鄭文旭，張保朝，李富慧，方 立

缺血性腦卒中(ischemic stroke，IS)是臨床常見腦血管疾病，致殘率、病死率極高，臨床調(diào)查顯示，我國(guó)70%左右腦血管疾病病人屬于缺血性腦卒中，缺血性腦卒中的預(yù)防和治療形勢(shì)十分嚴(yán)峻[1]。研究顯示，急性缺血性腦卒中后瀑布效應(yīng)引起的血腦屏障通透性增加及隨之繼發(fā)的腦水腫是導(dǎo)致疾病高致殘率和病死率的主要原因[2-3]。因此，缺血性腦卒中搶救過(guò)程中，除及時(shí)溶栓治療外，減輕血腦屏障通透性破壞對(duì)減輕缺血性腦卒中繼發(fā)性腦損傷十分重要。近年來(lái)，中醫(yī)藥因低毒、來(lái)源廣泛、效果明顯等優(yōu)勢(shì)在臨床中已廣泛用于心腦血管等疾病的防治。缺血性腦卒中屬中醫(yī)“中風(fēng)”范疇，本病多為本虛標(biāo)實(shí)，以氣血逆亂、氣化停滯、氣虛血瘀為基本病機(jī)，故治療應(yīng)以益氣活血為要[4]。補(bǔ)陽(yáng)還五湯是由清代王清任創(chuàng)立的益氣活血經(jīng)典名方，具有抗氧自由基毒性、增加心腦血管血流量、改善微循環(huán)等作用，臨床已廣泛用于腦卒中后遺癥的治療，療效確切[5]。本課題組前期臨床研究顯示，補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療缺血性腦卒中病人，可有效改善病人臨床癥狀和體征，療效確切，但其具體作用機(jī)制尚不明確[6]。為此，本研究采用線栓法復(fù)制大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠模型，通過(guò)補(bǔ)陽(yáng)還五湯干預(yù)，評(píng)估補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)MCAO腦損傷及血腦屏障通透性的影響，并進(jìn)一步探討其調(diào)控機(jī)制，為臨床應(yīng)用補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療缺血性腦卒中提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)雄性SD大鼠，75只，4周齡，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2019-0008，使用許可證號(hào)SYXK(京)2019-0022。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作符合減少、替代、優(yōu)化3R原則。

1.1.2 藥物制備 補(bǔ)陽(yáng)還五湯煎劑：黃芪120 g，當(dāng)歸尾6 g，赤芍5 g，川芎3 g，桃仁3 g，紅花3 g，地龍3 g，加水浸泡4 h，水煎2次，煎液濃縮至生藥含量為2 g/mL，pH 7.0。中藥藥材由河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院提供。

1.1.3 主要試劑和儀器 注射用血塞通凍干粉(黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20026437，400 mg)，神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒(美國(guó)Mybiosource公司)，伊文思藍(lán)[EVans Blue，EB，阿拉丁試劑(上海)有限公司]，兔抗大鼠Wnt3a、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、水通道蛋白-4(AQP-4)、緊密連接相關(guān)蛋白(Claudin-5)多抗(美國(guó)Abcam公司)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。DYY-12D型電泳儀、水平電泳槽(北京六一生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組及干預(yù) 75只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、MCAO組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯組、血塞通組及聯(lián)合組，每組15只，除假手術(shù)組未進(jìn)行栓塞外，余各組采用線栓法建立MCAO大鼠模型。取建模成功大鼠，MCAO組13只，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組13只，血塞通組14只，聯(lián)合組14只，均于術(shù)后2 h進(jìn)行干預(yù)。補(bǔ)陽(yáng)還五湯組按5 mL/kg體質(zhì)量灌胃補(bǔ)陽(yáng)還五湯煎液(含生藥2 g/mL)，每日1次，連續(xù)7 d；血塞通組尾靜脈注射10 mg/kg體質(zhì)量的血塞通注射液，每日1次，連續(xù)7 d；聯(lián)合組灌胃補(bǔ)陽(yáng)還五湯煎液后2 h尾靜脈注射血塞通，給藥劑量及給藥方式同前。

