王凱鵬，鄭晶瑩，徐雪陽，丁怡玲，呂永梅，劉金彬，余曉紅，靳文斌

(鹽城工學(xué)院 海洋與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城，224051)

阿魏酸(ferulic acid, FA)是植物組織中含量最豐富的酚酸之一，以單體或二聚體的形式通過酯鍵或醚鍵與木質(zhì)素和多糖共價連接[1]。由于FA是具有不飽和側(cè)鏈的酚酸，使其擁有強(qiáng)大的抗氧化能力，具有很高的商業(yè)價值[2]。美國食品藥品監(jiān)督管理局在食品添加劑清單中將FA列為抗氧化劑[3]。除此之外，F(xiàn)A在食品工業(yè)中還被用作防腐劑、風(fēng)味前體、膠凝劑、增稠劑[4]。目前工業(yè)上通常采用堿液浸提法制備FA，即在高溫下堿液裂解原料的空間結(jié)構(gòu)，使FA釋放出來，然后加入有機(jī)溶劑進(jìn)行提取。但是該法生產(chǎn)過程中產(chǎn)生大量廢水廢渣，造成了大量環(huán)境污染[5]。而酶解法反應(yīng)條件溫和且綠色環(huán)保，因此受到研究者的廣泛關(guān)注。

阿魏酸酯酶(E.C.3.1.1.73)，又稱肉桂酸酯酶，該酶能水解FA與半纖維素或木質(zhì)素之間的酯鍵，從植物細(xì)胞壁釋放FA及其二聚體，通常被用作水解木質(zhì)纖維素產(chǎn)FA。例如XU等[6]分離到一株阿魏酸酯酶的生產(chǎn)菌，在大腸桿菌中異源表達(dá)，純化的阿魏酸酯酶分解0.2 g脫淀粉麥麩可產(chǎn)生199 μg FA，具有巨大的應(yīng)用潛力。但是市場上的商用阿魏酸酯酶稀缺，而且游離阿魏酸酯酶易失活，難以回收利用限制了其工業(yè)化應(yīng)用[7]。固定化酶具有可循環(huán)利用、快速分離的特點，可以很好的解決這類問題。HE等[8]使用磁性納米顆粒固定化阿魏酸酯酶生產(chǎn)FA，與游離酶相比，固定化酶明顯提高了最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性，但是用于催化脫淀粉麥麩產(chǎn)FA時表現(xiàn)出較低的產(chǎn)物得率，主要是因為固定化酶與不溶性底物的接觸性較差。

Eudragit L-100是一種由甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯組成的pH響應(yīng)型聚合物，當(dāng)溶液pH<4.0時，該聚合物不溶于水；當(dāng)溶液pH>6.0時該聚合物溶于水[9]。因此，在一定的pH范圍內(nèi)，Eudragit L-100可與游離酶結(jié)合形成可溶性固定化酶用于催化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，通過降低溶液pH值，將固定化酶從反應(yīng)體系中分離出來[10]。該類型固定化酶用于催化反應(yīng)尤其是作用于不溶性底物時，表現(xiàn)出較好的催化效果。例如YU等[11]在Eudragit L-100上共固定化3種酶(纖維素酶、葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶)，降解玉米秸稈中纖維素產(chǎn)葡萄糖酸，葡萄糖酸的產(chǎn)率為61.41%，6次循環(huán)后其活性仍保持52.38%。

近年來，隨著對FA及其衍生物的研究越來越多，對于阿魏酸酯酶的研究也隨之增加。針對固定化阿魏酸酯酶與不溶性的木質(zhì)纖維素接觸較差，難以與殘留的固體底物完全分離這一問題，我們擬采用pH響應(yīng)型聚合物Eudragit L-100固定化阿魏酸酯酶，探究其用于降解脫淀粉麥麩產(chǎn)FA的可行性。首先，對固定化酶的反應(yīng)條件(交聯(lián)劑濃度、固定化pH、固定化時間、反應(yīng)溫度等參數(shù))進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳固定化酶條件。其次，研究固定化后對阿魏酸酯酶酶學(xué)性質(zhì)的影響。最后，采用固定化酶降解脫淀粉麥麩產(chǎn)FA，研究其催化性能。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

阿魏酸酯酶，Megazyme (Bray, Co.Wicklow, Ireland)；FA、阿魏酸甲酯(ferulic acid methyl ester, MFA)、Eudragit L-100、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide，EDC]，上海麥克林生化有限公司。

安捷倫1260高效液相色譜系統(tǒng)(紫外檢測器)，美國安捷倫科技有限公司；Nicolet iS 10傅里葉變換紅外光譜儀(Fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR)，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；FEI Nova Nano SEM 450掃描電子顯微鏡，美國FEI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 Eudragit L-100固定化酶

