陶晶 楊曉帆 趙志軒 李宏

1牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院高壓氧科，牡丹江 157000；2牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院康復(fù)科，牡丹江 157000；3 牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，牡丹江 157000；4牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院興平社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，牡丹江 157000

阿爾茲海默癥（Alzheimer’s disease，AD）是一種與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾?。?］。據(jù)國(guó)際2018 年發(fā)布的數(shù)據(jù)，預(yù)計(jì)到2050 年AD 患者將高達(dá)1.52億［2］。由于現(xiàn)有藥物不能完全治愈AD，且不良反應(yīng)較多［3］。因此，有必要去尋找新的突破性療法?，F(xiàn)有研究表明，AD 的主要特征是形成細(xì)胞外淀粉樣斑塊和細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFT）。β-淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，β-AP）是淀粉樣蛋白斑塊的主要成分，β-AP升高與認(rèn)知缺陷的嚴(yán)重程度有關(guān)［4］。tau 是存在于大腦中最高水平的微管相關(guān)蛋白，它為細(xì)胞骨架微管提供穩(wěn)定性，重要的是，神經(jīng)元中磷酸化tau的聚集阻斷了神經(jīng)元轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，并在NFT的形成中起關(guān)鍵作用。此外，磷酸化tau水平也與認(rèn)知障礙的行為異常密切相關(guān)［5］。因此，在本研究中，檢測(cè)了β-AP 和磷酸化tau 的水平。針灸是一種非藥物的傳統(tǒng)中醫(yī)療法，已有2 000多年的歷史。大量臨床研究顯示，針灸可有效改善患者的認(rèn)知功能，而且沒(méi)有明顯不良反應(yīng)。近年來(lái)，越來(lái)越多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)被用來(lái)探索針灸治療神經(jīng)退行性疾病的機(jī)制［6-7］。本研究旨在確定針刺療法是否可通過(guò)調(diào)節(jié)海馬中β-AP 和磷酸化tau的水平來(lái)改善學(xué)習(xí)和記憶能力，以期為未來(lái)針灸的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料

1.1.動(dòng)物與分組 本研究為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。SPF 級(jí)體質(zhì)量為240～270 g 的Wistar 雄性大鼠（合格證號(hào)02-24-4），購(gòu)自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，許可證號(hào)：SYXK（黑）2021-010。實(shí)驗(yàn)前大鼠適應(yīng)1周，在（20±2）℃和（50±10）%的相對(duì)濕度，12 h 的光照/黑暗循環(huán)（早上8：00 開(kāi)燈）環(huán)境下飼養(yǎng)所有大鼠（每籠5 只），自由進(jìn)食和水。使用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為以下4 組（每組5 只）：對(duì)照（A）組、模型（B）組、針刺（C）組、藥物治療對(duì)照（D）組。所有動(dòng)物程序均于2017 年10 月10日經(jīng)牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（NO.20-0509）。

1.2.主要藥品與試劑 D-半乳糖（D-galactose，D-gal，V900922，純度≥98%）獲自美國(guó)Sigma；三氯化鋁（AlCl3，7784-13-6，純度≥99%），氫溴酸東莨菪堿（scopolamine hydrobromine，SCOP，55-16-3，純度＞98%）獲自上海阿拉丁；哈伯因（HY-17387，純度≥98.0%）獲自美國(guó)MedChemExpress；β-AP（ab289991）、p-tau（s396，ab32057）和p-tau（s404，ab92676）均獲自英國(guó)Abcam；原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（11684817910）購(gòu)自瑞士Roche公司。

2.動(dòng)物造模［8］

將適應(yīng)生長(zhǎng)1 周的大鼠經(jīng)Y-迷宮測(cè)試剔除不合格大鼠。B組、C組和D組大鼠每天腹腔內(nèi)注射D-gal（48 mg/kg）、每天喂飼AlCl3水溶液2 ml（20 mg/ml），在實(shí)驗(yàn)觀察前10 min腹腔注射SCOP（2 mg/kg）。A 組大鼠常規(guī)飲水、進(jìn)食，并以上述方式（喂飼和腹腔注射）給予等量的生理鹽水。6 周后經(jīng)Y-迷宮測(cè)試檢驗(yàn)?zāi)Ｐ褪欠駱?gòu)建成功。