1.2.2 MCAO模型制備 采用線栓法建立MCAO模型[7]：戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠，仰臥位固定大鼠，頸部剃毛備皮，頸部正中切口，鈍性分離頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，從左側(cè)頸總動(dòng)脈近心端及頸外動(dòng)脈分叉處用手術(shù)線結(jié)扎，然后在頸總動(dòng)脈分叉處開一小口，將灼燒光滑的一端從切口處緩慢向入顱方向推進(jìn)，推進(jìn)18～20 cm遇阻力時(shí)停止(假手術(shù)組僅推進(jìn)1 cm)，手術(shù)線結(jié)扎固定尼龍線，清理術(shù)區(qū)，縫合傷口并消毒。大鼠清醒后，采用Longa法評(píng)估各組神經(jīng)功能，無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)異常表現(xiàn)計(jì)0分；不能完全伸展右側(cè)前爪計(jì)1分；行走時(shí)旋轉(zhuǎn)計(jì)2分；行走傾倒計(jì)3分；無(wú)自發(fā)活動(dòng)或意識(shí)昏迷計(jì)4分；以評(píng)分1～4分為建模成功，剔除術(shù)中或術(shù)后24 h內(nèi)死亡大鼠。

1.2.3 大鼠行為學(xué)評(píng)估 給藥1 d、3 d、7 d采用Longa法評(píng)估各組神經(jīng)功能，評(píng)估方法同前述；采用貼紙去除實(shí)驗(yàn)評(píng)估大鼠感覺功能[8]：將大鼠放置于50 cm×50 cm方形箱子中，適應(yīng)5 min后，將貼紙貼在雙側(cè)前肢遠(yuǎn)端放射狀區(qū)域，放回箱子，攝像頭記錄雙側(cè)貼紙所需時(shí)間，若120 s內(nèi)未去除貼紙則計(jì)120 s，每只大鼠測(cè)試5次，每次間隔5 min，取平均值。

1.2.4 血清中樞神經(jīng)特異性蛋白(S-100β)、NSE水平檢測(cè) 給藥1 d、3 d、7 d，大鼠尾靜脈采血2 mL，室溫靜置分層后，3 500 r/min離心8 min，離心半徑10 cm，取血清采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)待測(cè)血清樣本，按照試劑盒說(shuō)明書步驟操作，于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)血清中S-100β、NSE含量。

1.2.5 血腦屏障通透性檢測(cè) 給藥7 d末次采血完畢后，每組隨機(jī)取7只大鼠，采用EB染色檢測(cè)各組血腦屏障通透性。按照4 mL/kg尾靜脈注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% EB溶液，2 h后，腹腔麻醉大鼠，剖開胸腔暴露心臟，剪開右心耳，從左心室灌注生理鹽水，至灌注液無(wú)色透明。冰上斷頭取腦，矢狀縫切開左右腦，稱重后加入1 mL/100 mg腦組織的甲酰胺溶液，37 ℃恒溫箱孵育48 h，勻漿后，12 000 r/min離心20 min(離心半徑12 cm)，取上清液于620 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)光密度值，根據(jù)EB標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算EB含量(μg/mL)。

1.2.6 腦組織中Wnt3a、β-catenin、AQP-4、Claudin-5 mRNA表達(dá)量檢測(cè) 給藥7 d末采血完畢后，每組隨機(jī)取6只大鼠，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法檢測(cè)腦組織各基因表達(dá)情況。脫臼處死大鼠，冰上分離腦組織，取缺血側(cè)腦組織，Trizol法提取總RNA，測(cè)定RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA并以之為模板進(jìn)行擴(kuò)增，按照試劑盒說(shuō)明配置反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；40個(gè)重復(fù)(94 ℃變性30 s，57 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s)；72 ℃再延伸5 min。2-△△CT法計(jì)算目的基因Wnt3a、β-catenin、AQP-4、Claudin-5的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。Wnt3a、β-catenin以β-actin為內(nèi)參對(duì)照，AQP-4、Claudin-5以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參對(duì)照。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.7 腦組織中Wnt3a、β-catenin、AQP-4、Claudin-5 mRNA表達(dá)量檢測(cè) 采用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)法檢測(cè)腦組織中各蛋白表達(dá)情況。取缺血側(cè)腦組織，液氮中研磨并轉(zhuǎn)至離心管，加入細(xì)胞裂解液冰上裂解25 min，4 ℃預(yù)冷離心機(jī)12 000 r/min離心15 min(離心半徑12 cm)，取上清液進(jìn)行蛋白定量；取50 μg待測(cè)樣本與等體積上樣緩沖液混勻后，沸水浴8 min，12 000 r/min離心15 min(離心半徑12 cm)，取上清液進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，加入封閉液室溫封閉2 h，加入稀釋一抗[Wnt3a、β-catenin(1∶300)，AQP-4、Claudin-5(1∶500)]，4 ℃孵育過(guò)夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次×10 min后，加入二抗稀釋液(1∶5 000)，常溫孵育2 h，于暗室中曝光顯影。掃描膠片后采用Image J圖像分析軟件分析各條帶灰度值，Wnt3a、β-catenin與內(nèi)參β-actin灰度值比值及AQP-4、Claudin-5與內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般情況觀察 75只大鼠參加實(shí)驗(yàn)，假手術(shù)組15只大鼠全部存活，MCAO組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯組、血塞通組及聯(lián)合組分別剔除建模失敗或死亡大鼠2只、2只、1只、1只，其余大鼠參與后續(xù)實(shí)驗(yàn)。假手術(shù)組術(shù)后蘇醒精神狀態(tài)逐漸轉(zhuǎn)好，術(shù)后1 d精神狀態(tài)逐漸恢復(fù)；MCAO組出現(xiàn)喜臥、精神萎靡、局部毛發(fā)脫落、對(duì)外界刺激不敏感、行為能力下降等現(xiàn)象，隨著觀察時(shí)間延長(zhǎng)無(wú)明顯改善；補(bǔ)陽(yáng)還五湯組、血塞通組及聯(lián)合組給藥期間精神狀態(tài)有所恢復(fù)，行為能力及反應(yīng)能力有所恢復(fù)，隨給藥時(shí)間延長(zhǎng)逐漸好轉(zhuǎn)，且聯(lián)合組好轉(zhuǎn)最為明顯。