稱取5 g Eudragit L-100至90 mL蒸餾水中，緩慢滴加3 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至11.0，待完全溶解后，再緩慢滴加3 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至6.0，超聲處理10 min，定容至100 mL，4 ℃貯存[11]。取一定濃度的EDC溶解于Eudragit L-100溶液(10 mL)中，攪拌10 min后，將阿魏酸酯酶(6 U)加入上述溶液中，室溫攪拌一定時間，用濃度為100 mmol/L醋酸緩沖液調(diào)節(jié)pH至4.0進(jìn)行沉淀，然后在4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min，再用pH 4.0的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液洗滌，最后將沉淀溶于10 mL 0.1 mol/L的PBS緩沖液(pH 6.0)中留作備用。

1.2.2 Eudragit L-100固定化酶形態(tài)和結(jié)構(gòu)表征

采用掃描電鏡對Eudragit L-100固定化酶前后的形態(tài)特征進(jìn)行表征。采用FT-IR對固定化酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

1.2.3 阿魏酸酯酶活性測定

以1 mmol/L MFA溶液為底物，測定阿魏酸酯酶的酶活力。底物原液(950 μL)在40 ℃保溫10 min，加入稀釋后的酶液(50 μL)開始反應(yīng)。將混合物在40 ℃下保溫5 min，然后煮沸5 min，終止反應(yīng)。采用高效液相色譜法測定釋放阿魏酸的含量，酶活性單位定義為每分鐘釋放1 μmol FA所需的量[1]。

1.2.4 固定化阿魏酸酯酶最適反應(yīng)溫度

50 μL固定化阿魏酸酯酶分別與950 μL 1 mmol/L MFA溶液在溫度為20、30、40、50、60 ℃條件下反應(yīng)5 min，100 ℃煮沸5 min，高效液相色譜測定阿魏酸酯酶的催化活性，將固定化阿魏酸酯酶的最高酶活力分別定義為100%，計算不同溫度下固定化酶的相對酶活力。

1.2.5 固定化阿魏酸酯酶最適反應(yīng)pH測定

50 μL固定化阿魏酸酯酶分別與950 μL pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的1 mmol/L MFA溶液反應(yīng)5 min，100 ℃煮沸5 min，用高效液相色譜測定酶的催化活性，將固定化阿魏酸酯酶的最高酶活力定義為100%，計算不同pH值下固定化酶的相對酶活力。

1.2.6 固定化阿魏酸酯酶熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性測定

測定固定化酶熱穩(wěn)定性，將固定化阿魏酸酯酶在30～70 ℃的PBS緩沖液(pH 6.0)中孵育1 h，然后測定其活性。測定固定化酶pH穩(wěn)定性，將固定化阿魏酸酯酶置于40 ℃、pH 5.0～9.0的PBS緩沖液中孵育1 h，然后測定阿魏酸酯酶活性。

1.2.7 游離酶與固定化酶動力學(xué)參數(shù)測定

一定量的游離酶與固定化酶分別添加到一系列不同濃度MFA(0.25～10 mmol/L)的反應(yīng)液中，在最適溫度與最適pH下測定酶活力，使用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作曲線計算出Km和Vmax值[12]。

1.2.8 固定化阿魏酸酯酶貯藏穩(wěn)定性測定

取游離酶與固定化阿魏酸酯酶，4 ℃冰箱放置，每隔7 d取50 μL游離酶與固定化酶測定其活性。

1.2.9 固定化阿魏酸酯酶可重復(fù)使用性測定

取10 mg/mL脫淀粉麥麩溶液，加入固定化酶在40 ℃、200 r/min的搖床上進(jìn)行分解反應(yīng)，12 h為1個循環(huán)。每次循環(huán)結(jié)束后，以8 000 r/min的速度離心使固定化阿魏酸酯酶與反應(yīng)殘余固體底物分離。然后收集含有固定化酶的上清液，將混合物的pH值調(diào)至4.0實現(xiàn)固定化酶的析出，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，去掉上清液，pH 4.0的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液洗滌，進(jìn)入下一輪反應(yīng)，以此類推，重復(fù)使用5次[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿魏酸酯酶固定化參數(shù)的優(yōu)化

在制備固定化酶的過程中，固定化時間、交聯(lián)劑濃度、反應(yīng)溫度和固定化pH等因素都會影響酶的固定化，因此分別對這些參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。以加入的酶活性為總酶活性，固定化后的酶活性為剩余酶活性計算相對酶活性。