3.治療方法

C 組大鼠用量身定制的軟布材料包裹，并在有意識(shí)的狀態(tài)下俯臥，而不是麻醉。從腹腔注射D-gal 的第1 天開(kāi)始針刺。使用30 號(hào)0.5 寸毫針依照華興邦定穴法選取大鼠的腎俞、太溪、足三里、神門、百會(huì)穴5 個(gè)穴位并通過(guò)捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法1 min。隨后，連接G6805 電針治療儀（上海涵飛醫(yī)療）以1 Hz的頻率刺激20 min（連續(xù)波），強(qiáng)度控制以大鼠肢體輕度抖動(dòng)為度。每天1次，10 d為1個(gè)療程，治療3個(gè)療程。D 組自實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之日起每只大鼠每天灌服哈伯因混懸液（17 μg/2 ml），療程與C 組相同。A 組和B 組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)相同時(shí)間。治療結(jié)束后，觀察大鼠訓(xùn)練及行為學(xué)指標(biāo)。

4.方法

4.1.Y-迷宮測(cè)試［9］采用Y-迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠的記憶缺陷，檢測(cè)4 組大鼠電擊后的逃避潛伏期和正確次數(shù)。Y-迷宮測(cè)試由3個(gè)相似的臂組成，它們都彼此呈120°放置，具有三角形的中心區(qū)域。當(dāng)大鼠被放回設(shè)備中時(shí)，帶燈的一只手臂沒(méi)有電，剩下的兩只手臂帶電。大鼠被0.2 mA、500 ms、每1.5 s 的電流電擊一次。因此，為了避免被電擊，老鼠不得不從電臂競(jìng)技場(chǎng)移動(dòng)到?jīng)]有電的照明臂。迷宮上方的攝像機(jī)確定并記錄了大鼠從先前被阻塞的手臂移動(dòng)到打開(kāi)燈的非電動(dòng)手臂所花費(fèi)的逃生潛伏時(shí)間（逃避潛伏期）。大鼠在逃避潛伏期小于10 s時(shí)完成一次主動(dòng)回避，記錄主動(dòng)回避次數(shù)（正確次數(shù)）。

4.2.跳臺(tái)測(cè)試［10］跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)箱尺寸為25 cm×25 cm×75 cm，箱底用金屬網(wǎng)格覆蓋，在箱底一角放置一個(gè)高5 cm、直徑8 cm的安全平臺(tái)盒子。第1天，將大鼠放在安全平臺(tái)上。當(dāng)老鼠跳下平臺(tái)時(shí)，它的四肢會(huì)受到電擊（3 Hz，0.4 mA），經(jīng)過(guò)反復(fù)上下跳躍，老鼠最終會(huì)在平臺(tái)上停住300 s。第2 天重復(fù)同樣的實(shí)驗(yàn)，對(duì)大鼠第一次跳出平臺(tái)的時(shí)間（潛伏期）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，同時(shí)對(duì)大鼠在300 s內(nèi)跳出平臺(tái)的次數(shù)（錯(cuò)誤次數(shù)）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

4.3.莫里斯水迷宮測(cè)試［11］跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)后進(jìn)行莫里斯水迷宮測(cè)試檢測(cè)大鼠的空間學(xué)習(xí)能力。莫里斯水迷宮是一個(gè)圓形不銹鋼水池，直徑150 cm，高60 cm，將游泳池劃分成4 個(gè)象限。逃生平臺(tái)是一個(gè)直徑10 cm 的透明圓柱形平臺(tái)。實(shí)驗(yàn)分為兩部分：（1）定位航行實(shí)驗(yàn)：將大鼠從4 個(gè)不同的象限置于水池中，逃避潛伏期為大鼠從進(jìn)入水中爬上象限中心平臺(tái)的時(shí)間長(zhǎng)度。（2）空間探索實(shí)驗(yàn)：第6天，移走平臺(tái)，將大鼠從平臺(tái)所在象限對(duì)面的象限放回水池，對(duì)大鼠90 s 內(nèi)在原平臺(tái)象限停留時(shí)間（對(duì)目標(biāo)象限探索時(shí)間）和它們穿越平臺(tái)位置的數(shù)量（穿越平臺(tái)次數(shù)）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

4.4.尼氏體亞甲藍(lán)特殊染色 各組大鼠經(jīng)行為學(xué)指標(biāo)檢測(cè)后，麻醉大鼠，并通過(guò)腦灌注、固定，將大鼠從額極向后至枕極分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ五等份，取含有海馬的Ⅱ腦片，經(jīng)石蠟包埋后制備常規(guī)石蠟切片，通過(guò)Nissl 染色觀察各組大鼠海馬神經(jīng)元損傷情況。

