沈亞倫, 王欣， 陳思博， 劉迦南， 王猛， 李云鵬

(黑龍江大學(xué) 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150080)

植物真菌病害約占植物病害的70%～80%，嚴(yán)重影響了農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量，化學(xué)藥劑雖然防治效果好，但會(huì)對(duì)人、畜和環(huán)境有所危害[1-3].因此，研發(fā)高效、低毒、對(duì)人類與環(huán)境無(wú)害的農(nóng)藥是發(fā)展的必然趨勢(shì).植物源殺菌劑可在環(huán)境中迅速分解，對(duì)環(huán)境友好，是符合農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展需求的新型農(nóng)藥.我國(guó)藥用植物資源豐富,藥用植物中的多種次生代謝產(chǎn)物具有良好的抗菌活性,為植物源殺菌劑的開發(fā)提供了龐大的資源庫(kù),如小檗堿，可從黃連、黃柏、三棵針和唐松草等植物中提取，也可人工合成，具有抑菌、殺蟲、除草及其他農(nóng)用活性[4-5].

中藥材川芎是傘形科植物川芎(Ligusticumchuanxiong)的干燥根莖，含有揮發(fā)油類、生物堿類和酚酸類等生物活性成分[6]，如藁本內(nèi)酯、川芎嗪、阿魏酸和川芎酚等[7-10].目前，已有一些關(guān)于川芎提取物對(duì)植物病原真菌抑菌效果的研究.如川芎提取物對(duì)擴(kuò)展青霉的孢子形成有一定的抑制作用[11]；川芎和苦參的等量混合物對(duì)草莓3種再植真菌病害的防治有一定效果[12]；川芎提取液在離體和活體條件下對(duì)采后臍橙的主要致腐菌意大利青霉和指狀青霉均有抑制作用[13]；0.05 g/mL川芎提取物對(duì)棉花枯萎病菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率達(dá)80.4%；0.1 g/mL川芎提取物對(duì)棉花枯萎病菌孢子萌發(fā)的抑制率達(dá)99.1%[14]；8.25 mg/mL川芎乙醇提取物對(duì)獼猴桃青霉病致病菌-草酸青霉菌絲的生長(zhǎng)相對(duì)抑制率高達(dá)92.79%，并能顯著抑制已感染果實(shí)的病斑擴(kuò)大[15].

白菜黑斑病是由蕓薹鏈格孢(Alternariabrassicae)引起的白菜葉部常見病害之一，全國(guó)各地分布廣泛，病害除造成減產(chǎn)外，還會(huì)導(dǎo)致莖葉變苦，品質(zhì)下降，種子帶菌[16-17].由茄鏈格孢菌(Alternariasolani)引起的番茄早疫病是發(fā)生在植株莖葉及果實(shí)上的一種嚴(yán)重病害，一般年份會(huì)導(dǎo)致番茄減產(chǎn)10%～30%，流行年份番茄產(chǎn)量損失高達(dá)30%～40%，甚至絕產(chǎn)[18].稻瘟病是由稻梨孢(Magnaportheoryzae)引起的世界性病害，可引起水稻大幅度減產(chǎn)，每年都有發(fā)生，在病害盛行的時(shí)候，產(chǎn)量一般減少10%～20%，較嚴(yán)重的地區(qū)高達(dá)40%～50%，甚至顆粒無(wú)收[19].

為進(jìn)一步探究川芎提取物抑制植物病原真菌的效果及其抑菌物質(zhì)極性，并探討抑菌活性較好萃取物的防病效果，以白菜黑斑病菌、番茄早疫病菌和稻瘟病菌為供試病原菌，研究川芎乙醇粗提物不同溶劑萃取物的抑菌活性和防病效果，為利用川芎提取物研制植物源殺菌劑提供依據(jù)，也為植物病原真菌綠色防控技術(shù)的建立提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

中草藥川芎：購(gòu)于哈爾濱泰景中西大藥房，粉碎后過(guò)孔徑為0.45 mm的篩，置于通風(fēng)干燥處備用.

供試病原菌：白菜黑斑病菌、番茄早疫病菌和稻瘟病菌均由黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院作物逆境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存.

