馬英，馬麗娟，韓麗娟,*，黨斌，張文剛，鄭萬財

1(青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧，810016)2(青海省農(nóng)林科學(xué)院, 青海省青藏高原農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，青海 西寧，810016)

蠶豆(broad bean)也稱胡豆、羅漢豆等，是我國重要的經(jīng)濟作物之一，蠶豆中蛋白含量豐富，約占其干重的25%～30%，僅次于豆科植物中的大豆[1]。蠶豆蛋白中氨基酸組成與人體和動物所需比例類似，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白，而且有研究發(fā)現(xiàn)蠶豆蛋白賴氨酸含量比其他谷物類高出3倍[2]。蠶豆還具有一定的醫(yī)用價值，在健脾、降血脂和治療慢性腎炎等方面具有良好的效用[3]。此外，研究發(fā)現(xiàn)適量攝入蠶豆時，其含有的原花青素、植酸、凝集素等抗營養(yǎng)因子對人體具有抗氧化、預(yù)防肥胖、抗腫瘤等生理功能[4-5]。

微生物在食品中的應(yīng)用能夠使食品的口感和成分發(fā)生變化，將微生物發(fā)酵技術(shù)作用于大豆、米糠、麥麩等農(nóng)作物時，可以改善膳食纖維品質(zhì)，有效降解各種抗營養(yǎng)因子及有毒成分[6]。張莉麗等[7]利用植物乳桿菌發(fā)酵降解低溫豆粕乳，發(fā)現(xiàn)豆粕蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，功能特性也得到提高。LICANDRO等[8]提到在豆類產(chǎn)品中，利用乳酸菌發(fā)酵，可以抑制氨基酸脫羧微生物的發(fā)育，防止生物胺的積累，減少霉菌毒素的積累并抑制病原體的發(fā)展。劉慧菊等[9]在進行了單株菌種液體發(fā)酵蠶豆粉后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)微生物液體發(fā)酵后蠶豆的營養(yǎng)價值明顯提高。

近年來，隨著高寒地區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)的發(fā)展，蠶豆市場需求量不斷增大，但我國在蠶豆深加工方面起步較晚[10]，將微生物發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用到蠶豆中，或許可以提高蠶豆的綜合利用，開發(fā)具有創(chuàng)新意義的新產(chǎn)品。本實驗采用植物乳桿菌(ZR)、嗜熱鏈球菌(SL)和嗜酸乳桿菌(SS)對青海脫脂蠶豆粉進行液態(tài)發(fā)酵，由于單一菌種發(fā)酵時，發(fā)酵風味和香氣不夠濃郁，口感相對單一[11]，因此將這3種菌種分別進行兩兩復(fù)配及三菌復(fù)合作為發(fā)酵劑，發(fā)酵后對發(fā)酵液理化性質(zhì)、發(fā)酵前后脫脂蠶豆粉理化性質(zhì)與功能特性進行檢測對比，以期選出最優(yōu)復(fù)配菌種，從而獲得高營養(yǎng)價值的蠶豆蛋白質(zhì)及其他活性多肽，為蠶豆高活性多肽物質(zhì)及易消化性蛋白質(zhì)的制備奠定應(yīng)用基礎(chǔ)，也為青海省蠶豆農(nóng)產(chǎn)品的精深加工奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凍干蠶豆粉、新鮮蠶豆，采集于青海省大通縣；嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)凍干粉、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)凍干粉，中國工業(yè)微生物菌種保存中心；植物乳桿菌(LactobacillusPlantarum)凍干粉，中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保存中心；考馬斯藍G-250、福林酚試劑，北京索萊寶科技有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白、L-酪氨酸(純度99.0%)，上海吉至生化科技有限公司；乙醇、磷酸、NaOH、Na2CO3等均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C精密酸度計，上海佑科儀器儀表有限公司；UV-2600紫外分光光度計，島津企業(yè)管理有限公司；HZQ-X100振蕩培養(yǎng)箱，上海百典儀器設(shè)備有限公司；CP-500流變儀，廣州萊美科技有限公司；ALPHAL-2LDplus冷凍干燥機，北京陸德恒泰商貿(mào)有限公司；KC-130小型粉碎機，北京開創(chuàng)同和科技發(fā)展有限公司；LR10M大容量冷凍離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.3 試驗方法與設(shè)計

