吳瑕，劉志軍，查健，龔國利

(陜西科技大學 食品科學與工程學院，陜西 西安，710021)

蛋清溶菌酶(egg white lysozyme, EWLys)來源于雞蛋清，屬C型溶菌酶，由129個氨基酸殘基組成，分子質量為14.4 kDa[1-2]。蛋清溶菌酶作為一種細菌細胞壁水解酶，通過降解肽聚糖層N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之間的β-1,4糖苷鍵，使菌體發(fā)生溶脹、死亡，實現(xiàn)高效殺菌[3-4]。該酶因其廣譜抑菌性能[5]而具有較高商業(yè)價值[6]，在食品防腐和醫(yī)藥領域具有廣泛用途[7-8]。近年來，隨著無抗養(yǎng)殖的發(fā)展，蛋清溶菌酶被視為一種低成本飼料添加劑，用于預防及治療動物細菌感染，在畜牧養(yǎng)殖領域具有良好的應用前景[9-10]。

目前，蛋清溶菌酶的工業(yè)化生產(chǎn)主要通過化學法從雞蛋中提取，其回收率較低，生產(chǎn)成本較高[11]。利用微生物生產(chǎn)蛋清溶菌酶并配合高密度發(fā)酵，有望實現(xiàn)其低成本、高收率工業(yè)化生產(chǎn)[9]。目前，重組蛋清溶菌酶在大腸桿菌、乳酸乳球菌、釀酒酵母中得到表達，但是其分別面臨菌體裂解、酶活力喪失、分泌效率低的問題[12-14]。巴斯德畢赤酵母作為一種廣泛應用的異源蛋白表達系統(tǒng)[15-16]，具有遺傳背景清晰、分子操作簡單、培養(yǎng)方便等優(yōu)點，可對目的蛋白進行分泌表達及糖基化修飾[17-18]，已成功用于高效表達多種來源的蛋白質[19-21]。蛋清溶菌酶在這一微生物中的重組分泌表達已有報道，活性收率達到667～976 U/mL[11,22]。然而，這些研究并未比較重組蛋清溶菌酶與天然蛋清溶菌酶之間的生化性質異同?，F(xiàn)有研究表明，重組酶與天然酶的生化特性常存在不同程度的差異，且該差異隨表達系統(tǒng)及表達條件的改變而發(fā)生變化[23-25]。

為此，本研究根據(jù)畢赤酵母GS115的密碼子偏好性，合成了蛋清溶菌酶基因并將其整合至畢赤酵母基因組，構建了分泌型重組菌株，實現(xiàn)了蛋清溶菌酶在畢赤酵母GS115中的異源表達。通過對該重組酶粗酶液的主要生化特性進行分析及初步表征，證實其與天然蛋清溶菌酶性質相近。這一研究為蛋清溶菌酶的工業(yè)化微生物生產(chǎn)及應用提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

藤黃微球菌Micrococcusluteus10209，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；巴斯德畢赤酵母GS115由本實驗室保存；pPIC9K載體由本實驗室保存；蛋清溶菌酶基因序列的密碼子優(yōu)化及合成由南京金斯瑞生物技術股份有限公司完成；引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

YPD培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，高壓滅菌后加40%(質量分數(shù))葡萄糖使其終質量分數(shù)為2%。MD培養(yǎng)基：3.4 g/L YNB(無氨基酵母氮源)，10 g/L (NH4)2SO4，0.4 g/L DO Supplement(缺陷型氨基酸混合物)，pH調至6.0，滅菌后40%葡萄糖使其終質量分數(shù)為2%。BMGY培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L，酵母提取物10 g/L，10 mL甘油溶解并定容至800 mL水中，高壓滅菌后加入100 mL 1 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH 6.0)，100 mL 10×YNB，2 mL 500×Biotin，混勻備用。BMMY培養(yǎng)基：蛋白胨20 g，酵母提取物10 g，溶解并定容于800 mL水中，滅菌20 min。冷卻至室溫，加入100 mL 1 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH 6.0)，100 mL 10×YNB，2 mL 500×Biotin，5 mL甲醇。固體培養(yǎng)基在對應液體培養(yǎng)基的基礎上加20 g/L瓊脂粉。