2.2 大鼠行為學(xué)評(píng)估 與假手術(shù)組比較，MCAO組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯組、血塞通組及聯(lián)合組給藥1 d、3 d、7 d神經(jīng)功能評(píng)分及貼紙去除時(shí)間均升高(P<0.05)；與MCAO組比較，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組、血塞通組及聯(lián)合組給藥3 d、7 d神經(jīng)功能評(píng)分及貼紙去除時(shí)間均降低(P<0.05)；與補(bǔ)陽(yáng)還五湯組和血塞通組比較，聯(lián)合組給藥3 d、7 d神經(jīng)功能評(píng)分及貼紙去除時(shí)間均降低(P<0.05)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組與血塞通組給藥1 d、3 d、7 d比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，MCAO組神經(jīng)功能評(píng)分及貼紙去除時(shí)間無(wú)明顯變化(P>0.05)，聯(lián)合組逐漸降低(P<0.05)；補(bǔ)陽(yáng)還五湯組和血塞通組給藥7 d神經(jīng)功能評(píng)分及貼紙去除時(shí)間明顯低于給藥1 d和給藥3 d(P<0.05)，給藥1 d與給藥3 d無(wú)明顯變化(P>0.05)。詳見表2、表3。

表2 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較(±s) 單位：分

表3 各組大鼠貼紙去除時(shí)間比較(±s) 單位：s

2.3 各組大鼠血清腦損傷標(biāo)志物水平比較 與假手術(shù)組比較，MCAO組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯組、血塞通組及聯(lián)合組血清S-100β、NSE水平均升高(P<0.05)；與MCAO組比較，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組、血塞通組及聯(lián)合組血清S-100β、NSE水平均降低(P<0.05)；聯(lián)合組血清S-100β、NSE水平低于補(bǔ)陽(yáng)還五湯組、血塞通組，血塞通組S-100β、NSE水平低于補(bǔ)陽(yáng)還五湯組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表4。

表4 各組大鼠血清腦損傷標(biāo)志物水平比較(±s) 單位：μg/L

2.4 各組大鼠血腦屏障通透性比較 假手術(shù)組、MCAO組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯組、血塞通組及聯(lián)合組腦組織中EB含量分別為(1.25±0.20)μg/mL、(9.12±1.13)μg/mL、(7.68±1.04)μg/mL、(7.05±1.06)μg/mL、(6.11±1.12)μg/mL，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=134.467，P<0.001，n=7)。與假手術(shù)組比較，MCAO組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯組、血塞通組及聯(lián)合組EB含量均升高(t值分別為25.270，22.179，19.759，15.779，P均<0.001)；與MCAO組比較，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組、血塞通組及聯(lián)合組EB含量均降低(t值分別為3.381，4.912，6.948，P均<0.01)；與補(bǔ)陽(yáng)還五湯組和血塞通組比較，聯(lián)合組EB含量均降低(t值分別為3.766，2.281，P均<0.05)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組和血塞通組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.557，P>0.05)。

