魯婷婷，汪吳嬌，楊志飛，任建勛，林 謙，萬 潔

再灌注治療是針對心肌缺血快速有效的治療方法，但在血管再通的同時(shí)，常導(dǎo)致心肌再灌注損傷，其主要的表現(xiàn)形式為再灌注心律失常(reperfusion arrhythmia，RA)[1]。研究表明，心肌梗死后溶栓或支架植入后，室性心律失常發(fā)生率高達(dá)80%；超過50%死亡病例的致死原因?yàn)樵俟嘧⑺滦穆墒С1-2]。因此，預(yù)防再灌注心律失常具有重要意義。參連復(fù)脈顆粒(專利號(hào)：ZL201310303390.5)是北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院協(xié)定處方。研究表明，參連復(fù)脈顆粒對室性心律失常具有一定的療效[3]。而再灌注心律失常以心室顫動(dòng)(VF)+室性心動(dòng)過速(VT)等室性心律失常為主[1]，本研究擬在前期基礎(chǔ)上，采用大鼠心肌再灌注損傷模型探討參連復(fù)脈顆粒對再灌注心律失常的藥效作用，并基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)一步探究其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠60只，無特定病原體(SPF)級，雄性，體質(zhì)量200～220 g，維通利華(北京)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0004。

1.1.2 藥物與試劑 參連復(fù)脈顆粒，由黨參、丹參、黃連、法半夏、赤芍、川芎、鬼箭羽、白芍、 遠(yuǎn)志、酸棗仁、炙甘草組成，提取浸膏粉，每克膏粉含4.27 g生藥，成人臨床日用量為40.5 g，批號(hào)：Z70301，由北京中醫(yī)藥大學(xué)附屬東方醫(yī)院提供。鹽酸美西律片(石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：377131203，規(guī)格：每片50 mg)，0.9%氯化鈉注射液(北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：C201202095)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 ALC-V8型小動(dòng)物呼吸機(jī)(上海奧爾科特生物技術(shù)有限公司)，心電圖解析系統(tǒng)(Softron SP-2006，北京軟隆生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 將60只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、美西律組、參連復(fù)脈顆粒低高劑量組、參連復(fù)脈顆粒中劑量組、參連復(fù)脈顆粒高劑量組，每組10只。假手術(shù)組：左冠狀動(dòng)脈前降支穿線不結(jié)扎，灌胃生理鹽水3 mL/kg；模型組：灌胃生理鹽水3 mL/kg；美西律組：灌胃鹽酸美西律60 mg/kg；參連復(fù)脈顆粒低、中、高劑量組：分別灌胃參連復(fù)脈顆粒2.0 g生藥/kg、4.0 g生藥/kg、8.0 g生藥/kg。各組采用的干預(yù)藥物均以生理鹽水配至所需濃度，經(jīng)灌胃口服給藥1次，給藥量為100 g體質(zhì)量1 mL。

1.2.2 造模方法 各組大鼠予相應(yīng)的藥物或生理鹽水灌胃30 min后，使用50 mg/kg劑量的戊巴比妥鈉腹腔麻醉，連接心電圖解析系統(tǒng)記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖，切開氣管，插入氣管插管，連接呼吸機(jī)，開胸，暴露心臟，于冠狀動(dòng)脈左前降支根部穿線，以備結(jié)扎；穿線后穩(wěn)定10 min，結(jié)扎(無ST段及T波改變者淘汰)，15 min后，剪斷結(jié)扎線，使前降支實(shí)現(xiàn)再灌注。再灌注后，動(dòng)物在1 min內(nèi)即出現(xiàn)室性期前收縮(PVC)、VT及VF等不同程度的心律失常。觀察再灌注后10 min內(nèi)PVC個(gè)數(shù)和VT+VF總時(shí)程。

1.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.3.1 參連復(fù)脈顆粒的組成及靶點(diǎn)預(yù)測 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php)獲得參連復(fù)脈顆粒各味藥的成分信息，篩選條件為經(jīng)口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18。同時(shí)預(yù)測成分的靶點(diǎn)。TCMSP數(shù)據(jù)庫中搜索不到的中藥，用BATMAN-TCM[4](http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/) 檢索，默認(rèn)設(shè)置，篩選有效成分及相應(yīng)潛在靶點(diǎn)。

1.3.2 再灌注心律失常疾病靶點(diǎn) 應(yīng)用OMIM數(shù)據(jù)庫(https：//omim.org/)和GeneCards(www.genecards.org)，以reperfusion arrhythmia為關(guān)鍵詞，刪除重復(fù)值，兩個(gè)數(shù)據(jù)庫取并集作為再灌注心律失常疾病靶點(diǎn)[5-6]。與上述參連復(fù)脈顆粒靶點(diǎn)取交集，得到參連復(fù)脈顆粒治療再灌注心律失常的作用靶點(diǎn)。