1.1.3 儀器與設備

SX-500滅菌鍋，TOMY；Infinite M NANO酶標儀，TECAN；A200 PCR儀，杭州朗基科學儀器有限公司；PHS-25精密pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；SW-CJ 生物潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；DW-YL270醫(yī)用低溫箱，中科美菱低溫科技股份有限公司；HNY-2102C恒溫培養(yǎng)箱，天津歐諾儀器股份有限公司；SCIENTZ-2C基因導入儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；B-500 超微量紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；MDF-382超低溫冰箱，松下冷鏈大連有限公司；JY600C電泳儀，北京君意東方電泳設備有限公司；GL124-1SCN 精密電子天平，賽多利斯科學儀器北京有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株構建及篩選

根據(jù)NCBI網(wǎng)站上發(fā)表的蛋清溶菌酶基因序列，根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性人工合成蛋清溶菌酶目的基因，以pPIC9K載體為模板，通過Snab I和NotI酶切位點，構建重組表達載體pPIC9K-EWLys。

挑取經(jīng)YPD平板劃線活化的畢赤酵母GS115單菌落，接種于10 mL YPD液體培養(yǎng)基中，于30 ℃過夜培養(yǎng)，轉接至50 mL YPD液體培養(yǎng)基，于30 ℃培養(yǎng)至OD600值為0.8～1.2。離心收集菌體(4 ℃，5 000 r/min，5 min)，以20 mL無菌水及10 mL 1 mol/L山梨醇溶液分別洗滌1次，重懸于3 mL 1 mol/L山梨醇溶液，分裝至無菌1.5 mL離心管中，完成感受態(tài)細胞的制備。使用SalI酶將表達載體pPIC9K-EWLys線性化，取2 μL酶切產(chǎn)物加入100 μL感受態(tài)細胞中，冰上靜置5 min后轉入預冷的電轉杯中。設定電轉參數(shù)為電壓1.5 kV，電阻400 Ω，電容為25 μF。電擊完成后立即加入1 mL YPD吸打混勻轉至1.5 mL離心管中，于30 ℃、200 r/min條件下孵育2 h。離心(8 000 r/min, 2 min)收集菌體，以1 mL 1 mol/L山梨醇洗滌1次，重懸于200 μL山梨醇溶液(1 mol/L)，并涂布于MD(Without His)平板，于30 ℃培養(yǎng)48 h。隨機挑取轉化子，使用引物5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′(α-Factor)及5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′(AOX1)進行菌落PCR驗證陽性轉化子，之后使用G418抗生素梯度篩選高拷貝轉化子。

1.2.2 高產(chǎn)工程菌株的試管發(fā)酵篩選

挑取陽性轉化子單菌落接種于2 mL BMGY培養(yǎng)基中，于30 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h(OD600=6～8)，離心收集菌體(12 000 r/min, 5 min)，重懸于2 mL BMMY培養(yǎng)基，于30 ℃、200 r/min培養(yǎng)，每隔24 h補加甲醇溶液使其終體積分數(shù)為0.5%進行誘導，誘導72 h后，將菌液轉移至50 mL離心管中，4 000 r/min離心10 min，收集上清液存于4 ℃?zhèn)溆谩φ战M為未經(jīng)G418抗性篩選的工程菌株。

