王隆柏，陳秋勇，曾憲煜，吳學(xué)敏，車勇良，陳如敬，周倫江*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所/福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350013；2.長(zhǎng)汀縣畜牧技術(shù)推廣站，福建 長(zhǎng)汀 366300)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起豬的急性腸道傳染病，以食欲下降、腹瀉、嘔吐和脫水為特征。2010年下半年以來，由于PEDV變異導(dǎo)致該病再次席卷全球，給養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。PEDV屬于尼多病毒目、冠狀病毒科冠狀病毒屬成員，為單股正鏈RNA病毒，編碼纖突蛋白(S蛋白)、小包膜蛋白(E蛋白)、膜糖蛋白(M蛋白)和核衣殼蛋白(N蛋白)等4種主要結(jié)構(gòu)蛋白[3]。PEDV S蛋白由S基因編碼，1 383個(gè)氨基酸構(gòu)成。S 蛋白可分為S1(第1～789位氨基酸)和 S2(第790～1 383 位氨基酸)2 個(gè)功能區(qū)[4]，其中 S1 區(qū)包含了病毒主要的中和表位和受體結(jié)合域，有3 個(gè)誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的表位和1個(gè)誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的區(qū)域 (第499～638位氨基酸)。S 蛋白具有識(shí)別靶細(xì)胞并且使病毒和細(xì)胞膜融合的作用[5]，且在介導(dǎo)病毒感染、侵入細(xì)胞以及毒株變異、抗原和毒力改變等方面均起關(guān)鍵作用[6-7]。N蛋白由 441個(gè)氨基酸組成，具有高度保守性，含 6～7個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)。N蛋白是病毒的主要免疫蛋白之一，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的抗體免疫和細(xì)胞免疫，豬在早期感染PEDV,就可以產(chǎn)生抗N蛋白的高水平抗體[8-9]，使其成為早期診斷的靶蛋白。

由于PEDV與豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬輪狀病毒(PoRV)及博卡病毒在流行病學(xué)、臨床癥狀和病理表現(xiàn)極其相似，因此本病僅依據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變化很難做出診斷,特別是與TGEV和德塔病毒不易區(qū)別,必須依靠實(shí)驗(yàn)室技術(shù)才能作出診斷。目前,已建立的PEDV診斷方法有病毒分離、免疫電鏡、免疫熒光、間接血凝試驗(yàn)、夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、RT-PCR、熒光定量RT-PCR方法等[10]，適用于對(duì)病毒的病原檢測(cè)。在抗體檢測(cè)方面雖然建立了中和試驗(yàn)、IgG-ELISA和IgA-ELISA抗體方法，但病毒中和試驗(yàn)操作繁雜并且耗時(shí)長(zhǎng)，采用全病毒包被建立的ELISA方法存在病毒培養(yǎng)困難且多容易造成病毒擴(kuò)散。IgG-ELISA抗體檢測(cè)方法主要用于檢測(cè)血清中的抗體，IgA-ELISA抗體檢測(cè)方法主要用于檢測(cè)乳汁中的抗體，且應(yīng)用截?cái)嗟腟蛋白或單個(gè)N蛋白建立的ELISA方法僅能檢測(cè)到單個(gè)蛋白產(chǎn)生的抗體，而采用變異PEDV毒株S-N融合蛋白作為包被抗原建立ELISA方法，在血清和乳汁中檢測(cè)S蛋白和N蛋白產(chǎn)生的PEDV的IgA抗體未見報(bào)道。

鑒于此，本研究通過截取變異PEDV S蛋白具有誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的區(qū)域(第499～638位氨基酸)與N蛋白融合，通過真核表達(dá)載體，獲得具有免疫原性的S-N融合雙基因蛋白。以S-N真核蛋白為包被抗原，通過ELISA反應(yīng)條件優(yōu)化，建立在血清和乳汁中檢測(cè)PEDV的S蛋白和N蛋白IgA抗體ELISA 方法，為該病的血清抗體調(diào)查和免疫疫苗效果評(píng)估奠定基礎(chǔ)，為防控PEDV提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料磷酸鹽包被緩沖液、BSA、山羊抗豬IgA-HRP(辣根過氧化物酶)、TMB顯色液、終止液、洗滌液均購自Abcam生物公司；TGEV、PoRV陽性血清均購自哈爾濱動(dòng)物生物制品國(guó)家工程研究中心有限公司；偽狂犬病病毒(PRV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)陽性血清均購自IDEXX公司；進(jìn)口商品化ELISA抗體檢測(cè)試劑盒購自BIONOTE 公司；PEDV的S-N雙基因融合蛋白、PEDV陽性血清、陰性血清均由本實(shí)驗(yàn)室制備與保存。