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g(煮熟取汁液)、葡萄糖20 g及瓊脂18 g以蒸餾水定容至1 000 mL，錐形瓶密封后于121 ℃下滅菌30 min，使用前100 mL培養(yǎng)基添加0.003 g硫酸鏈霉素，防止細(xì)菌污染.

試劑與儀器：所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.多功能粉碎機(jī)(CHY-6001型，金華市莫菲家用電器有限公司)；超聲波清洗機(jī)(SB5200DT，寧波新芝生物科技股份有限公司)； 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52A型，上海亞榮生化儀器廠)；冷卻水循環(huán)機(jī)(SHZ-D(Ⅲ)型，天津華鑫儀器廠)；冰箱(BCD-220E3C，合肥美菱股份有限公司)； 立式壓力蒸汽滅菌器(YXQ-LS-70A型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；超凈工作臺(tái)(JHT-SDC型，濟(jì)南康寶凈化設(shè)備有限責(zé)任公司)；電子天平(CP224S，德國(guó)Sartorius公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9240A，上海一恒科技有限公司)；恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9052型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；生物顯微鏡(CX22LED型，奧林巴斯(中國(guó))有限公司).

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 川芎提取物制備

稱取20 g川芎粉末，加入100 mL 80%乙醇溶液，置于超聲波振蕩器中30 ℃下振蕩提取60 min，減壓抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至浸膏后以20 mL蒸餾水溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇進(jìn)行萃取，分別得到石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物以及水相萃余物，將各萃取物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至浸膏后分別用50%乙醇溶液定容，得到濃度為1 g/mL的各萃取物母液，于4 ℃冰箱中冷藏，備用.

1.2.2 抑菌活性測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法進(jìn)行測(cè)定.在紫外消毒后的超凈工作臺(tái)內(nèi)，吸取1 mL各萃取物分別加入已滅菌的99 mL PDA培養(yǎng)基中，充分混勻后制備成含藥10 mg/mL的藥板，以50%乙醇為空白對(duì)照，藥板中央接種直徑為0.599 cm的菌餅，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)，72 h后采用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，為防止因個(gè)別處理出現(xiàn)污染而缺失數(shù)據(jù)，每個(gè)處理重復(fù)4次并編號(hào)，如果前3皿有污染的(限1皿，多于1皿則重做試驗(yàn))，則以第4皿代替進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以此確保每個(gè)處理均有3個(gè)數(shù)據(jù)，從而篩選出抑菌活性最好的萃取物用于后續(xù)試驗(yàn).

菌絲生長(zhǎng)抑制率(%)=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑)×100.

1.2.3 菌絲生長(zhǎng)毒力測(cè)定

用50%乙醇溶液作為稀釋溶液，配制質(zhì)量濃度為0.125、0.250、0.500、0.750 g/mL和1.000 g/mL的川芎石油醚萃取物各4 mL，分別加入96 mL的PDA培養(yǎng)基中，制成含藥5、10、20、30 mg/mL和40 mg/mL的藥板，以50%乙醇為空白對(duì)照，培養(yǎng)方法、測(cè)定方法及重復(fù)次數(shù)等同1.2.2，計(jì)算不同濃度各萃取物的菌絲生長(zhǎng)抑制率，求出毒力回歸方程和抑制中濃度(IC50)，篩選出被抑制程度最高的植物病原真菌用于后續(xù)試驗(yàn).

1.2.4 孢子萌發(fā)抑制率測(cè)定

將白菜黑斑病菌接種于PDA平板上，培養(yǎng)至產(chǎn)生孢子后用鑷子刮取病菌孢子，使用0.5%吐溫80溶液將孢子洗下，雙層紗布過(guò)濾，稀釋，使孢子數(shù)量達(dá)到在顯微鏡(10×40倍)下每個(gè)視野有200個(gè)左右.取川芎石油醚萃取物母液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后用0.5%吐溫80溶液定容至濃度為1 g/mL，并分別稀釋成含藥10、20、40、60 mg/mL和80 mg/mL的川芎石油醚萃取物，分別取各濃度萃取物1 mL與1 mL孢子懸浮液充分混合，取20 μL混合液滴加至凹玻片的凹面中央，以0.5%吐溫80溶液與孢子懸浮液的混合液為對(duì)照，3次重復(fù).混合液于28 ℃下溫育6 h(預(yù)試驗(yàn)測(cè)得此條件下對(duì)照孢子萌發(fā)可達(dá)90%以上)，于400倍顯微鏡下進(jìn)行鏡檢，計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率.

