吳 丹，羅潤(rùn)波，黃家旗，蔡重振，卓瑪次仁，王萌浩，袁國(guó)意，張夢(mèng)晨，李 彬，宋仁德，索朗斯珠*

(1.西藏農(nóng)牧學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)院，西藏 林芝 860000；2.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)院 獸醫(yī)研究所，江蘇 南京 210014；3.國(guó)家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系 玉樹(shù)綜合試驗(yàn)站，青海 玉樹(shù) 815000)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens，C.perfringens，Cp)舊名魏氏梭菌(C.welchii)，屬于梭菌屬，革蘭陽(yáng)性、產(chǎn)芽胞的大桿菌，常單個(gè)或成雙存在，常見(jiàn)于土壤、污水、沉積質(zhì)、腐殖質(zhì)、食物、糞便、人和其他脊椎動(dòng)物腸道中[1]。產(chǎn)氣莢膜梭菌所產(chǎn)生的毒素是其致病的主要原因，通常可引起人和動(dòng)物氣性壞疽(gas gangrene)、食物中毒、羔羊痢疾(lamb dysentery)、綿羊猝疽(struck)、牛腸毒血癥(enterotoxemia in cattle)和壞死性腸炎(necrotizing enteritis)等疾病[2]。牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌能引起牦牛猝死綜合征[3]，病畜通常臨床表現(xiàn)出腹部鼓氣脹大，心臟、肝臟、脾臟、腎臟等實(shí)質(zhì)器官出血性病變，急性出血性腸炎[4]，以及突然倒地死亡等癥狀，發(fā)病急，病程短，嚴(yán)重影響著牦牛養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展[5]。本試驗(yàn)以1株牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌為研究對(duì)象，通過(guò)生化試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)、MIC測(cè)定以及全基因組測(cè)序等方法，對(duì)該菌進(jìn)行基因組生物信息學(xué)分析、部分生物學(xué)特性研究以及探究其耐藥特性，為進(jìn)一步了解牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌基因功能、耐藥特性提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源在2020年夏末秋初，青海玉樹(shù)地區(qū)多地牦牛出現(xiàn)腹脹、腹瀉等癥狀，對(duì)死亡牦牛剖檢發(fā)現(xiàn)胃、腸道出血。在青霉素、鏈霉素、慶大霉素、復(fù)方新諾明等藥物的治療下未取得好的治療效果，西藏農(nóng)牧學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室采集新鮮腹瀉糞樣，并從中分離得到牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌Qinghai-1菌株。

1.2 主要試劑及儀器DNA聚合酶、dNTPs、DNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；無(wú)菌脫纖維綿羊血購(gòu)自北京Solarbio科技有限公司；厭氧產(chǎn)氣袋購(gòu)自日本Mitsubishi Chemical公司；生化鑒定管購(gòu)自杭州微生物有限公司；MIC試紙購(gòu)自意大利Liofilchem公司；胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂培養(yǎng)基(TSC)、羊血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(MACC)、液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(FTG)、梭菌增菌培養(yǎng)基(RCM)、含鐵牛乳培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基(LB)、微生物藥敏試驗(yàn)專用培養(yǎng)基(MH培養(yǎng)基)購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海天能科技有限公司；PCR儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.3 菌株復(fù)蘇將凍存的Qinghai-1菌株緩慢梯度升至室溫(-80℃→-20℃→4℃→室溫)，依次劃線接種于羊血瓊脂培養(yǎng)基、TSC培養(yǎng)基、MACC培養(yǎng)基，41℃厭氧培養(yǎng)18～24 h。挑單菌落接種于FTG、含鐵牛乳培養(yǎng)基，石蠟油液封，41℃培養(yǎng)12 h。革蘭染色后，利用顯微鏡對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鏡檢。

1.4 全基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增挑單菌落接種于RCM培養(yǎng)基中，石蠟油液封，41℃培養(yǎng)12 h，利用細(xì)菌基因組試劑盒提取Qinghai-1菌株全基因組DNA。合成細(xì)菌16S rRNA通用引物[6]、產(chǎn)氣莢膜梭菌常見(jiàn)毒素分型基因引物[7]分別對(duì)菌株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增采用50 μL體系，引物信息見(jiàn)表1。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，并通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