1.3.3 Venn圖繪制 應(yīng)用微生信在線平臺(tái)(http：//www.bioinformatics.com.cn/)將各單味藥及再灌注心律失常相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入，繪制Venn圖，找到多個(gè)單味藥共同作用的靶點(diǎn)。

1.3.4 京都基因與基因組百科全書(KEGG)分析 應(yīng)用Metascape(http：//metascape.org/)平臺(tái)，將參連復(fù)脈顆粒治療再灌注心律失常靶點(diǎn)導(dǎo)入，行KEGG富集分析，并對結(jié)果進(jìn)行可視化處理[7]。

1.3.5 關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)選擇 將參連復(fù)脈顆粒潛在靶點(diǎn)和再灌注心律失常疾病交集靶點(diǎn)，上傳至STRING數(shù)據(jù)(https：//www.string-db.org/)構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)，把最低相互作用閾值設(shè)為中等置信度(medium confidence=0.4)，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，將PPI網(wǎng)絡(luò)生成文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1，利用插件CytoCNA，將網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的介度(betweenness，BC)、緊密度(closeness，CC)均大于中位值，連接度(degree，DC)大于2倍中位值的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)。

2 結(jié) 果

2.1 參連復(fù)脈顆粒對PVC總個(gè)數(shù)及VT+VF總時(shí)程的影響 與模型組比較，參連復(fù)脈顆粒中、高劑量組及美西律組PVC總個(gè)數(shù)和VT+VF總時(shí)程均明顯下降(P<0.05或P<0.01)；參連復(fù)脈顆粒高、中、低劑量組VT+VF總時(shí)程高于美西律組(P<0.05或P<0.01)，而參連復(fù)脈顆粒高、中劑量組PVC總個(gè)數(shù)與美西律組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組PVC總個(gè)數(shù)及VT+VF總時(shí)程比較(±s)

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果

2.2.1 靶點(diǎn)預(yù)測 應(yīng)用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索參連復(fù)脈顆粒各味藥成分信息，預(yù)測靶點(diǎn)見表2，用UniProt(https：//www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫，對靶點(diǎn)基因名進(jìn)行規(guī)范化處理。其中，遠(yuǎn)志、鬼箭羽通過BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫檢索。最后得到藥物潛在靶點(diǎn)314個(gè)。在GeneCards中檢索到再灌注心律失常靶點(diǎn)993個(gè)，OMIM 中131個(gè)。去重后將2個(gè)數(shù)據(jù)庫再灌注心律失常靶點(diǎn)取并集得到疾病靶點(diǎn)1 076個(gè)。將藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，得到參連復(fù)脈顆粒治療再灌注心律失常潛在靶點(diǎn)136個(gè)，并對結(jié)果進(jìn)行可視化，詳見圖1。以作用于交集靶點(diǎn)排名前五種活性成分作為核心成分(共有成分以“S加數(shù)字”進(jìn)行編號(hào))，詳見表3。

表2 參連復(fù)脈顆粒中各中藥活性成分種數(shù)與對應(yīng)靶點(diǎn)數(shù) 單位：個(gè)

圖1 參連復(fù)脈顆粒和再灌注心律失常交集靶點(diǎn)Venn圖

表3 主要核心活性成分及其作用靶點(diǎn)

2.2.2 靶點(diǎn)篩選 在STRING數(shù)據(jù)平臺(tái)輸入136個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)浞治?，得到一個(gè)由136個(gè)節(jié)點(diǎn)和2 339條邊組成的網(wǎng)絡(luò)(見圖2A)。首先，以DC、BC和CC大于中位數(shù)進(jìn)行篩選，得到53個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 090條邊的網(wǎng)絡(luò)圖(見圖2B)； 然后，以DC大于中位數(shù)的2倍進(jìn)一步篩選，最終構(gòu)建一個(gè)26個(gè)節(jié)點(diǎn)和318條邊的參連復(fù)脈顆粒作用于再灌注心律失常核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(見圖2C)。用節(jié)點(diǎn)的大小表示 DC的大小，26 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)依次為蛋白激酶B1(AKT1)、腫瘤壞死因子(TNF)、白介素6(IL6)、白介素1β(IL1β)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)、細(xì)胞腫瘤抗原p53(TP53)、絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、半胱氨酸蛋白酶3(CASP3)、JUN、環(huán)加氧酶2(PTGS2)、表皮生長因子受體(EGFR)、一氧化氮合酶3(NOS3)、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARG)、信號(hào)傳導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活物3(STAT3)、CC趨化因子配體2(CCL2)、白介素10(IL10)、CXC趨化因子配體8(CXCL8)、 缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF1A)、細(xì)胞間黏附分子1(ICAM1)、Myc原癌基因蛋白(MYC)、雌激素受體1(ESR1)、FOS、熱休克蛋白90 AA1(HSP90AA1)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)抑制劑α(NFKBIA)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)、血紅素加氧酶1(HMOX1)。