孢子萌發(fā)率(%)=(視野中萌發(fā)孢子數(shù)/視野中孢子總數(shù))×100；

孢子萌發(fā)抑制率(%)=[(對(duì)照組萌發(fā)率-處理組萌發(fā)率)/對(duì)照組萌發(fā)率]×100 .

1.2.5 萃取物對(duì)白菜黑斑病的盆栽防治效果

將白菜種子播種在裝有營(yíng)養(yǎng)土的花盆(8 cm×8 cm)內(nèi)，出苗后每盆留 1～2株，置于陽(yáng)光溫室內(nèi)培養(yǎng)幼苗.待幼苗長(zhǎng)出兩片真葉后進(jìn)行防病試驗(yàn)：將等體積的孢子懸浮液(濃度為1×105CFU/mL)以針刺噴霧法分別接種在白菜苗上，覆蓋保鮮膜保濕誘導(dǎo)發(fā)病，接種后每天澆水1次，保持其環(huán)境濕度.發(fā)病后對(duì)白菜噴施川芎萃取物(萃取物母液配制方法同1.2.4，濃度為菌絲生長(zhǎng)IC50，即3.57 mg/mL)，以代森錳鋅(70%代森錳鋅400倍液)噴霧為陽(yáng)性對(duì)照，0.5%吐溫80溶液為陰性對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5株，于施藥后每4 d調(diào)查一次，共調(diào)查5次.逐一調(diào)查處理組與對(duì)照組所有植株，計(jì)算白菜發(fā)病均勻、病情穩(wěn)定時(shí)期的病情指數(shù)與防治效果.白菜黑斑病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：

0級(jí)，無(wú)病斑；1級(jí)，接種葉產(chǎn)生零星(<1/4葉面積)直徑2 mm以下退綠斑；3級(jí)，接種葉產(chǎn)生直徑2～3 mm退綠斑，病斑占葉面積1/4～1/2，無(wú)霉層；5級(jí)，接種葉產(chǎn)生較多直徑3 mm以上褐色斑，不連成片，占葉面積1/2～2/3,有少量霉層；7級(jí)，接種葉產(chǎn)生大而多的褐色病斑，連成片，占葉面積2/3以上，有明顯霉層并有輕度萎蔫；9級(jí)，接種葉產(chǎn)生大而多的褐黑色病斑，連成片，多數(shù)植株葉片萎蔫，稍久干枯，霉層濃密明顯[20].

病情指數(shù)(%)=[Σ(病級(jí)數(shù)×該病級(jí)發(fā)病株數(shù))/(最高發(fā)病級(jí)數(shù)×總調(diào)查數(shù))] ×100.

防治效果(%)=(對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對(duì)照病情指數(shù)×100.

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)基本處理；采用DPS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和Duncan多重比較、毒力回歸方程和IC50計(jì)算.

2 結(jié)果與分析

2.1 各川芎萃取物抑菌活性的初步篩選

從表1可以看出，川芎石油醚萃取物對(duì)3種植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率均最高，乙酸乙酯萃取物也有一定抑菌效果，而正丁醇萃取物和萃余物幾乎沒有抑菌活性.濃度為10 mg/mL的川芎石油醚萃取物對(duì)3種植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率均在60%以上，因此選擇川芎石油醚萃取物進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn).

表1 10 mg/mL各川芎萃取物對(duì)3種植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率

2.2 川芎石油醚萃取物對(duì)3種植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的室內(nèi)毒力分析

由表2和表3可以看出，川芎石油醚萃取物對(duì)3種植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性均隨著供試濃度的增高而增強(qiáng)，總體上川芎石油醚萃取物對(duì)白菜黑斑病菌的抑制效果最好，在質(zhì)量濃度為40 mg/mL時(shí)，其對(duì)白菜黑斑病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率達(dá)98.50%，IC50為3.57 mg/mL.