1.2.3 蛋清溶菌酶粗酶液的活性測定

測定方法參照GB 1886.257—2016《食品安全國家標準 食品添加劑 溶菌酶》，挑取藤黃微球菌Micrococcusluteus10209甘油菌過夜培養(yǎng)(30 ℃，200 r/min)，轉接培養(yǎng)至OD450值為0.6～0.8，取1 mL菌液離心(12 000 r/min, 1 min)后棄上清液，用50 mmol/L Tris-HCl潤洗2次，之后用200 μL Tris-HCl重懸。以重懸后的藤黃微球菌為底物，在50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.0)體系中測定重組蛋清溶菌酶粗酶(發(fā)酵上清液)的活性。在96孔板中設置反應體系為120 μL Tris-HCl緩沖液+15 μL菌懸液+15 μL發(fā)酵上清液，對照組為未經(jīng)G418抗性篩選的工程菌株，利用酶標儀監(jiān)測OD450值的變化，酶活力的計算如公式(1)所示：

(1)

式中：酶活力，U/mL；A2、A4為第2 min和第4 min測得的OD450值；2為時間間隔2 min；0.001為使用藤黃微球菌懸濁液在450 nm 處每分鐘引起吸光度變化為0.001；0.015代表所用酶的體積為0.015 mL。

1.2.4 溫度對重組蛋清溶菌酶粗酶液活性的影響

將重組酶在不同溫度(60、70、80、90 ℃)加熱處理不同時間后，測定殘余酶活力(方法同1.2.3，以不加熱時的酶活力為100%)，并計算熱失活過程的動力學及熱力學參數(shù)。熱力學參數(shù)的計算如公式(2)～公式(5)所示：

(2)

ΔH=Ea-R

(3)

(4)

(5)

式中：Ea為活化能，J/mol；R為摩爾氣體常數(shù)，J/(mol·K)；slope為Arrhenius圖譜中曲線的斜率；ΔH、ΔG、ΔS分別為熱失活過程中的活化焓、活化熵、活化吉布斯自由能，J/mol；T為絕對溫度，K；h為普朗克常數(shù)；ki為不同溫度下熱失活速率常數(shù)，s-1；kB為玻爾茲曼常數(shù)。

1.2.5 pH對重組蛋清溶菌酶粗酶液活性的影響

同1.2.3蛋清溶菌酶活性測試方法，將酶活力測定反應體系中緩沖液替換為50 mmol/L的非離子型緩沖液，即pH 5.0的檸檬酸緩沖液、pH 6.0的MES緩沖液和pH 7.0～9.0的Tris-HCl緩沖液，以最高酶活力為100%，計算不同pH下重組蛋清溶菌酶的殘余酶活力。

1.2.6 二價金屬離子對重組蛋清溶菌酶粗酶液活性的影響

配制含有不同二價金屬離子(ZnCl2，CoCl2，NiCl2，MgCl2，CaCl2，CuCl2)的50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.0) 緩沖液，使金屬離子終濃度為分別為0.1、1、10 mmol/L。同1.2.3測試方法，以未添加金屬離子的體系作為對照(對應酶活力設為100%)，計算不同金屬離子存在條件下重組蛋清溶菌酶的活性。

1.2.7 鹽濃度對重組蛋清溶菌酶粗酶液活性的影響

配制含有25、50、75、100、150 mmol/L NaCl的50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.0)緩沖液，同1.2.3測試方法，以未添加NaCl的體系作為對照，以最高酶活力為100%，測試不同鹽濃度對重組蛋清溶菌酶活性的影響。

2 結果與分析

2.1 GS115-pPIC9K-EWLys重組菌株的構建及篩選

將蛋清溶菌酶的編碼基因按照畢赤酵母的密碼子偏好性進行密碼子優(yōu)化，通過Snab I和NotI酶切位點克隆至pPIC9K表達載體。將重組表達載體轉化至畢赤酵母菌株GS115，在缺少組氨酸的MD平板上進行篩選。重組質粒pPIC9K-EWLys為整合型質粒，目的基因與載體上攜帶的G418抗生素抗性基因共同整合至畢赤酵母基因組(圖1)。為提高目的基因的拷貝數(shù)，研究中逐漸提高G418抗生素的濃度，對重組菌株進行馴化，最終在16 mg/mL G418的質量濃度下獲得高拷貝轉化子。隨機挑取一個轉化子進行重組蛋清溶菌酶的誘導表達，發(fā)現(xiàn)誘導24 h后出現(xiàn)目標條帶，表明重組菌株構建成功(圖2)。重組蛋清溶菌酶的表達量隨誘導時間的延長而增加，在誘導72 h時達到最大。