表1 PCR引物信息

1.5 生化特性分析參考伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)[8]，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液分別接種于硫化氫、吲哚、乳糖、鼠李糖、靛基質(zhì)、木糖、纖維二糖、棉子糖、葡萄糖、麥芽糖、水楊苷、甘露醇、山梨醇、尿素、蔗糖、酪蛋白、脂酶、賴氨酸、鳥(niǎo)氨酸、硝酸鹽、明膠、阿拉伯糖、卵磷脂酶、甘露糖等24種細(xì)菌生化鑒定管對(duì)Qinghai-1菌株進(jìn)行生化特性研究。

1.6 藥敏試驗(yàn)與最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定調(diào)整菌液濃度為0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞岫?1×108～2×108CFU/mL)，均勻涂布于MH培養(yǎng)基上，采用E-test法[9]和Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法測(cè)定Qinghai-1菌株對(duì)10種常用抗菌藥物(頭孢噻肟、氨芐西林、慶大霉素、復(fù)方新諾明、青霉素、四環(huán)素、多黏菌素B、紅霉素、鏈霉素、桿菌肽)的MIC及抗菌藥物的敏感性。讀取MIC紙條環(huán)尖所對(duì)應(yīng)紙條上的數(shù)值并測(cè)量紙片擴(kuò)散法中抑菌圈大小，根據(jù)CLSI推薦的《抗菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行判定[10]。

1.7 細(xì)菌全基因組測(cè)序分析將1.4中提取的細(xì)菌全基因組DNA用Qubit Fluorometer和NanoDrop分別檢測(cè)DNA的濃度和純度，將質(zhì)檢合格的樣品送至擎科生物科技有限公司，并基于Nanopore三代測(cè)序技術(shù)平臺(tái)和illumina二代測(cè)序技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，再采用Pilon(1.23)[11]軟件進(jìn)行糾錯(cuò)以及Unicycler(0.4.9)[12]軟件進(jìn)行組裝。組裝完成后利用Prokka(1.13)[13]軟件對(duì)組裝后的全基因組進(jìn)行編碼基因預(yù)測(cè)，與8大數(shù)據(jù)庫(kù)(UniProt[14]、KEGG[15]及 KEGG Pathway、GO[16]、Pfam[17]、COG[18]、TIGERfams[19]、RefSeq、NR)的基因功能做BLAST+(2.9.0+)[20]比對(duì)并注釋。隨后通過(guò)Diamond blastp[21]基于VFDB(毒力因子數(shù)據(jù)庫(kù))對(duì)目的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行注釋，用于收集Qinghai-1菌株毒力因子的信息；通過(guò)CARD[22](耐藥基因數(shù)據(jù)庫(kù))網(wǎng)站(http://arpcard.mcmaster.ca)中選擇RGI(Resistance Gene Identifier)模式分析Qinghai-1菌株抗性基因及耐藥種類(lèi)。

1.8 上傳數(shù)據(jù)并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)將牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌Qinghai-1菌株全基因組核苷酸序列上傳至NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得GenBank 登錄號(hào)，并通過(guò)與其他已公開(kāi)序列比對(duì)，下載相關(guān)序列，利用MEGA 7.0軟件采用鄰接法(Neighbor Joining)構(gòu)建Qinghai-1菌株遺傳進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌生長(zhǎng)特征將接種好的培養(yǎng)基置于41℃恒溫培養(yǎng)箱中，厭氧培養(yǎng)18～24 h，觀察并記錄細(xì)菌及菌落在不同培養(yǎng)基的生長(zhǎng)狀況(表2)，細(xì)菌在不同培養(yǎng)基生長(zhǎng)形態(tài)見(jiàn)圖1A～E。革蘭染色鏡檢結(jié)果顯示：菌體大小為0.6～2.4 μm×1.3～19.0 μm，其兩端鈍圓，呈單個(gè)或雙個(gè)排列，有莢膜、無(wú)鞭毛的革蘭陽(yáng)性粗大桿菌(圖1F)。

表2 不同培養(yǎng)基Qinghai-1菌株生長(zhǎng)特征

A.羊血瓊脂培養(yǎng)基；B.TSC培養(yǎng)基；C.MACC培養(yǎng)基；D.FTG培養(yǎng)基(左.對(duì)照組；右.試驗(yàn)組)；E.含鐵牛乳培養(yǎng)基(左.對(duì)照組；右.試驗(yàn)組)；F.革蘭染色(1 000×)