首先，研究了固定化時間對固定化酶活性的影響。如圖1-a所示，隨著固定化時間的延長，固定化酶的活性逐漸增加，并在固定化時間為1 h時達(dá)到峰值，隨著固定化時間的延長，酶活性略有下降。

如圖1-b所示，低濃度的EDC可能不能有效地激活Eudragit L-100上的羧基，因此使得固定化酶的活性較低。當(dāng)EDC質(zhì)量濃度為5 g/L時，固定化酶活性最高，由于基團(tuán)活化已達(dá)到飽和，固定化酶的活性隨EDC濃度的繼續(xù)增加而略有下降。同時研究了固定化溫度對固定化酶活性的影響，如圖1-c所示，固定化酶活性在25 ℃時達(dá)到最大值，隨著固定化溫度的升高，固定化酶的活性略有下降。阿魏酸酯酶在Eudragit L-100上的固定化受pH的影響很大，如圖1-d所示，固定化的阿魏酸酯酶活性隨著pH從4.0增加到6.0而增加，并且在pH 6.0時達(dá)到最大值。當(dāng)pH超過6.0時，固定化酶活性降低。原因可能是低pH值和高pH值的反應(yīng)溶液使酶失活。載體在與交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)后，會產(chǎn)生大量游離的OH-，使得溶液中pH值升高，而游離酶在高pH值情況下會損失部分酶活性(圖5-b)，因此會導(dǎo)致固定酶活性損失。

a-固定化時間;b-EDC質(zhì)量濃度;c-固定化溫度;d-固定化pH

2.2 固定化前后的形態(tài)和結(jié)構(gòu)特性

a-Eudragit L-100;b-固定化酶

進(jìn)一步采用掃描電子顯微鏡觀察固定化酶形貌變化(圖3)，未改性Eudragit L-100共聚物的形態(tài)排列緊密，分布均勻，共聚物表面圓滑，呈球形(圖3-a)。Eudragit L-100載體對阿魏酸酯酶進(jìn)行共價改性后，共聚物變得高度均一，蛋白膜表面粗糙空洞(圖3-b)。這是由于Eudragit L-100載體與蛋白酶分子共價交聯(lián)，導(dǎo)致共聚物分子與酶分子鍵合牢固。在冷凍干燥過程中，蛋白質(zhì)分子相互作用，在蛋白質(zhì)表面形成膜和孔，共聚物被包埋在蛋白質(zhì)分子中，分布較為均勻，呈現(xiàn)出新的形態(tài)特征[11]。

a-Eudragit L-100;b-固定化酶

2.3 固定化酶最適反應(yīng)溫度與最適反應(yīng)pH

為確定固定化酶的最適反應(yīng)溫度和pH值，在不同的溫度和pH值下進(jìn)行催化反應(yīng)。首先研究溫度對酶活性的影響，如圖4-a所示，游離阿魏酸酯酶和固定化酶在40 ℃下均表現(xiàn)出最佳催化活性。此外，固定化酶在更大范圍內(nèi)保持了比游離阿魏酸酯酶更高的相對活性。游離阿魏酸酯酶活性在40 ℃以上迅速下降，在60 ℃保持83%的殘留活性。然而，固定化酶在60 ℃仍保持92%的殘余活性。原因可能是載體與酶分子之間的多點共價連接會降低酶的構(gòu)象靈活性[10,16]。

a-最適溫度;b-最適pH

在pH為5.0～9.0，溫度為40 ℃條件下，研究pH對酶活性的影響，如圖4-b所示，游離阿魏酸酯酶和固定化酶的最適反應(yīng)pH值分別為7.0和8.0。此外與游離酶相比，固定化酶在更大pH范圍內(nèi)表現(xiàn)出更高的相對活性。根據(jù)文獻(xiàn)報道，有些酶在固定化后最適反應(yīng)pH發(fā)生了改變[17-18]。此外通過共價結(jié)合固定酶的pH值范圍更廣。

2.4 固定化酶熱穩(wěn)定性與pH穩(wěn)定性

因為酶分子容易失活，因此考察固定化酶的穩(wěn)定性非常重要。如圖5-a所示，在30～70 ℃研究固定化酶的熱穩(wěn)定性。50 ℃保溫1 h后，固定化酶的殘留活性為50%。而游離阿魏酸酯酶在相同條件下只有30%的殘留活性。經(jīng)相同時間的70 ℃熱處理后，固定化酶和游離酶的殘余活性分別約為28%和2%。結(jié)果表明，固定化酶的熱穩(wěn)定性優(yōu)于游離酶。這可能是由于載體與酶分子之間的多點共價鍵連接使酶的構(gòu)象靈活性降低所致[19]。

a-熱穩(wěn)定性;b-pH穩(wěn)定性

同時本文還研究了pH對固定化酶穩(wěn)定性的影響，如圖5-b所示，40 ℃保溫1 h后，游離酶和固定化酶均能在pH 8.0時保持最大活性，殘余活性分別為52%和61%。然而固定化酶在pH 5.0～9.0具有更高的穩(wěn)定性，在pH 9.0時殘留的酶活性保持近56%，而游離酶活性保持了28%。原因很可能是載體對酶分子的活性位點進(jìn)行了保護(hù)[20]。