1.3.1 脫脂蠶豆粉的制備

精確稱取100 g干燥蠶豆粉于1 000 mL的錐形瓶中，按質(zhì)量比1∶5加入石油醚，40 ℃水浴條件下放置3 h后抽濾，室溫下晾至石油醚揮發(fā)完全，即得脫脂蠶豆粉。

1.3.2 液體培養(yǎng)基的制備

稱取4.83 g MRS肉湯培養(yǎng)基與100 mL蒸餾水混勻，在121 ℃下高壓蒸汽滅菌15 min，結(jié)束后冷卻至室溫備用。

1.3.3 復(fù)合菌種活化與擴大培養(yǎng)及發(fā)酵菌液制備

1.3.3.1 菌種活化

嗜酸乳桿菌(SS)、植物乳桿菌(ZR)、嗜熱鏈球菌(SL)兩兩復(fù)配及三菌復(fù)合，按同等比例加入到滅菌后的10 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，參考孫葳[12]的方法進行活化。

1.3.3.2 發(fā)酵菌液制備

將擴大培養(yǎng)的菌液按5%(體積分數(shù))接種量接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，在相應(yīng)最適條件下，按照測得的菌種生長對數(shù)期時間培養(yǎng)，制成發(fā)酵菌液。

1.3.4 脫脂蠶豆粉液態(tài)發(fā)酵

稱取20 g脫脂蠶豆粉于100 mL、65 ℃滅菌過的蒸餾水中，攪拌均勻，采用紫外燈照射30 min后，加入6 mL已培養(yǎng)好的發(fā)酵菌液，按表1所示條件進行48 h液態(tài)發(fā)酵后取樣，保存至冰箱[9]。

表1 復(fù)合菌種發(fā)酵條件

1.3.5 液態(tài)發(fā)酵前后脫脂蠶豆粉發(fā)酵液理化性質(zhì)的測定

蛋白酶活性測定：參照GB/T 28715—2012《飼料添加劑酸性、中性蛋白酶活力的測定 分光光度法》，采用福林酚法測定蛋白酶活性。

多肽含量測定：參考魯偉等[13]的方法，測定發(fā)酵液中多肽的含量。

1.3.6 液態(tài)發(fā)酵前后脫脂蠶豆粉理化性質(zhì)及功能特性的測定

可溶性蛋白質(zhì)含量測定：參考羅娟[14]和張永芳等[15]的方法，采用考馬斯亮藍進行測定。

蛋白提?。簠⒖既~婷[16]和AROGUNDADE等[17]的研究，采用堿溶酸沉法提取。

蛋白吸水量和吸油量的測定：參考付嘉陽等[18]的方法測定。

蛋白持水性與持油性的測定：參考孔慧廣[19]的方法測定，

蛋白起泡性與泡沫穩(wěn)定性的測定：參考付嘉陽等[18]的方法測定。

蛋白凝膠特性的測定：參考張蒙琪[20]和周旭霞等[21]的方法，利用質(zhì)構(gòu)分析儀測定凝膠彈性和凝膠硬度。

蛋白黏度的測定：將底物濃度為1%的大豆蛋白溶液用NDJ-8S型黏度計測定大豆蛋白的黏度[22]。

1.4 實驗數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳接種時間的確定

微生物在對數(shù)期代謝活力強，繁殖能力強，可作為發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)上的優(yōu)良種子，本實驗采用比濁法，分別對ZR+SL、ZR+SS、SS+SL以及ZR+SL+SS的復(fù)合菌的種子液進行了濃度測定，繪制生長曲線，找出各復(fù)合菌種的對數(shù)生長期末期，如圖1所示，ZR+SL、ZR+SS、SS+SL以及ZR+SL+SS的對數(shù)期分別為12～14 h、8～14 h、14～16 h、18～22 h，所以種子液接入脫脂蠶豆粉中的最佳培養(yǎng)時間為14、14、16、22 h，此時為各菌種發(fā)酵液最佳接種時間。

a-植物乳桿菌+嗜熱鏈球菌(ZR+SL)；b-植物乳桿菌+嗜酸乳桿菌(ZR+SS)；c-嗜酸乳桿菌+嗜熱鏈球菌(SS+SL)；d-植物乳桿菌+嗜熱鏈球菌+嗜酸乳桿菌(ZR+SL+SS)