2.2 細(xì)菌 16S rRNA和四重分型PCR擴(kuò)增結(jié)果PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，16S rRNA PCR產(chǎn)物凝膠電泳在約1 400 bp處出現(xiàn)條帶，四重分型PCR產(chǎn)物凝膠電泳僅在325 bp處出現(xiàn)條帶(圖2)，與預(yù)期條帶大小相符合。經(jīng)測(cè)序比對(duì)和毒素基因分型得到牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌Qinghai-1菌株為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌。

M.DL2000 DNA Marker；1.陰性對(duì)照；2.牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌Qinghai-1菌株

2.3 生化反應(yīng)結(jié)果生化試驗(yàn)結(jié)果顯示：Qinghai-1菌株在硫化氫、乳糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、賴氨酸、鳥(niǎo)氨酸、卵磷脂酶、明膠、硝酸鹽、甘露糖、酪蛋白共12種生化鑒定管中呈陽(yáng)性反應(yīng)，有產(chǎn)酸產(chǎn)氣或生長(zhǎng)動(dòng)力等試驗(yàn)現(xiàn)象出現(xiàn)。在其余12種生化鑒定管中呈陰性反應(yīng)，生化管中無(wú)生化反應(yīng)現(xiàn)象產(chǎn)生。

2.4 藥敏試驗(yàn)及MIC測(cè)定結(jié)果結(jié)果如表3所示，藥敏試驗(yàn)與MIC測(cè)定結(jié)果相同。

表3 常用藥物MIC測(cè)定結(jié)果

2.5 Qinghai-1菌株遺傳進(jìn)化樹(shù)通過(guò)利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建Qinghai-1菌株遺傳進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示，Qinghai-1菌株與中國(guó)云南山羊源(MK156683)產(chǎn)氣莢膜梭菌處于同一分支，與西藏安多縣牦牛源(MN960263、MN960262)產(chǎn)氣莢膜梭菌和西藏班戈縣牦牛源(MN960261)產(chǎn)氣莢膜梭菌卻有著相對(duì)較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系(圖3)。

圖3 Qinghai-1菌株16S rRNA遺傳進(jìn)化樹(shù)

2.6 Qinghai-1菌株基因組序列分析基因組組裝結(jié)果顯示，基因組長(zhǎng)度3 042 374 bp，GC含量為28.58%，共含2 906個(gè)基因，2 721個(gè)CDS區(qū)，94段tRNA，10段rRNA，60段miscRNA，1段tmRNA，968段重復(fù)序列和1個(gè)基因島，不含CRISPR序列(表4)。利用預(yù)測(cè)得到的基因組信息，繪制基因組圈圖(圖4)。

表4 牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌Qinghai-1菌株基因組基本信息

注：由外到內(nèi)依次：第1圈.基因組序列信息；第2圈.基因組序列的GC含量曲線；第3圈.基因組序列的GC skew曲線；第4圈.二代測(cè)序深度及覆蓋度信息；第5圈.三代測(cè)序深度及覆蓋度信息；第6圈.展示了參考基因組中的基因編碼區(qū)(CDS)以及非編碼RNA區(qū)(rRNA、tRNA)，以內(nèi)外兩層表示，外層代表正鏈，內(nèi)層代表負(fù)鏈

2.7 Qinghai-1菌株基因組功能注釋與8大數(shù)據(jù)庫(kù)的基因功能比對(duì)注釋結(jié)果顯示，UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)1 721 個(gè)基因，KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)849個(gè)基因，KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫(kù)815個(gè)基因，GO數(shù)據(jù)庫(kù)1 643個(gè)基因，Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)2 406個(gè)基因，COG數(shù)據(jù)庫(kù)1 196個(gè)基因，TIGERfams數(shù)據(jù)庫(kù)1 669個(gè)基因，RefSeq數(shù)據(jù)庫(kù)2 679個(gè)基因，NR數(shù)據(jù)庫(kù)2 261個(gè)基因(圖5)。

注：左側(cè)為通用數(shù)據(jù)庫(kù)基因注釋統(tǒng)計(jì)；右側(cè)為共有和特有統(tǒng)計(jì)，上方為數(shù)目統(tǒng)計(jì)，下方為共有或特有數(shù)據(jù)庫(kù)的標(biāo)注