2.5 各組大鼠腦組織中Wnt3a、β-catenin、AQP-4、Claudin-5 mRNA表達(dá)量比較 與假手術(shù)組比較，MCAO組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯組、血塞通組及聯(lián)合組腦組織Wnt3a、β-catenin、AQP-4 mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高，Claudin-5 mRNA相對(duì)表達(dá)量均降低(P<0.05)；與MCAO組比較，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組、血塞通組及聯(lián)合組腦組織Wnt3a、β-catenin、Claudin-5 mRNA相對(duì)表達(dá)量升高，且聯(lián)合組高于補(bǔ)陽(yáng)還五湯組和血塞通組(P<0.05)；與MCAO組比較，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組、血塞通組及聯(lián)合組腦組織AQP-4 mRNA相對(duì)表達(dá)量均降低，且聯(lián)合組低于補(bǔ)陽(yáng)還五湯組和血塞通組(P<0.05)。補(bǔ)陽(yáng)還五湯組和血塞通組Wnt3a、β-catenin、AQP-4、Claudin-5 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表5。

表5 各組大鼠腦組織中Wnt3a、β-catenin、AQP-4、Claudin-5 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

2.6 各組大鼠腦組織中Wnt3a、β-catenin、AQP-4、Claudin-5蛋白表達(dá)量比較 與假手術(shù)組比較，MCAO組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯組、血塞通組及聯(lián)合組腦組織Wnt3a、β-catenin、Claudin-5蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，AQP-4蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05)；與MCAO組比較，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組、血塞通組及聯(lián)合組腦組織Wnt3a、β-catenin、Claudin-5蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，且聯(lián)合組高于補(bǔ)陽(yáng)還五湯組和血塞通組(P<0.05)；與MCAO組比較，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組、血塞通組及聯(lián)合組腦組織AQP-4蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，且聯(lián)合組低于補(bǔ)陽(yáng)還五湯組和血塞通組(P<0.05)。補(bǔ)陽(yáng)還五湯組和血塞通組Wnt3a、β-catenin、AQP-4、Claudin-5蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖1。

與假手術(shù)組比較，＊ P<0.05；與MCAO組比較，# P<0.05；與補(bǔ)陽(yáng)還五湯組比較，△ P<0.05；與血塞通組比較，▲ P<0.05。

3 討 論

隨著我國(guó)老齡化加劇，缺血性腦卒中發(fā)病率逐年升高，已成為危害人們生命安全的主要疾病之一。缺血性腦卒中發(fā)病原因多種多樣，包括高齡、高血壓、高脂血癥等均是導(dǎo)致其發(fā)病的高危因素[9-10]。缺血性腦卒中發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，多種因素導(dǎo)致頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成，易損性斑塊進(jìn)入大腦中動(dòng)脈后導(dǎo)致腦組織血流供應(yīng)不足，進(jìn)而引起缺血缺氧性腦損傷[11-12]。血腦屏障的完整性是保持腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常運(yùn)行的基本結(jié)構(gòu)，腦缺血后，血腦屏障主要結(jié)構(gòu)毛細(xì)血管內(nèi)皮及細(xì)胞間緊密連接、神經(jīng)膠質(zhì)膜等結(jié)構(gòu)破壞，鈉泵功能障礙，血腦屏障通透性急速增加，引起體液外漏，繼發(fā)形成腦水腫[13-15]。因此，減輕血腦屏障通透性破壞對(duì)保護(hù)腦組織、促進(jìn)神經(jīng)功能改善有重要臨床意義。

本研究應(yīng)用補(bǔ)陽(yáng)還五湯干預(yù)MCAO大鼠后，其神經(jīng)功能評(píng)分降低，貼紙去除時(shí)間縮短，EB含量、血清S-100β、NSE水平均降低，且神經(jīng)功能評(píng)分、貼紙去除時(shí)間及血清S-100β、NSE水平與西藥血塞通比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩者聯(lián)合干預(yù)后改善更為明顯，說(shuō)明補(bǔ)陽(yáng)還五湯可有效減輕缺血性腦卒中大鼠腦損傷，降低血腦屏障通透性?，F(xiàn)代中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腦卒中后氣血逆亂，氣虛血滯，致腦絡(luò)瘀阻，氣化停滯，脈中津液不能正常運(yùn)化，水瘀互結(jié)而腦竅閉塞，水溢于腦[16]。王清任認(rèn)為，本病本虛標(biāo)實(shí)，氣虛為本，血瘀為標(biāo)，因虛致瘀是其致病機(jī)制，治療本病以補(bǔ)氣為主，活血通絡(luò)為主要原則，與現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)治療缺血性腦卒中思路一致[17]。補(bǔ)陽(yáng)還五湯以黃芪為君藥，大補(bǔ)元?dú)?，使氣血旺以治本；以?dāng)歸尾為臣藥，活血祛瘀，使脈絡(luò)通以治標(biāo)；另以赤芍、川芎、桃紅、紅花為佐藥，強(qiáng)化活血祛瘀功效，地龍為佐藥，通經(jīng)活絡(luò)，使周身脈絡(luò)通暢，強(qiáng)化藥力[18]。補(bǔ)陽(yáng)還五湯重補(bǔ)氣輔活血，標(biāo)本兼顧，諸癥向愈。張文敏等[19]研究表明，補(bǔ)陽(yáng)還五湯輔助治療急性腦梗死病人效果顯著，可有效改善病人神經(jīng)功能，提高生活質(zhì)量，安全可靠，說(shuō)明補(bǔ)陽(yáng)還五湯輔助治療急性期缺血性腦卒中效果確切。此外，陳旭寧等[20]應(yīng)用超微補(bǔ)陽(yáng)還五湯可有效改善恢復(fù)期缺血性腦卒中病人神經(jīng)功能及生活質(zhì)量，且抑郁癥狀得到緩解。林巧等[21]研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽(yáng)還五湯可輔助治療Ⅱ型精神分裂癥，升高血清腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，說(shuō)明補(bǔ)陽(yáng)還五湯可促進(jìn)腦神經(jīng)功能恢復(fù)。本研究依據(jù)補(bǔ)陽(yáng)還五湯組方各味中藥功能及配伍特點(diǎn)，重補(bǔ)氣促進(jìn)腦絡(luò)運(yùn)化，輔以活血祛瘀促進(jìn)腦竅通暢，血利則水通，使血腦屏障作用得以恢復(fù)。