4.5.TUNEL 染色 根據(jù)制造商說(shuō)明進(jìn)行TUNEL 染色以檢測(cè)Ⅱ腦片神經(jīng)元的凋亡情況。同時(shí)使用蘇木精對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，棕色細(xì)胞占藍(lán)色細(xì)胞的比值為神經(jīng)元凋亡率。

4.6.免疫組化檢測(cè)β-AP、tau 蛋白表達(dá) 將石蠟包埋的Ⅱ腦片切成5 μm 的切片，經(jīng)過(guò)脫蠟、水化、抗原修復(fù)、內(nèi)源酶滅活和封閉等一系列處理過(guò)程后，腦切片依次與一抗溶液和熒光偶聯(lián)二抗孵育，DAB 顯色，蘇木精襯染，并用顯微鏡觀察，陽(yáng)性細(xì)胞被染色為棕黃色。

5.統(tǒng)計(jì)分析

所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS 22.0，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用單因素方差分析進(jìn)行多組比較，然后選擇Tukey 檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.針刺療法改善D-gal 聯(lián)合AlCl3引起的AD 大鼠認(rèn)知功能障礙

由表1可見(jiàn)，Y-迷宮實(shí)驗(yàn)顯示，與A組相比，B組大鼠逃避潛伏期較長(zhǎng)，正確次數(shù)減少（均P＜0.05）；與B組相比，C組和D 組通過(guò)治療顯著縮短了大鼠逃避潛伏期，增加了正確次數(shù)（均P＜0.05）。跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)顯示，與A 組相比，B 組大鼠的逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，且錯(cuò)誤次數(shù)增加（均P＜0.05）；與B 組相比，C 組和D 組大鼠的逃避潛伏期明顯縮短，錯(cuò)誤次數(shù)顯著減少（均P＜0.05）。莫里斯水迷宮測(cè)試結(jié)果顯示，前5 d隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長(zhǎng)，各組大鼠逃避潛伏期縮短，且與A 組相比，B 組模型大鼠逃避潛伏期延長(zhǎng)，對(duì)目標(biāo)象限探索時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)減少（均P＜0.05）；與B 組相比，C 組和D 組經(jīng)治療后縮短了大鼠逃避潛伏期，同時(shí)增加了對(duì)目標(biāo)標(biāo)象限探索時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)（均P＜0.05）。以上數(shù)據(jù)顯示，針刺可緩解D-gal 聯(lián)合AlCl3引起的大鼠工作記憶和空間學(xué)習(xí)能力障礙，與哈伯因治療具有相類似的效果，表明針刺療法對(duì)改善認(rèn)知功能具有一定的積極作用。

表1 針刺療法對(duì)D-gal聯(lián)合AlCl3誘導(dǎo)的大鼠認(rèn)知功能障礙的影響（）

表1 針刺療法對(duì)D-gal聯(lián)合AlCl3誘導(dǎo)的大鼠認(rèn)知功能障礙的影響（）

注：A組為對(duì)照組，B組為AD模型組，C組為針刺組，D組為藥物治療對(duì)照組；D-gal為D-半乳糖，AlCl3為三氯化鋁，AD為阿爾茲海默癥；與A組比較，aP＜0.05；與B組比較，bP＜0.05；與C組比較，cP＜0.05

2.針刺療法改善D-gal 聯(lián)合AlCl3引起的AD 大鼠神經(jīng)元損傷

圖1、表2 結(jié)果顯示，A 組大鼠海馬CA1、CA3、DG 區(qū)神經(jīng)元呈錐形，排列緊密；同時(shí)，尼氏體增多，細(xì)胞排列緊密，形態(tài)規(guī)則，胞質(zhì)顏色較深。相反，B 組模型大鼠海馬尼氏體疏松、稀疏、形狀不規(guī)則，尼氏體數(shù)量明顯減少，表明D-gal聯(lián)合AlCl3誘導(dǎo)CA1、CA3 和DG 區(qū)神經(jīng)元損傷。與B 組相比，C 組和D 組大鼠海馬錐體細(xì)胞恢復(fù)，并保持基本神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)完整；同時(shí)CA1、CA3、DG 區(qū)尼氏體數(shù)量增多。對(duì)各組大鼠尼氏體數(shù)量統(tǒng)計(jì)得出，針刺治療后可顯著增高D-gal聯(lián)合AlCl3引起的尼氏體數(shù)量減少（均P＜0.05），且與哈伯因治療效果相似?？傊槾摊煼@示出了對(duì)AD大鼠的保護(hù)作用并逆轉(zhuǎn)了D-gal聯(lián)合AlCl3誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元損傷。