GO(gene ontology，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能分類(lèi)體系)數(shù)據(jù)庫(kù)將Qinghai-1菌株基因的功能分為細(xì)胞組分(cellular component)、分子功能(molecular function)、生物學(xué)過(guò)程(biological process)3個(gè)方面(圖6)，生物過(guò)程的各基因功能數(shù)量相對(duì)平均，富集程度最高的為翻譯過(guò)程(translation)共有63個(gè)基因；細(xì)胞組分的部分基因功能數(shù)量差異明顯，其中富集程度前3的為質(zhì)膜(plasma membrane)共384個(gè)基因，細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)共376個(gè)基因，質(zhì)膜組成部分(integral component of plasma membrane)共316個(gè)基因；分子功能中的ATP結(jié)合功能(ATP binding)基因富集程度最高，共320個(gè)基因。

注：橫坐標(biāo)為 GO 各分類(lèi)內(nèi)容，縱坐標(biāo)為基因數(shù)目

KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)數(shù)據(jù)庫(kù)從其對(duì)基因產(chǎn)物的代謝途徑和功能的不同通路[23]將Qinghai-1菌株基因組基因分為5個(gè)大類(lèi)和28個(gè)小類(lèi)(圖7)，其中富集最高的基因代謝途徑為代謝類(lèi)(metabolism)中的碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)共有267個(gè)基因。

COG(cluster of orthologous groups of proteins，基因產(chǎn)物直系同源分類(lèi))數(shù)據(jù)庫(kù)以細(xì)菌、藻類(lèi)、真核生物具有完整基因組的編碼蛋白、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系為構(gòu)建基礎(chǔ)[24]，將Qinghai-1菌株基因組基因分為20類(lèi)(圖8)，其中基因數(shù)量富集程度前3位的功能途徑是翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生(translation,ribosomal structure and biogenesis)，含145個(gè)基因；碳水化合物運(yùn)輸和代謝(carbohydrate transport and metabolism)，含135個(gè)基因；氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝(amino acid transport and metabolism)，含108個(gè)基因。

注：橫坐標(biāo)為 Pathway 分類(lèi)下注釋的基因數(shù)目；縱坐標(biāo)為 Pathway 分類(lèi)，不同顏色代表所屬的不同的大分類(lèi)

注：橫坐標(biāo)為COG各分類(lèi)內(nèi)容，縱坐標(biāo)為基因數(shù)目

2.8 細(xì)菌毒力因子注釋VFDB數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)Qinghai-1菌株序列注釋結(jié)果顯示：注釋到237個(gè)與毒力因子有關(guān)的基因，主要包括α毒素基因(plc)、θ毒素基因(pfoA)、κ-毒素基因(colA)、外源-α-唾液酸酶基因(nanl)、α-梭菌蛋白酶基因(cloSI)、唾液酸酶基因(nanH)等毒力相關(guān)因子。

2.9 耐藥基因注釋CARD數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)Qinghai-1菌株序列注釋結(jié)果顯示(圖9)：牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌Qinghai-1菌株僅含有1個(gè)耐藥性相關(guān)基因，即ClostridiumperfringensmprF基因，其主要通過(guò)抗生素靶標(biāo)改變的方式來(lái)耐受肽類(lèi)抗生素，該類(lèi)抗生素常見(jiàn)的藥物有桿菌肽、多黏菌素B、黏菌素、萬(wàn)古霉素、太古霉素、沙拉霉素等。

注：從內(nèi)到外依次為分析種類(lèi)、RGI運(yùn)算方式、耐藥種類(lèi)、耐藥基因

2.10 基因組序列登錄號(hào)牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌Qinghai-1菌株16S rRAN的基因序列登錄號(hào)為MW980090，全基因組序列登錄號(hào)為CP092481。