1.2 S-N融合蛋白的制備參照文獻(xiàn)[2]方法進(jìn)行。采用同源重組的原理，通過擴(kuò)增變異PEDV的S、N基因，連接到真核表達(dá)載體，構(gòu)建S-N雙基因融合質(zhì)粒，再將融合質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，表達(dá)出相應(yīng)的S-N雙基因融合蛋白。采用按EQKLISEEDL純化試劑盒說明進(jìn)行純化獲得蛋白，作為ELISA方法的包被抗原。

1.3 優(yōu)化包被蛋白質(zhì)量濃度將蛋白分別以1，2，4 mg/L 稀釋，每個(gè)稀釋度做8孔重復(fù)，100 μL/孔，4℃過夜；5% BSA封閉液封閉抗原蛋白，300 μL/孔，37℃孵育2 h;洗板,加入陽性血清與陰性血清分別1∶10稀釋，100 μL/孔，37℃孵育1 h;洗板,再加入1∶10 000稀釋羊抗豬HRP，100 μL /孔，37℃孵育30 min;洗板,加入TMB顯色液，100 μL/孔，避光37℃孵育10 min;加入終止液，50 μL/孔，搖勻；用酶標(biāo)儀讀取D450 nm值,P代表陽性血清的D450 nm值，N代表陰性血清的D450 nm值，選擇P/N值最大者為最佳包被抗原質(zhì)量濃度。

1.4 優(yōu)化包被蛋白時(shí)間選用2種包被時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，分別為4℃過夜和37℃孵育2 h。陰性血清和陽性血清分別以1∶10稀釋，進(jìn)行ELISA測(cè)定，最后比較450 nm波長(zhǎng)下陰性、陽性血清的P/N值，最大者為包被條件最適時(shí)間。

1.5 優(yōu)化最佳封閉液以最適抗原蛋白的包被質(zhì)量濃度和最佳包被時(shí)間包被酶標(biāo)板，洗板，分別用PBST、1% BSA、2% BSA、5% BSA進(jìn)行封閉，300 μL/孔，37℃孵育2 h，陰性血清和陽性血清分別以1∶10稀釋，進(jìn)行ELISA測(cè)定，最后比較450 nm 波長(zhǎng)下陰性、陽性血清的P/N值，最大者為最佳封閉液。

1.6 優(yōu)化酶標(biāo)抗體稀釋度以最適抗原蛋白包被和最適封閉條件封閉，陽性血清和陰性血清1∶10稀釋，37℃孵育1 h；洗板，加入抗豬IgA-HRP 1∶2 500，1∶5 000，1∶10 000，1∶20 000，1∶40 000，1∶80 000稀釋，100 μL/孔，37℃孵育30 min；洗板，進(jìn)行ELISA測(cè)定。最后比較450 nm波長(zhǎng)下陰性、陽性血清的P/N值，最大者為最佳稀釋度。

1.7 優(yōu)化血清稀釋度陽性血清和陰性血清1∶10，1∶20，1∶50，1∶100，1∶200，1∶400稀釋，37℃孵育1 h，洗板，進(jìn)行ELISA測(cè)定。最后比較450 nm波長(zhǎng)下陰性、陽性血清的P/N值，最大者為最佳稀釋度。

1.9 特異性試驗(yàn)利用已建立的ELISA方法檢測(cè)PoRV、TGEV、CSFV、PRRSV、PRV陽性血清，血清按照1∶50稀釋，并設(shè)立陽性和陰性對(duì)照，檢測(cè)方法的特異性。

1.10 敏感性試驗(yàn)選取陽性血清，在稀釋1∶200的基礎(chǔ)上分別進(jìn)行倍比稀釋，并設(shè)立陽性和陰性對(duì)照，檢測(cè)建立方法的敏感性。

1.11 重復(fù)性試驗(yàn)

1.11.1批內(nèi)重復(fù)性 在同一批制備的ELISA板中，隨機(jī)挑選8份血清，按照1∶50稀釋，每個(gè)血清各做3個(gè)孔，計(jì)算s和變異系數(shù)(CV)，分析批內(nèi)重復(fù)性。

