 PhcircRNA1在毛竹四個生長時期根尖的表達模式Fig.6 Expression patterns of PhcircRNA1 in moso bamboo root tip at four growth stages

3 討論

circRNA 是一種具有多種生物學功能的新型調(diào)控RNA，在植物中大量分布，通常來自外顯子、內(nèi)含子以及基因間區(qū)域。本研究根據(jù)本課題組前期研究得到的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選并鑒定到PhcircRNA1以及其調(diào)控的miRNA 和4 個靶基因，PhcircRNA1是由位于moso_draft_hic_scaffold_16 染 色 體（80360941～0361611、80385866～80388941）的前體序列反向剪接形成的EIciRNA。在植物中，circRNA 的反向剪接位點側(cè)翼序列中重復元件或反向互補區(qū)域的富集較少［38］，具有更多的選擇性剪接位點以及非規(guī)范反向剪接位點［39］，在不同物種之間的保守性較低［40］。circRNA 作為ceRNAs，在miRNA 介導的轉(zhuǎn)錄后基因表達調(diào)控中發(fā)揮重要作用。如在擬南芥中，circRNAs 可能通過螯合影響與過氧化氫、植物激素和熱應激有關基因的表達［41］；在番茄中，circRNA45和circRNA47可能通過調(diào)節(jié)miRNA-mRNA 表達水平，在番茄抗性中起正調(diào)節(jié)作用，最終增強植物抗性［42］。但是circRNA 的研究主要集中在人類和動物疾病中［43］，而在植物中circRNA 的研究相對較少，大量circRNA 及其功能需要進一步挖掘。

PhcircRNA1調(diào)控的miR156 是調(diào)控植物開花的重要因子［44］，4 個靶基因中PH02Gene31266（UBC28）、PH02Gene28384（CNGC8）和PH02Gene33036（VIL1）均與植物開花相關［45-47］，其中UBC28是泛素結(jié)合酶基因，可以編碼一種新的RING finger 蛋白，在泛素蛋白酶體系統(tǒng)中參與了蛋白質(zhì)降解的調(diào)控，影響煙草的生長發(fā)育［48］。在擬南芥中，UBC突變體在長日照和短日照條件下均表現(xiàn)出早花表型［45］。CNGC8是環(huán)狀核苷酸化通道，有研究報道花粉管特異性環(huán)狀核苷酸化通道（CNGC8）與鈣調(diào)蛋白2 共同構成一個分子開關，該開關可根據(jù)細胞鈣水平控制鈣通道的開啟或關閉，從而控制開花植物的花粉管生長［46］。VIL1是春化相關基因，短日照時通過染色質(zhì)修飾可以抑制FLOWER LOUS M（FLM），從而促進擬南芥開花［47］。GLR3.1在水稻中可以編碼一種典型的谷氨酸受體樣蛋白，與根頂端分生組織（root apical meristem，RAM）中的細胞增殖和細胞存活有關，在水稻中GLR3.1的缺失會抑制根尖的伸長［49］。本研究結(jié)果表明，在紫外線脅迫和高溫脅迫下，PhcircRNA1-Ph-miR156-mRNA 在毛竹中均有差異表達，且PhcircRNA1與4 個靶基因表達趨勢一致，與Ph-miR156 表達趨勢相反。在高溫脅迫下，PhmiR156 表達量上升，與在擬南芥中的研究結(jié)果一致［50-51］。4個靶基因的qRT-PCR結(jié)果與全轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果相同，在高溫脅迫與紫外脅迫下表達量都呈現(xiàn)下降趨勢，說明PhcircRNA1可能通過調(diào)控Ph-miR156 來調(diào)控靶基因的表達，參與毛竹的開花和生長發(fā)育。本研究展示了PhcircRNA1- Ph-miR156-mRNA 調(diào)控通路，后期將通過雙熒光素酶試驗進一步驗證該調(diào)控網(wǎng)絡的準確性。

已有研究表明，毛竹根生長速率在15 d 時最快，30 d 變緩慢直至35 d 時趨于停滯［33］。本研究調(diào)查了PhcircRNA1在不同生長速率毛竹根尖的表達模式，結(jié)果表明PhcircRNA1和GLR3.1表達趨勢一致，與PhmiR156 表達趨勢相反。毛竹生長至15 d 時，PhmiR156 表達量最高，毛竹根長生長速率最高，說明PhcircRNA1通過Ph-miR156調(diào)控GLR3.1的表達，可能影響毛竹根的生長發(fā)育。但是PhcircRNA1如何通過調(diào)節(jié)Ph-miR156從而影響靶基因表達的具體機制仍有待進一步探究。

4 結(jié)論

本研究鑒定了1 個參與毛竹高溫脅迫和紫外脅迫的非編碼調(diào)控RNA-PhcircRNA1，構建了PhcircRNA1-Ph-miR156-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡，推測PhcircRNA1可能作為Ph-miR156 海綿，調(diào)控GLR3.1的表達，在毛竹根尖的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。