圖1 蛋清溶菌酶編碼基因的基因組整合示意圖

圖2 重組畢赤酵母分泌表達蛋清溶菌酶的SDS-PAGE分析

為獲得產(chǎn)量較高的重組菌株，隨機挑取100個高拷貝轉化子進行試管發(fā)酵，誘導72 h后取發(fā)酵液上清測試重組蛋清溶菌酶的活性，如圖3所示。20號轉化子發(fā)酵產(chǎn)生的重組蛋清溶菌酶活性收率最高，達到665 U/mL，比未經(jīng)G418篩選的工程菌株提高3.02倍。選取該菌株進行后續(xù)測試。

圖3 高產(chǎn)蛋清溶菌酶的畢赤酵母轉化子篩選

2.2 重組蛋清溶菌酶粗酶液的生化特性測試

2.2.1 溫度對重組蛋清溶菌酶粗酶液活性的影響

天然蛋清溶菌酶具有較好的熱穩(wěn)定性，在30～60 ℃加熱30 min后能保持較高的穩(wěn)定性，在70 ℃加熱30 min仍可保留78%的酶活力，在80 ℃加熱30 min后，保留52%的酶活力[26]。為了解重組蛋清溶菌酶是否具有相近的性質，本研究將重組酶的粗酶液在不同溫度下加熱30 min，測定殘余酶活力。如圖4所示，重組蛋清溶菌酶在60 ℃以下加熱后酶活力略有升高，在70、80、90 ℃加熱30 min后可分別保留78%、68%、50%的活性，表明其熱穩(wěn)定性略優(yōu)于天然蛋清溶菌酶。

圖4 溫度對重組蛋清溶菌酶粗酶液活性的影響

為進一步系統(tǒng)解析重組蛋清溶菌酶的熱失活動力學特性，本研究在不同溫度對粗酶液加熱處理不同時間，測定殘余酶活力。如圖5所示，將重組蛋清溶菌酶在60 ℃加熱4 h后，其活性沒有明顯變化，而在70、80、90 ℃分別加熱240、160、100 min后，活性完全喪失。以這3個溫度下殘留酶活力的對數(shù)對加熱時間作圖，發(fā)現(xiàn)二者呈線性關系，如圖6所示，表明重組蛋清溶菌酶在相應溫度下的熱失活遵循一級反應動力學模型。以絕對溫度的倒數(shù)為橫坐標，以熱失活動力學反應常數(shù)的對數(shù)為縱坐標，發(fā)現(xiàn)二者呈線性相關，如圖7所示。根據(jù)圖6斜率計算其活化能，利用1.2.4公式計算熱失活過程的熱力學參數(shù)，結果如表1所示。蛋清溶菌酶的熱失活活化能為62.85 kJ/mol，活化吉布斯自由能約為110 kJ/mol，表明其熱穩(wěn)定性較強，不易在熱加工過程中完全喪失活性[27]。此外，其熱失活活化熵約為-144 J/(mol·K), 負值較大，說明其在熱失活過程中可能出現(xiàn)結構緊縮，導致活性中心折疊包埋。

a-60 ℃處理;b-70 ℃處理;c-80 ℃處理;d-90 ℃處理

圖6 重組蛋清溶菌酶粗酶液的熱失活動力學

圖7 重組蛋清溶菌酶粗酶液熱失活的Arrhenius圖譜

表1 重組蛋清溶菌酶粗酶液熱失活動力學參數(shù)