此外，本研究顯示，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組大鼠腦組織中Wnt3a、β-catenin及緊密連接蛋白Claudin-5表達(dá)增加，而腦組織水通道蛋白AQP-4表達(dá)降低，且上述指標(biāo)表達(dá)與血塞通差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩者聯(lián)合干預(yù)后Wnt3a、β-catenin、Claudin-5增加及AQP-4降低更為明顯，說(shuō)明補(bǔ)陽(yáng)還五湯可能通過(guò)激活Wnt3a/β-catenin信號(hào)通路、上調(diào)Claudin-5、下調(diào)AQP-4表達(dá)發(fā)揮調(diào)控作用。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及神經(jīng)元細(xì)胞增殖、分化的重要調(diào)控通路。已有研究證實(shí)，腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路異常對(duì)血腦屏障功能及腦血管發(fā)育有重要影響，但對(duì)其他部位血管發(fā)育及功能無(wú)明顯影響[22-23]。Wnt3a是Wnt信號(hào)通路主要配體，通過(guò)與細(xì)胞膜特異性受體結(jié)合后，將信號(hào)傳至β-catenin，β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核后啟動(dòng)下游靶基因轉(zhuǎn)錄、翻譯等過(guò)程[24]。缺血缺氧腦損傷后激活Wnt信號(hào)通路，參與缺血缺氧條件的血管新生，修復(fù)受損腦組織，從而改善血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能[25]。Laksitorini等[26]研究顯示，Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性增強(qiáng)有助于維持血腦屏障通透性，與本研究結(jié)果相符。本研究應(yīng)用補(bǔ)陽(yáng)還五湯干預(yù)后，Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活，信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)，且緊密連接蛋白Claudin-5上調(diào)及水通道蛋白AQP-4下調(diào)，均有助于腦組織損傷的修復(fù)，說(shuō)明補(bǔ)陽(yáng)還五湯可通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)缺血性腦卒中腦組織修復(fù)，進(jìn)一步提示該信號(hào)通路可能是補(bǔ)陽(yáng)還五湯的靶點(diǎn)通路，可為臨床靶向治療提供新的思路。

綜上所述，補(bǔ)陽(yáng)還五湯可有效減輕缺血性腦卒中大鼠腦損傷，推測(cè)可能通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，上調(diào)緊密連接蛋白Claudin-5、下調(diào)水通道蛋白AQP-4表達(dá)，減輕血腦屏障的破壞，達(dá)到保護(hù)腦組織的作用。本研究新穎之處在于采用動(dòng)物試驗(yàn)探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯減輕缺血性腦卒中大鼠腦損傷的可能機(jī)制，可為臨床應(yīng)用補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療缺血性腦卒中提供理論基礎(chǔ)。由于研究時(shí)間及經(jīng)費(fèi)有限，補(bǔ)陽(yáng)還五湯是否通過(guò)其他信號(hào)通路減輕缺血性腦卒中大鼠腦損傷，仍需要進(jìn)一步研究證實(shí)。在進(jìn)一步的研究中應(yīng)開展多通路研究，以證實(shí)補(bǔ)陽(yáng)還五湯多靶點(diǎn)作用的特點(diǎn)，為其應(yīng)用于臨床治療缺血性腦卒中提供更為堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。