圖2 共同靶點(diǎn) PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

2.2.3 靶點(diǎn)分析 KEGG富集分析結(jié)果見圖3。提示參連復(fù)脈顆粒通過調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、炎癥反應(yīng)等相關(guān)蛋白和信號(hào)通路發(fā)揮作用。參連復(fù)脈顆粒主要通過干預(yù)凋亡信號(hào)通路(apoptosis)、TNF信號(hào)通路 (TNF signaling pathway) 、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號(hào)通路 (PI3K-Akt signaling pathway) 等多個(gè)信號(hào)通路發(fā)揮治療作用。而TNF信號(hào)通路和PI3K-AKT信號(hào)通路是凋亡通路的重要組成部分，NF-κB信號(hào)通路是TNF信號(hào)通路的重要組成部分。再次說明了該復(fù)方治療再灌注心律失常的作用機(jī)制。凋亡信號(hào)通路圖見圖4(紅色的基因或蛋白是參連復(fù)脈顆粒治療再灌注心律失常的作用靶點(diǎn))，再次印證了參連復(fù)脈顆粒作用于多種靶蛋白，啟動(dòng)并調(diào)控復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制心肌細(xì)胞凋亡，改善心肌再灌注病人預(yù)后，降低再灌注心律失常發(fā)生率。

圖3 KEGG通路富集分析

圖4 凋亡通路

3 討 論

中醫(yī)對再灌注心律失常無系統(tǒng)論述，現(xiàn)代醫(yī)家多將其歸屬“胸痹”“心悸”范疇[8]。再灌注治療相當(dāng)于中醫(yī)“破血逐瘀”法，此過程耗氣傷血；氣虛則進(jìn)一步加重血瘀，故氣虛血瘀貫穿病人治療前后，而出現(xiàn)再灌注心律失常。相關(guān)研究也表明，氣虛血瘀為再灌注心律失常的核心病機(jī)[9]。針對VT與VF等快速性心律失常臨床以陰虛痰熱與痰熱擾心證為多見[10]，故再灌注損傷所導(dǎo)致的再灌注心律失常，常在氣虛血瘀基礎(chǔ)上，合并陰虛痰熱或痰熱擾心證。常用的中成藥參松養(yǎng)心膠囊與穩(wěn)心顆粒對于快速性心律失常證屬氣陰兩虛、瘀血阻絡(luò)者具有良好療效，而對于氣虛血瘀合并痰熱擾心證的快速性心律失常尚缺乏療效可靠的上市中成藥。針對證屬氣虛血瘀兼痰熱擾心型心悸的治療，林謙教授依據(jù)氣血理論并結(jié)合自身臨證經(jīng)驗(yàn)擬定了參連復(fù)脈顆粒，補(bǔ)充了當(dāng)前臨床對心律失常氣虛血瘀兼見痰熱擾心證的治療空白。

本研究采用冠狀動(dòng)脈左前降支線栓結(jié)扎法制作大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，發(fā)現(xiàn)參連復(fù)脈顆粒能明顯減少再灌注心律失常的發(fā)生。進(jìn)一步通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法分析了其藥效機(jī)制，KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，參連復(fù)脈顆粒參與調(diào)控的通路主要有凋亡、PI3K-AKT和TNF等信號(hào)通路。再灌注心律失常是心肌缺血再灌注損傷的主要表現(xiàn)形式，也是致死性心肌再灌注損傷的潛在標(biāo)志[11]。而心肌細(xì)胞凋亡是再灌注損傷發(fā)生機(jī)制的一個(gè)重要早期病理生理表現(xiàn)，也是再灌注損傷發(fā)生的上游機(jī)制之一。通過抑制心肌細(xì)胞凋亡等上游機(jī)制從而預(yù)防心肌再灌注損傷和再灌注心律失常的發(fā)生是近年心肌缺血再灌注研究的熱點(diǎn)[12-14]。凋亡通路中的促凋亡蛋白Bax是凋亡蛋白Bcl-2基因家族的成員，與Bcl-2形成異源二聚體，發(fā)揮促凋亡因子的作用，Caspase-3在心肌細(xì)胞凋亡過程中，是最關(guān)鍵的蛋白酶之一，也是凋亡參與執(zhí)行者[15]。研究發(fā)現(xiàn)，心肌再灌注損傷時(shí)，Bax/Bcl-2和Caspase-3的表達(dá)均明顯升高，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-x和Bcl-2對心肌有保護(hù)作用[15-16]。PI3K-AKT信號(hào)通路是凋亡通路中的一條重要通路，通過促進(jìn)Bcl-2、磷酸化PI3K(p-PI3K)和磷酸化AKT(p-AKT)表達(dá)，抑制Caspase-3和Bax表達(dá)被激活，從而減少心肌細(xì)胞凋亡、炎性因子的產(chǎn)生和縮小心肌梗死面積，進(jìn)而緩解心肌再灌注損傷[17]。通過激活PI3K/AKT通路靶向抑制下丘腦室旁核交感神經(jīng)活動(dòng)可能是治療再灌注心律失常的一種潛在方法[18]。TNF通路是凋亡通路的另一條重要通路，NF-κB信號(hào)通路存在TNF通路中，是TNF與TNF-R1的相互作用激活的一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一。在缺血再灌注損傷時(shí)，該通路被迅速激活，進(jìn)一步激活下游TNF-α、IL-6等炎性因子，從而促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，心肌梗死面積增大、心功能受損以及室性心律失常的易感性，抑制該通路可保護(hù)再灌注損傷，降低再灌注心律失常的易感性[19]。