2.2.2 pH對重組蛋清溶菌酶粗酶液活性的影響

天然蛋清溶菌酶對鹽濃度較為敏感[26]。因此，在測定重組酶粗酶液活性隨pH值變化規(guī)律的過程中，為避免鹽濃度的影響，本研究選用一系列非離子型緩沖液。圖8表明重組蛋清溶菌酶在pH為6.0時活性最高；當pH為7～9時酶活力隨pH的上升而降低。天然溶菌酶在pH 5～8可保持85%以上的相對酶活力，且最適pH為6.0[26]。重組酶在pH 5～8可保持60%以上的相對酶活力，與天然酶相比，其pH穩(wěn)定性有所下降。

圖8 pH對重組蛋清溶菌酶粗酶液活性的影響

2.2.3 鹽濃度對重組蛋清溶菌酶粗酶液活性的影響

天然蛋清溶菌酶對鹽濃度較為敏感，通常150 mmol/L NaCl即可完全抑制酶活力[28]。為探究重組蛋清溶菌酶對鹽濃度的敏感性，本研究測試了NaCl濃度對重組粗酶液活性的影響，并進一步考察了這一影響是否具有pH依賴性。如圖9所示，在pH為6～9的非離子型緩沖液中，重組蛋清溶菌酶的活性隨NaCl濃度升高而降低，該性質與天然蛋清溶菌酶一致。此外，在pH為6和7時，150 mmol/L NaCl可抑制約80%的重組酶活性，而在pH為8和9時，75 mmol/L NaCl即可完全抑制重組酶的活性。這一結果表明，隨著pH的升高，重組蛋清溶菌酶對NaCl濃度更為敏感。

圖9 鹽濃度對重組蛋清溶菌酶粗酶液活性的影響

2.2.4 金屬離子對重組蛋清溶菌酶粗酶液活性的影響

對于天然蛋清溶菌酶，Ca2+(10 mmol/L)對酶活力有較強激活作用，Zn2+(10 mmol/L)有明顯抑制作用，Mg2+(10 mmol/L)對酶活力沒有明顯影響[28]。對于重組蛋清溶菌酶，Zn2+、Ca2+、Ni2+、Mg2+、Co2+、Cu2+在0.1～10 mmol/L對酶活力均呈現(xiàn)不同程度的抑制作用，且該作用與金屬離子濃度呈正相關，如圖10所示。在10 mmol/L濃度下，Zn2+使重組酶的活性下降了約35%，與文獻報道一致；然而，Ca2+和Mg2+使重組酶的活性分別下降了30%與50%，與文獻報道明顯不同。這一偏差可能由多方面原因導致。首先，本研究使用粗酶液進行測試，金屬離子可能與發(fā)酵液中的某些代謝物結合，影響重組蛋清溶菌酶的穩(wěn)定性；其次，重組蛋清溶菌酶與天然酶在結構上存在某些差別，使得重組酶更易與金屬離子結合，引起活性下降；第三，本研究所用酶濃度較低，在底物過量的情況下，酶活力的變化對反應速率及反應進行程度的影響較為明顯。

圖10 二價金屬離子對重組蛋清溶菌酶粗酶液活性的影響

3 結論與討論

本研究通過構建重組載體pPIC9K-EWLys，實現(xiàn)蛋清溶菌酶在畢赤酵母中的異源表達，并篩選出高產(chǎn)工程菌株。生化特性分析表明，重組蛋清溶菌酶粗酶液在90 ℃加熱30 min仍能保持50%活性，熱穩(wěn)定性較強，最適pH為6.0，在pH 5～9能夠保持60%以上的活性，且對鹽濃度和金屬離子敏感。這一結果表明，該重組蛋清溶菌酶可用于熱加工處理。此外，用作飼料或食品添加劑時，需注意鹽濃度和金屬離子的濃度，以保證較大抗菌活性。本研究為蛋清溶菌酶在畢赤酵母中的后續(xù)研究提供了理論指導。