1.11.2批間重復(fù)性 在隨機(jī)選擇3批制備的ELISA板中隨機(jī)挑選8個(gè)血清，按照1∶50稀釋，每個(gè)血清各做3個(gè)孔，計(jì)算s和CV，分析批間重復(fù)性。

1.12 臨床檢測(cè)利用已建立的ELISA檢測(cè)方法對(duì)從不同規(guī)模豬場(chǎng)采集的179份血清樣品和125份乳汁樣品進(jìn)行臨床檢測(cè)，并用對(duì)照商品化試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，最后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，比較兩者之間的符合率。

2 結(jié)果

2.1 包被抗原蛋白最適質(zhì)量濃度的確定結(jié)果顯示，當(dāng)抗原蛋白質(zhì)量濃度為2 mg/L時(shí)，P/N值為最佳(表1)。

表1 包被抗原蛋白質(zhì)量濃度優(yōu)化

2.2 包被最佳時(shí)間的確定結(jié)果如表2所示,抗原蛋白在4℃包被過夜，P/N值為最佳。

表2 抗原蛋白包被時(shí)間優(yōu)化

2.3 最佳封閉液的確定結(jié)果顯示,使用5% BSA (BOSTER)作為封閉液，P/N值為最佳(表3)。

表3 封閉液優(yōu)化

2.4 酶標(biāo)抗體稀釋度的優(yōu)化由表4可見，Anti-pig IgA酶標(biāo)二抗稀釋度為1∶20 000，P/N值最大。

表4 Anti-pig IgA酶標(biāo)抗體濃度優(yōu)化

2.5 血清稀釋度的優(yōu)化結(jié)果顯示，當(dāng)血清稀釋度為1∶50時(shí)，P/N值最大，效果最佳(表5)。

表5 血清稀釋度優(yōu)化

表6 陽性與陰性臨界值的確定

2.7 敏感性試驗(yàn)結(jié)果如表7所示，該檢測(cè)方法能檢測(cè)到1∶3 200倍稀釋的血清抗體，具有較好的敏感性。

表7 敏感性測(cè)定

2.8 特異性試驗(yàn)結(jié)果如表8所示，該檢測(cè)方法檢PRRSV、PRV、CSFV、TGEV、PoRV陽性血清均是陰性，無交叉反應(yīng)，僅檢測(cè)PEDV陽性血清為陽性。

表8 特異性測(cè)定

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果如表9所示，檢測(cè)方法在批內(nèi)重復(fù)性和批間重復(fù)性的CV均小于10%，說明建立的檢測(cè)方法具有很好的重復(fù)性。

表9 重復(fù)性測(cè)定

2.10 臨床檢測(cè)共檢測(cè)血清179份，利用進(jìn)口商品化檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)得到陽性樣品135份，陰性樣品44份；利用本研究建立的方法檢測(cè)出陽性樣品137份，陰性樣品42份，與進(jìn)口試劑盒的陽性符合率達(dá)到了97.8%，陰性符合率達(dá)到90.9%，總符合率為93.2%，見表10。共檢測(cè)乳汁125份，利用進(jìn)口商品化檢測(cè)試劑盒檢測(cè)得到陽性樣品101份，陰性樣品24份；利用本研究建立的方法檢測(cè)出陽性樣品104份，陰性樣品21份，與進(jìn)口試劑盒的陽性符合率達(dá)到100.0%，陰性符合率達(dá)到 87.5%，總符合率為 93.75%(表11)。表明建立的ELISA檢測(cè)方法適用于PEDV的臨床樣品檢測(cè)，對(duì)監(jiān)測(cè)PEDV疫苗免疫抗體或豬群的感染情況具有重要意義。