2.2 不同復(fù)合菌種發(fā)酵前后脫脂蠶豆粉發(fā)酵液理化性質(zhì)的變化

2.2.1 蛋白酶活力的變化

不同復(fù)合菌種液態(tài)發(fā)酵脫脂蠶豆粉的過程中，其自身產(chǎn)生的蛋白酶會對脫脂蠶豆粉進行不同程度的分解。如表2所示，在相同發(fā)酵條件下，4種復(fù)合菌對脫脂蠶豆粉進行液態(tài)發(fā)酵后，其發(fā)酵液酶活力大小為ZR+SL+SS>ZR+SL>ZR+SS>SL+SS。其中，三菌聯(lián)合發(fā)酵后酶活力顯著高于其他3個組，而SL+SS復(fù)合發(fā)酵后酶活力顯著低于其他3個組(P<0.05)。

表2 不同復(fù)合菌種發(fā)酵后發(fā)酵液蛋白酶活力測定(n=3)

2.2.2 多肽含量的變化

由圖2可知，不同復(fù)合菌種對脫脂蠶豆粉進行液態(tài)發(fā)酵后發(fā)酵液多肽含量均有所提升(P<0.05)，其中ZR+SL+SS的復(fù)合菌及SL+SS的復(fù)合菌對脫脂蠶豆粉進行液態(tài)發(fā)酵后多肽含量顯著高于其他3個組，分別是30.19%、30.94%(P<0.05)，比未經(jīng)處理組提高了2倍多。表明微生物發(fā)酵能使蛋白質(zhì)降解分離產(chǎn)生多肽，與劉慧菊等[9]和吳勝華[22]的研究結(jié)論一致。菌種復(fù)合對于提高發(fā)酵液多肽含量效果顯著，可能是由于菌種之間的協(xié)同作用疊加，發(fā)酵過程產(chǎn)生的蛋白酶活力更高，更利于分解脫脂蠶豆蛋白，產(chǎn)生小分子活性多肽，同時由于試驗發(fā)酵條件有利于部分蠶豆蛋白轉(zhuǎn)換為菌體蛋白，也改善了蠶豆蛋白本身的營養(yǎng)品質(zhì)[13]。

圖2 不同復(fù)合菌種發(fā)酵前后多肽含量的變化(n=3)

2.3 不同復(fù)合菌種發(fā)酵前后脫脂蠶豆粉理化性質(zhì)及功能特性的變化

2.3.1 可溶性蛋白含量變化

如圖3所示，在相同發(fā)酵條件下，不同復(fù)合菌種發(fā)酵脫脂蠶豆粉后脫脂蠶豆粉中可溶性蛋白含量均存在顯著性差異(P<0.05)，其中ZR+SS的復(fù)合菌對脫脂蠶豆粉進行發(fā)酵后可溶性蛋白含最高，達到了98.86%，與未發(fā)酵的脫脂蠶豆粉相比增加了4.3倍。ZR+SL+SS的復(fù)合菌液態(tài)發(fā)酵脫脂蠶豆粉后，可溶性蛋白含量達到78.74%，相比于未發(fā)酵脫脂蠶豆粉的可溶性蛋白含量提高3.23倍(P<0.05)。由此可見，微生物發(fā)酵對脫脂蠶豆粉的可溶性蛋白含量的影響頗大。

圖3 不同復(fù)合菌種脫脂蠶豆粉中可溶性蛋白含量(n=3)

2.3.2 蛋白物理化學(xué)性能變化

由表3可知，經(jīng)不同復(fù)合菌種發(fā)酵后脫脂蠶豆蛋白吸水量及吸油量均顯著提高(P<0.05)，其中三菌聯(lián)合發(fā)酵脫脂蠶豆粉后，蛋白的吸水量顯著高于ZR+SL復(fù)合發(fā)酵組及未經(jīng)發(fā)酵組(P<0.05)；蛋白吸油量ZR+SL復(fù)合發(fā)酵組最高、其次是ZR+SS復(fù)合發(fā)酵組(P<0.05)。吸水量與吸油量增加可能是蛋白從緊密的球狀結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成了疏松隨機的線團結(jié)構(gòu)，暴露了較多基團，從而使其結(jié)合水及油的能力增加[23]，這表明微生物發(fā)酵對蛋白分子產(chǎn)生了影響。