圖1 尼氏體亞甲藍(lán)特殊染色檢測(cè)各組大鼠海馬神經(jīng)元損傷情況（尼氏體呈現(xiàn)紫藍(lán)色 ×400）

表2 各組大鼠海馬組織中尼氏體數(shù)量定量分析（個(gè)，）

表2 各組大鼠海馬組織中尼氏體數(shù)量定量分析（個(gè)，）

注：A 組為對(duì)照組，B 組為阿爾茲海默癥（AD）模型組，C 組為針刺組，D 組為藥物治療對(duì)照組；與A 組比較，aP＜0.05；與B 組比較，bP＜0.05；與C組比較，cP＜0.05

3.針刺療法抑制D-gal 聯(lián)合AlCl3引起的AD 大鼠海馬組織中神經(jīng)元凋亡

A 組、B 組、C 組、D 組大鼠海馬組織中神經(jīng)元凋亡率依次 為（3.15±0.21）%、（21.36±2.57）%、（13.21±1.25）%、（11.25±1.23）%；與A 組比較，B組大鼠海馬組織中神經(jīng)元凋亡率升高（P＜0.05）；與B 組比較，C 組和D 組大鼠海馬組織中神經(jīng)元凋亡率降低（均P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 TUNEL染色檢測(cè)各組大鼠神經(jīng)元凋亡情況（棕色細(xì)胞表示凋亡的神經(jīng)元 ×400）

4.針刺療法降低D-gal 聯(lián)合AlCl3引起的AD 大鼠海馬組織中β-AP和tau水平

圖3、表3 結(jié)果顯示，與A 組比較，B 組大鼠海馬組織中β-AP、p-tau（s396）和p-tau（s404）顯著升高（均P＜0.05）；與B組比較，C組和D組大鼠海馬組織中β-AP、p-tau（s396）和p-tau（s404）明顯降低（均P＜0.05）。

表3 各組大鼠海馬組織中β-AP和tau水平統(tǒng)計(jì)（%，）

表3 各組大鼠海馬組織中β-AP和tau水平統(tǒng)計(jì)（%，）

注：A 組為對(duì)照組，B 組為AD 模型組，C 組為針刺組，D 組為藥物治療對(duì)照組；β-AP 為β-淀粉樣蛋白，AD 為阿爾茲海默癥；與A 組比較，aP＜0.05；與B組比較，bP＜0.05；與C組比較，cP＜0.05

圖3 免疫組化檢測(cè)各組大鼠海馬組織中β-AP和tau水平（棕黃色細(xì)胞表示陽(yáng)性細(xì)胞 ×400）

討論

雖然AD的病理改變發(fā)生在腦內(nèi)，但中醫(yī)臟腑辨證認(rèn)為其病根與腎功能不全有關(guān)。根據(jù)中醫(yī)理論，腦與腎密切相關(guān)，腎含精髓。此外，延髓還可以生成骨髓，促進(jìn)腦功能［12］。因此，正常的大腦功能依賴于腎精，補(bǔ)腎化痰中藥對(duì)AD 有一定療效。據(jù)報(bào)道，電針百會(huì)、腎俞、太溪穴可抑制AD小鼠模型β-AP的形成［13］。研究表明，百會(huì)和足三里穴聯(lián)合使用可增強(qiáng)AD大鼠的治療效果［14］。此外，神門穴是手少陰心經(jīng)的輸穴和原穴，主治癡呆［15］。據(jù)報(bào)道，腹腔注射D-gal 被廣泛用于衰老相關(guān)疾病的研究。研究證實(shí)，腹腔注射D-gal可誘導(dǎo)氧化損傷，通過(guò)升高丙二醛水平和降低超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性在短時(shí)間內(nèi)引起亞急性衰老動(dòng)物模型［16］。綜上，本研究采用腹腔注射D-gal 聯(lián)合AlCl3誘導(dǎo)AD 大鼠模型，依照華興邦定穴法選取大鼠的腎俞、太溪、足三里、神門和百會(huì)穴5 個(gè)穴位進(jìn)行針刺治療，以探究針刺療法對(duì)AD大鼠的治療作用及其作用機(jī)制。