表10 建立的方法與ELISA試劑盒檢測(cè)血清比較

表11 建立的方法與ELISA試劑盒檢測(cè)乳汁比較

3 討論

PED是導(dǎo)致豬群腹瀉尤其是哺乳仔豬發(fā)病死亡的重要疫病，2010—2011年嚴(yán)重影響了我國(guó)的生豬養(yǎng)殖業(yè)，現(xiàn)在仍時(shí)有發(fā)生。該病一年四季都可發(fā)生，但以寒冷的冬、春季節(jié)發(fā)病更為嚴(yán)重。當(dāng)前，PED的防控主要在做好豬場(chǎng)生物安全的情況下，采用弱毒疫苗或滅活疫苗在母豬群產(chǎn)前免疫，由于出生仔豬免疫功能不完善，產(chǎn)生自身免疫抗體十分弱，仔豬只能通過從母豬的乳汁中獲得母源抗體，從而達(dá)到保護(hù)仔豬的效果。大量研究表明，仔豬通過母豬乳汁獲得母源的抗體主要為腸道黏膜分泌的IgA 抗體，IgA 抗體能抵御入侵的病原體，仔豬從而獲得被動(dòng)免疫保護(hù)。IgA 作為黏膜免疫系統(tǒng)的重要效應(yīng)因子，其主要特性是多鏈性、黏膜親和性以及對(duì)蛋白酶的抵抗性，這有助于抗體對(duì)病毒的親和作用，并具有阻抑黏附、免疫排除和中和病毒等多種生物功能[11-12]。可見，PED疫苗免疫后母豬乳汁中的 IgA 抗體水平是評(píng)價(jià)疫苗免疫原性的一項(xiàng)重要指標(biāo)，檢測(cè)血清中的IgG 抗體來評(píng)價(jià)疫苗保護(hù)的方法存在缺陷。鑒于血清特異PEDV IgA抗體水平與局部黏膜免疫水平呈正相關(guān)[13-14]，通過該方法檢測(cè)血清中的IgA抗體，能間接反映出乳汁中IgA抗體的情況。因此建立一種安全、穩(wěn)定的IgA 抗體 ELISA 檢測(cè)方法對(duì)PED的防治具有重要臨床實(shí)踐意義。

在PEDV ELISA抗體檢測(cè)方面，王麗珍等[15]通過純化的PEDV為包被抗原，建立了檢測(cè)PED IgG抗體間接ELISA檢測(cè)方法，與哈爾濱動(dòng)物生物制品國(guó)家工程研究中心有限公司提供的商品檢測(cè)試劑盒的符合率為81%。丁振江等[16]通過S 蛋白 S1 亞基的S1D區(qū) (636～798 aa)，原核表達(dá)出S1D區(qū)蛋白，并以該蛋白建立了檢測(cè)PED IgA 抗體間接 ELISA 檢測(cè)。該方法能檢測(cè)到240 倍稀釋的陽性乳汁，和韓國(guó)BIONOTE 公司生產(chǎn)的 IgA 抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行對(duì)比，符合率為93.82%，但該方法只能檢測(cè)到乳汁中IgA抗體。陳靜等[17]通過S蛋白的N端高變區(qū)(22～380 aa)，原核表達(dá)出了S蛋白，并以該蛋白建立了檢測(cè)PED IgG抗體間接 ELISA 檢測(cè)方法。鄭逢梅等[18]將PEDV N基因上2個(gè)大的抗原表位區(qū)(112～321 aa)克隆至原核表達(dá)載體pET-32α，表達(dá)出N蛋白，并建立了基于N基因主要抗原表位檢測(cè)IgG的ELISA方法，該方法與深圳芬德生物技術(shù)有限公司的PDE抗體診斷試劑盒的符合率100%。這些檢測(cè)方法中有采用PEDV全病毒、截?cái)嗟腟蛋白或N蛋白作為包被抗體建立了IgG-ELISA抗體檢測(cè)方法，也有采用截?cái)嗟腟蛋白作為包被抗原建立IgA-ELISA抗體檢測(cè)方法，但這些方法存在病毒擴(kuò)散帶來的風(fēng)險(xiǎn)或只能檢測(cè)血清中的IgG抗體或乳汁中的IgA抗體，且都存在不能同時(shí)檢測(cè)到血清中和乳汁中S、N蛋白IgA抗體的局限性。

本研究通過采用真核表達(dá)載體表達(dá)出的S-N雙基因融合蛋白，作為包被抗原，建立了PEDV IgA-ELISA抗體檢測(cè)方法。該方法檢測(cè)PRRSV、PRV、CSFV、TGEV、PoRV陽性血清結(jié)果均是陰性，即為無交叉反應(yīng)，能檢測(cè)到1∶3 200倍稀釋的血清抗體，批內(nèi)重復(fù)性和批間重復(fù)性的CV均小于10%，與BIONOTE 公司生產(chǎn)的 IgA 抗體商品化檢測(cè)試劑盒總符合率達(dá)到93.2%以上，可同時(shí)檢測(cè)到血清和乳汁中PEDV的IgA抗體。因此，本研究建立的PEDV IgA-ELISA抗體檢測(cè)方法，適合對(duì)PED的抗體監(jiān)測(cè)和疫苗免疫進(jìn)行效果評(píng)價(jià)，為進(jìn)一步確保豬群健康提供了有力的技術(shù)支撐。