經(jīng)過篩選，發(fā)現(xiàn)參連復(fù)脈顆粒作用于再灌注心律失常的主要成分為槲皮素、山奈酚、木犀草素和丹參酮ⅡA等。其中槲皮素預(yù)處理一方面能降低TNF-α、C反應(yīng)蛋白(CRP)和白介素-1β(IL-1β)等細(xì)胞因子，從而抑制炎癥級聯(lián)反應(yīng)。另一方面，能降低Bax水平和提高Bcl-2水平，抑制細(xì)胞凋亡；從而提高AKT的磷酸化水平，激活PI3K/AKT通路參與抗凋亡等途徑對心肌缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護(hù)效用[20]。木犀草素可激活PI3K/AKT通路，增加Bcl-2 相關(guān)死亡促進(jìn)因子(BAD)磷酸化，降低Bax與Bcl-2比值，降低心肌細(xì)胞凋亡率[21]。山奈酚可降低IL-6、TNF-α和NF-κB水平。激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)，抑制活性c-JNK和p38蛋白，降低促凋亡蛋白(Caspase-3和Bax)水平[22]。丹參酮ⅡA能夠激活PI3K/Akt/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路進(jìn)而緩解大鼠心肌缺血再灌注損傷[23]。課題組前期通過高效液相色譜法同時(shí)測定該方中君藥丹參中丹酚酸B、丹參酮ⅡA和臣藥白芍、佐藥赤芍中的有效成分芍藥苷3種活性成分的含量，作為該方的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提取浸膏粉，再通過一定工藝制備成參連復(fù)脈顆粒[24]。進(jìn)一步印證了本方君藥丹參的主要成分丹參酮ⅡA是本方的主要成分之一。STRING篩選結(jié)果顯示，根據(jù)DC值排名前10的核心基因分別為AKT1、TNF、IL6、IL1β、MMP9、TP53、MAPK3、CASP3、JUN、PTGS2，基本包含以上成分調(diào)控的基因，進(jìn)一步印證了參連復(fù)脈顆?？赡苤饕ㄟ^槲皮素、山奈酚、木犀草素和丹參酮ⅡA等成分，作用于AKT1、TNF、IL6、IL1β、MMP9、TP53、MAPK3、CASP3、JUN、PTGS2等核心基因，從而調(diào)控凋亡信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路以及NF-κB等信號(hào)通路，抑制再灌注后心肌凋亡和炎癥反應(yīng)，從而對心肌再灌注損傷產(chǎn)生保護(hù)作用，降低再灌注心律失常的發(fā)生率。

綜上所述，參連復(fù)脈顆?？赏ㄟ^多途徑、多靶點(diǎn)預(yù)防再灌注心律失常，其中一些靶點(diǎn)前期研究已進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)，如參連復(fù)脈顆?？筛纳芓NF-α、IL-6介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而對心房顫動(dòng)易感性起到抑制作用[25]。本實(shí)驗(yàn)基于參連復(fù)脈顆粒在體的藥理作用，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)全面分析了其預(yù)防再灌注心律失常的機(jī)制，為后續(xù)探究參連復(fù)脈顆粒的作用機(jī)制提供思路和方向。但參連復(fù)脈顆粒是否通過上述通路發(fā)揮作用以及主要作用靶點(diǎn)之間、主要通路間和主要靶點(diǎn)與通路間相互作用情況仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，另外由于參連復(fù)脈顆粒藥味較多，本研究雖然使用的是目前常用的檢索工具，但在預(yù)測靶點(diǎn)上仍存在一定的局限性，故其確切機(jī)制需進(jìn)一步探討。