表2 不同濃度川芎石油醚萃取物對(duì)3種病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率

表3 川芎石油醚萃取物對(duì)3種病菌菌絲的毒力分析

2.3 川芎石油醚萃取物對(duì)白菜黑斑病菌孢子萌發(fā)的室內(nèi)毒力分析

由表4和圖1可以看出，川芎石油醚萃取物對(duì)白菜黑斑病菌孢子萌發(fā)有較強(qiáng)的抑制作用，且隨著萃取物濃度升高，抑制作用增強(qiáng).川芎石油醚萃取物濃度為10 mg/mL及以上時(shí)，對(duì)孢子萌發(fā)的抑制率均高于50%；依據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)得到毒力回歸方程為y=2.542 3+2.431 3x，相關(guān)系數(shù)(r)為0.951 0，IC50為10.25 mg/mL.

表4 不同濃度川芎石油醚萃取物對(duì)白菜黑斑病菌孢子萌發(fā)的抑制作用

2.4 川芎石油醚萃取物對(duì)白菜黑斑病的盆栽防治效果

由于第1次和第2次調(diào)查時(shí)白菜苗的發(fā)病情況不明顯，而第4次和第5次部分白菜苗因生理原因枯死，無(wú)法判斷其發(fā)病情況，而第3次調(diào)查時(shí)上述兩個(gè)方面問(wèn)題影響較小，所得的數(shù)據(jù)比較具有代表性,因此最終選擇用接種后第3次調(diào)查所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析.從表5可以看出，噴施3.57 mg/mL的川芎石油醚萃取物明顯抑制了白菜黑斑病的病斑擴(kuò)展蔓延，防治效果達(dá)51.7%，葉片缺綠情況較陽(yáng)性對(duì)照組輕.

表5 川芎石油醚萃取物對(duì)白菜黑斑病的防治效果

從左至右川芎石油醚萃取物濃度依次為0、5、10、20、30 mg/mL和40 mg/mL.

3 討論

探究了川芎80%乙醇提取物的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物及萃余物對(duì)白菜黑斑病菌、番茄早疫病菌和稻瘟病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用，結(jié)果與王欣等[21]的研究結(jié)果相似，發(fā)現(xiàn)川芎石油醚萃取物的抑菌活性最高，說(shuō)明川芎抑制植物病原真菌的抑菌物質(zhì)極性較小，主要存在于石油醚萃取物中.進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，川芎石油醚萃取物對(duì)白菜黑斑病菌、番茄早疫病菌和稻瘟病菌菌絲生長(zhǎng)的IC50分別為3.57、4.65 mg/mL和4.81 mg/mL；其對(duì)白菜黑斑病菌孢子萌發(fā)也有一定抑制效果，IC50為10.25 mg/mL，這進(jìn)一步證實(shí)了川芎石油醚萃取物的抑菌潛力.代森錳鋅是一種廣譜、低毒的保護(hù)性殺菌劑，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上常用于白菜黑斑病的防治[16]，因此在盆栽防病試驗(yàn)中，選擇代森錳鋅作為陽(yáng)性對(duì)照.試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3.57 mg/mL川芎石油醚萃取物對(duì)白菜黑斑病的防治效果達(dá)51.7%，高于代森錳鋅，可見川芎石油醚萃取物具有進(jìn)一步開發(fā)為防治白菜黑斑病等植物真菌病害的新型植物源農(nóng)藥的潛力.今后，可對(duì)川芎石油醚萃取物的抑菌成分和抑菌機(jī)理進(jìn)行研究，并進(jìn)行田間防病試驗(yàn)，進(jìn)一步探討其防病效果和機(jī)理，為植物真菌病害的綠色防控提供依據(jù).

4 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)液液萃取法得到了川芎80%乙醇提取物的不同極性溶劑萃取物，探究其對(duì)植物病原真菌的抑菌和防病效果，發(fā)現(xiàn)川芎石油醚萃取物的抑菌效果最好，對(duì)白菜黑斑病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)均有較強(qiáng)的抑制作用，盆栽試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了其對(duì)白菜黑斑病具有防病潛力.