表3 不同復(fù)合菌復(fù)合后蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

不同復(fù)合菌種發(fā)酵脫脂蠶豆粉后蛋白的持水性與未發(fā)酵脫脂蠶豆粉蛋白相比無顯著差異(P>0.05)，但SS+SL復(fù)合發(fā)酵后蛋白持水性顯著高與ZR+SL復(fù)合發(fā)酵組(P<0.05)。蛋白質(zhì)與水作用后會發(fā)生不同程度的溶解，溶解程度越大，蛋白質(zhì)顆粒復(fù)水后黏度越小，越不易形成蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)持水性下降；與未發(fā)酵脫脂蠶豆蛋白質(zhì)的持油性相比，經(jīng)ZR+SS的復(fù)合菌、SS+SL的復(fù)合菌及3種菌的復(fù)合菌發(fā)酵后蛋白質(zhì)的持油性均顯著降低(P<0.05)，原因可能是在發(fā)酵過程中，隨環(huán)境溫度升高時，油的流動性增強，蛋白變性，削弱了蛋白與油的相互作用[24]。

與未發(fā)酵脫脂蠶豆蛋白的起泡性與泡沫穩(wěn)定性相比，經(jīng)不同復(fù)合菌發(fā)酵脫脂蠶豆粉后蛋白的起泡性與泡沫穩(wěn)定性均顯著增加(P<0.05)，其中ZR+SS發(fā)酵脫脂蠶豆粉其蛋白質(zhì)起泡性最優(yōu)，達32.00%，泡沫穩(wěn)定性達13.33%，顯著高于另外3種復(fù)合菌發(fā)酵組(P<0.05)。表明ZR+SS的復(fù)合菌發(fā)酵有助于提高蛋白起泡性與泡沫穩(wěn)定性。

2.3.3 蛋白粉凝膠特性的結(jié)果分析

如表4所示，SS+SL的復(fù)合菌發(fā)酵脫脂蠶豆粉后，蛋白彈力顯著高于未發(fā)酵組和三菌聯(lián)合發(fā)酵組(P<0.05)。蛋白彈性與未發(fā)酵時相比均顯著降低，硬度與未發(fā)酵時相比均顯著上升(P<0.05)，其中ZR+SL的復(fù)合菌發(fā)酵的蠶豆蛋白硬度顯著高于其他4個組(P<0.05)。不同復(fù)合菌種發(fā)酵后蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，凝膠硬度增大，凝膠彈性降低，說明復(fù)合菌發(fā)酵使蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加牢固，分子間作用力增強[25]。

表4 不同復(fù)合菌復(fù)合后蛋白質(zhì)的凝膠特性

2.3.4 蛋白黏度的結(jié)果分析

由圖4可知，經(jīng)過不同復(fù)合菌種發(fā)酵后，在剪切力一定的條件下，不同復(fù)合菌發(fā)酵脫脂蠶豆粉蛋白溶液的黏度均不相同。除SL+SS的復(fù)合菌發(fā)酵后脫脂蠶豆粉蛋白溶液的黏度下降外，其他復(fù)合菌種發(fā)酵的脫脂蠶豆粉蛋白溶液蛋白的黏度均有所增加，在7 min時各蛋白溶液的黏度達到最大值。不同復(fù)合菌發(fā)酵后蠶豆蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致蠶豆蛋白黏度變化。微生物發(fā)酵會引起pH變化，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子電荷變化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)-水、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-離子相之間互作用發(fā)生變化，宏觀上表現(xiàn)為蛋白質(zhì)膠體溶液的黏度改變[26]。

圖4 不同復(fù)合菌發(fā)酵后蛋白質(zhì)黏度變化

3 結(jié)論

以ZR+SS、ZR+SL、SS+SL以及ZR+SL+SS的復(fù)合菌對脫脂蠶豆粉進行液態(tài)發(fā)酵后，其生物活性提高、營養(yǎng)價值明顯改善、理化性質(zhì)和功能特性均發(fā)生了改變。其中三菌復(fù)合發(fā)酵可以提高發(fā)酵液蛋白酶活力、多肽含量，改變蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)；ZR+SS復(fù)合發(fā)酵后可以提高脫脂蠶豆粉的可溶性蛋白含量，且蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性增強；ZR+SL復(fù)合發(fā)酵后脫脂蠶豆粉蛋白硬度明顯增強；SS+SL復(fù)合發(fā)酵后發(fā)酵液中多肽含量大幅度增加，蛋白黏度下降。綜合分析，在選擇復(fù)合菌種時，可以優(yōu)先選擇ZR+SS復(fù)配的發(fā)酵劑及3種菌的復(fù)合發(fā)酵劑。復(fù)合菌種液態(tài)發(fā)酵作為一種提高脫脂蠶豆粉營養(yǎng)價值與功能特性的有效手段，具有較好的發(fā)展前景。