2.5 固定化酶動力學(xué)參數(shù)

如表1所示，固定化酶的Km值與Vmax值是游離酶的1.6倍與8.9倍，固定化酶的kcat值則是游離酶的14.5倍，酶的催化活性以kcat/Km表示，游離酶為0.125 L/(mmol·min)，固定化酶為1.13 L/(mmol·min)，與游離酶相比，固定化酶的Vmax值增大，Km也有所增加，kcat/Km值增加了9.04倍，動力學(xué)參數(shù)的這些變化說明固定化后，酶的催化反應(yīng)效率提升。這是因為Eudragit L-100分子附著在酶蛋白上，使得固定化酶分子具有高的生物相容性以及親水性，可能會影響到酶表面的水合度，反應(yīng)條件為均相反應(yīng)，沒有阻礙底物與酶分子的接觸，同時還抵御了外界環(huán)境的變化，對酶蛋白起保護(hù)作用，進(jìn)而使得催化效率提高[21]。

表1 游離阿魏酸酯酶與固定化阿魏酸酯酶動力學(xué)參數(shù)

2.6 固定化阿魏酸酯酶貯藏穩(wěn)定性

如圖6所示，貯存1周時，游離酶與固定化酶的酶活性降低都不明顯，在貯存3周后，游離阿魏酸酯酶僅剩53%活性，而固定化阿魏酸酯酶仍能保持80%以上活性，說明經(jīng)過固定化后，酶的貯存穩(wěn)定性有所提升，原因可能是(1)固定化后阿魏酸酯酶形成多點共價連接，形成了共價鍵，有效的保護(hù)了酶的催化活性中心；(2)阿魏酸酯酶被固定化后限制了酶分子間的相互作用，增加了其貯藏時間。

圖6 固定化酶貯藏穩(wěn)定性

2.7 固定化酶的重復(fù)使用性

為研究固定化酶的可重復(fù)使用性，對固定化阿魏酸酯酶進(jìn)行連續(xù)水解脫淀粉麥麩實驗。利用游離阿魏酸酯酶和固定化阿魏酸酯酶，以脫淀粉麥麩為底物水解制備阿魏酸。如圖7所示，固定化酶能產(chǎn)生與游離阿魏酸酯酶幾乎相同的阿魏酸(相同酶活性0.52 U，反應(yīng)時間12 h，0.1 g脫淀粉麥麩)。固定化酶的阿魏酸釋放量為總阿魏酸的9.3%，游離阿魏酸酯酶為9.8%。相比ZHANG等[22]固定化纖維素酶5次重復(fù)后剩余50%活性，阿魏酸酯酶在5次循環(huán)后仍有60%以上活性。重復(fù)使用后固定化酶活性的下降可能是(1)洗滌過程中造成了酶的喪失；(2)連續(xù)調(diào)節(jié)溶液pH，影響酶的活性部位，使部分酶失活。

圖7 固定化酶的重復(fù)使用性能

3 結(jié)論

綜上所述，通過共價結(jié)合將阿魏酸酯酶固定在可逆的可溶性載體Eudragit L-100上是可行的。在對固定化阿魏酸酯酶形貌及結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征后，優(yōu)化固定化條件，研究了交聯(lián)劑濃度、固定化pH、固定化時間和反應(yīng)溫度對固定化酶活性的影響。固定化的最佳條件為EDC 5 g/L，pH 6.0，固定化時間1 h，固定化溫度25 ℃。同時研究了固定化酶的最適溫度和pH值，比較后發(fā)現(xiàn)，固定化酶相對于游離酶擁有更高的適用范圍。而且與游離酶相比，固定化酶具有更好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性。同時對固定化酶貯藏穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，在4 ℃貯藏3周后仍保持80%以上活性。此外，以脫淀粉麥麩為底物制備阿魏酸時，固定化酶5次重復(fù)使用后仍保持約64%的殘余活性。對于不溶底物的酶解，本文研究的將酶固定化于可逆的可溶載體Eudragit L-100上提供了一個更加簡單有效的方法。