為了探究針刺是否可改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，采用Y-迷宮、跳臺(tái)和莫里斯水迷宮等一系列實(shí)驗(yàn)檢測(cè)針刺治療對(duì)AD 大鼠行為變化的影響。據(jù)報(bào)道，Y-迷宮測(cè)試被廣泛應(yīng)用于研究小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力［9］；跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)則是操作簡(jiǎn)單、可行性較大的一種學(xué)習(xí)記憶的實(shí)驗(yàn)方案［10］；莫里斯水迷宮實(shí)驗(yàn)是研究嚙齒動(dòng)物海馬依賴的空間參考學(xué)習(xí)和記憶最可靠的方法之一［11］。本研究結(jié)果表明，AD 模型大鼠的記憶和學(xué)習(xí)功能障礙會(huì)導(dǎo)致行為表現(xiàn)異常，且神經(jīng)元受損，神經(jīng)元凋亡增加，這表明該模型是成功的。然而，在使用針刺治療后，3 種檢測(cè)方法中的逃避潛伏期均縮短，且神經(jīng)元損傷與凋亡有所改善，表明針刺療法改善了大鼠的認(rèn)知能力并改善了記憶缺陷。另外，哈伯因又稱石杉?jí)A甲，數(shù)百年來(lái)一直在中國(guó)民間醫(yī)學(xué)中用于治療癡呆癥［17］。本研究結(jié)果顯示，針刺療法與藥物治療效果類似，表明針刺療法可用于臨床AD的治療，但是否將經(jīng)典藥物治療與非藥物干預(yù)相結(jié)合具有更好的效果仍不清楚。此外，本結(jié)果還顯示針刺療法略弱于藥物治療效果，可能與藥物干預(yù)的劑量有關(guān)，也可能與藥物多靶點(diǎn)的特性有關(guān)，關(guān)于其具體的原因仍需要更深入探究。

β-AP 和磷酸化tau 是AD 的特征性病理產(chǎn)物和治療靶點(diǎn)，多年來(lái)一直在研究它們?cè)谡J(rèn)知障礙相關(guān)疾病中的作用。此外，已經(jīng)證明β-AP 可以形成老年斑并導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，以及認(rèn)知和記憶障礙［18］。磷酸化tau蛋白是參與AD機(jī)制的另一個(gè)重要因素。微管相關(guān)蛋白——tau 蛋白是細(xì)胞骨架的重要組成部分，也是確保微管系統(tǒng)完整性和穩(wěn)定性的關(guān)鍵。所以磷酸化tau 蛋白水平升高會(huì)通過(guò)調(diào)控微管的穩(wěn)定性促進(jìn)NFT 形成，誘發(fā)AD［19］。目前，已在tau蛋白上鑒定出多種磷酸化位點(diǎn)，其中s396 和s404 被鑒定為參與調(diào)節(jié)微管與tau蛋白結(jié)合并與斑塊密切相關(guān)的關(guān)鍵位點(diǎn)［20］。因此，檢測(cè)海馬中β-AP、p-tau（s404）和p-tau（s396）的水平是評(píng)估AD 治療效果的關(guān)鍵。根據(jù)本研究結(jié)果，針刺療法可改善行為測(cè)試中的學(xué)習(xí)和空間記憶障礙，這種效果可能與海馬中β-AP、p-tau（s404）和p-tau（s396）的減少相關(guān)。但無(wú)論如何，以上結(jié)果都無(wú)法證明針刺療法是通過(guò)直接還是間接的方式導(dǎo)致了AD模型大鼠海馬區(qū)β-AP、p-tau（s404）和p-tau（s396）的變化，還有待進(jìn)一步完善。

總之，這是一篇在AD模型中評(píng)估針刺腎俞、太溪、足三里、神門和百會(huì)穴5 個(gè)穴位的治療效果以及其對(duì)β-AP 和磷酸化tau 水平影響的文章。筆者發(fā)現(xiàn)，對(duì)腎俞、太溪、足三里、神門和百會(huì)穴5 個(gè)穴位的針刺治療顯著提高了AD 大鼠的學(xué)習(xí)以及記憶能力，并減輕了神經(jīng)元損傷與凋亡，這可能是與通過(guò)降低β-AP和磷酸化tau水平的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突