3 討論

本研究選用由本實(shí)驗(yàn)室從青藏高原玉樹(shù)藏族自治州牦牛腹瀉糞樣中分離到的1株產(chǎn)氣莢膜梭菌為研究對(duì)象，通過(guò)PCR鑒定其為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌。對(duì)其進(jìn)行生化試驗(yàn)探究，了解到了牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、乳糖和蔗糖并產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不發(fā)酵甘露醇或水楊苷；能液化明膠，不能消化已凝固的蛋白質(zhì)等常規(guī)生化現(xiàn)象[2,25]，擴(kuò)寬了牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌生化譜，可為進(jìn)一步研究牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌代謝產(chǎn)物、代謝方式和代謝條件提供依據(jù)。通過(guò)E-test法和Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法相互對(duì)照測(cè)定Qinghai-1菌株對(duì)10種常用抗菌藥物的敏感性。結(jié)果顯示，牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌Qinghai-1菌株對(duì)頭孢噻肟、氨芐西林、青霉素、四環(huán)素敏感，對(duì)慶大霉素、復(fù)方新諾明、多黏菌素B、鏈霉素、桿菌肽耐藥。通過(guò)全基因測(cè)序與CARD數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)注釋可知，牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌Qinghai-1菌株含有mprF抗性基因，能通過(guò)對(duì)抗生素靶標(biāo)改變對(duì)肽類(lèi)抗生素產(chǎn)生耐藥。根據(jù)本次藥敏試驗(yàn)結(jié)果和耐藥基因注釋結(jié)果推薦在今后的養(yǎng)殖生產(chǎn)中交叉使用β-內(nèi)酰胺類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)藥物對(duì)牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌病進(jìn)行預(yù)防和治療，避免繼續(xù)使用氨基糖苷類(lèi)、磺胺類(lèi)、肽類(lèi)藥物用于治療產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的疫病。

Qinghai-1菌株基因組組裝結(jié)果顯示，其基因組長(zhǎng)度3 042 374 bp，GC含量為28.58%，共含2 906個(gè)基因，2 721個(gè)CDS區(qū)，94段tRNA，10段rRNA，60段miscRNA，1段tmRNA，968段重復(fù)序列和1個(gè)基因島，不含CRISPR序列。GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果顯示，生物過(guò)程富集程度最高的為翻譯過(guò)程；細(xì)胞組分富集程最高的為質(zhì)膜；分子功能富集程度最高的為ATP結(jié)合功能，通過(guò)細(xì)胞組分、分子功能、生物學(xué)過(guò)程3個(gè)方面來(lái)全面描述了Qinghai-1菌株基因和基因產(chǎn)物的屬性。KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果顯示，富集程度最高的基因代謝途徑為碳水化合物代謝，通過(guò)5個(gè)大類(lèi)和28個(gè)小類(lèi)共同描述了Qinghai-1菌株基因產(chǎn)物在細(xì)胞中的代謝途徑以及這些基因產(chǎn)物的功能，可以進(jìn)一步研究基因在生物學(xué)上的復(fù)雜行為[26]。COG數(shù)據(jù)庫(kù)從宏觀認(rèn)識(shí)Qinghai-1菌株的基因功能分布特征上，將Qinghai-1菌株注釋到COG數(shù)據(jù)庫(kù)的1 196個(gè)基因分為20類(lèi)，其中基因數(shù)量富集程度最高的功能途徑是翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生。全基因組測(cè)序的結(jié)果對(duì)牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌遺傳變異性、基因功能、毒力機(jī)制和耐藥機(jī)制等方向的研究提供理論依據(jù)，為分析高原牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌分子生物學(xué)特性提供支撐。

VFDB數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)收集到的Qinghai-1菌株毒力因子注釋結(jié)果顯示，注釋到237個(gè)與毒力因子有關(guān)的基因，主要包括α毒素基因(plc)、θ毒素基因(pfoA)、κ-毒素基因(colA)、外源-α-唾液酸酶基因(nanl)、α-梭菌蛋白酶基因(cloSI)、唾液酸酶基因(nanH)等毒力相關(guān)因子。該結(jié)果為研究Qinghai-1菌株的致病機(jī)制提供了依據(jù)。最后，本試驗(yàn)從生物學(xué)特性和全基因組測(cè)序兩個(gè)方面完成了對(duì)Qinghai-1菌株的耐藥特性和基因組信息分析，并將其上傳至NCBI基因組數(shù)據(jù)庫(kù)獲得登錄號(hào)：CP092481，豐富了產(chǎn)氣莢膜梭菌基因庫(kù)宿主的類(lèi)型，為進(jìn)一步了解牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌耐藥基因和遺傳進(jìn)化信息提供了理論參考。