吳昱萱，劉昌樹(shù)，劉建國(guó)，李可欣，劉大松*，周鵬

1(食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214122)2(佳格食品(中國(guó))有限公司，江蘇 蘇州，215000)

紫外線是導(dǎo)致皮膚老化的重要外源性因素，其中對(duì)人體皮膚造成損害的主要是UVA(320～400 nm)和UVB(290～320 nm)波段[1]。UVA和UVB誘導(dǎo)機(jī)體過(guò)度產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)是導(dǎo)致皮膚損傷的重要原因，ROS積累使得內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)受損，機(jī)體趨于氧化應(yīng)激狀態(tài)，進(jìn)一步刺激基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)上調(diào)， MMPs能降解大部分的細(xì)胞外基質(zhì)，如膠原蛋白、彈性蛋白[2]。另一方面，ROS在促炎信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)中充當(dāng)?shù)诙攀梗跈C(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，可刺激產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，加劇炎癥反應(yīng)[3-4]。機(jī)體最終表現(xiàn)出泛紅、干燥、缺乏彈性、皺紋加深等一系列皮膚損傷，嚴(yán)重影響人們的外表自信。隨著審美水平的不斷提高，預(yù)防和延緩紫外線導(dǎo)致的皮膚老化顯得十分必要。

氧化應(yīng)激能引發(fā)皮膚基質(zhì)的降解和炎癥因子的激增，最終導(dǎo)致皮膚老化。核因子紅細(xì)胞系-2相關(guān)因子2/抗氧化反應(yīng)元件(nuclear factor erythroid-2 related factor 2/ antioxidant response element，Nrf2/ARE) 信號(hào)通路是調(diào)節(jié)氧化還原平衡的重要途徑，可控制下游多種抗氧化酶的表達(dá)，從而清除ROS，中和過(guò)氧化產(chǎn)物，維持氧化還原穩(wěn)態(tài)，在保護(hù)皮膚免受紫外線誘導(dǎo)的氧化損傷方面發(fā)揮著重要的作用，因而以Nrf2/ARE信號(hào)通路為作用靶點(diǎn)的天然抗氧化劑是抗皮膚光老化的潛在原料[5-6]。

因此，本研究以石榴提取物、雨生紅球藻提取物、針葉櫻桃提取物、維生素E這4種常用的天然抗氧化劑為原料，以UVA+UVB紫外線造模的裸鼠為研究對(duì)象，比較不同抗氧化劑灌胃處理對(duì)皮膚抗氧化效果的影響，以期為具有皮膚改善效果產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅石榴濃縮粉(安石榴甙：33.2%，鞣花酸：1.1%)，西班牙Euromed公司；雨生紅球藻蝦青素微囊粉(蝦青素：2.4%)，大連醫(yī)諾生物股份有限公司；針葉櫻桃濃縮粉(維生素C：18%)，浙江天草生物制品有限公司；天然維生素E粉(混合生育酚濃縮物：30.96%)，陜西海斯夫生物工程有限公司；BALB/c Nude裸鼠(SPF級(jí)、7周齡、雄性)，維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒，南京建成生物研究所；ROS試劑盒，上海貝博生物科技有限公司；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)、蛋白質(zhì)羰基(protein carbonyl，PC)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、基質(zhì)金屬蛋白酶-1、9、12(matrix metalloproteinase-1、9、12，MMP-1、9、12)Elisa試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司；總蛋白試劑盒，美國(guó)Thermo Scientific公司；組織總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)、SYBR qPCR Master Mix試劑盒，南京諾唯贊生物科技有限公司；其他實(shí)驗(yàn)試劑均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UVA紫外燈管(波長(zhǎng)320～400 nm，峰值波長(zhǎng)340 nm)、UVB紫外燈管(波長(zhǎng)290～320 nm，峰值波長(zhǎng)313 nm)，荷蘭皇家飛利浦公司；UV-313/UV-340雙通道紫外輻照計(jì)，北京師大光電技術(shù)有限公司；皮膚彈性測(cè)試儀，德國(guó)Courage+Khazaka Electronic GmbH(CK)公司產(chǎn)品；CR-700 d色彩色差計(jì)，柯尼卡美能達(dá)(中國(guó))投資有限公司；Nanodrop One/OneC型分光光度計(jì)、Multiskan Sky型酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Scientific公司；ETC811型PCR擴(kuò)增儀，北京東勝生物科技有限公司產(chǎn)品；LightCycler96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，瑞士Roche公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組及處理

1.3.1.1 動(dòng)物分組

適應(yīng)性喂養(yǎng)1～2周后， 60只BALB/c Nude裸鼠隨機(jī)分為6組(n=10)：(1)空白組，灌胃等體積生理鹽水；(2)模型組，灌胃等體積生理鹽水；(3)石榴組，灌胃292 mg/kg bw紅石榴濃縮粉(即安石榴甙和鞣花酸為100 mg/kg bw)；(4)雨生紅球藻組，灌胃103 mg/kg bw雨生紅球藻蝦青素微囊粉(即蝦青素為2.5 mg/kg bw)；(5)針葉櫻桃組，灌胃556 mg/kg bw針葉櫻桃濃縮粉(即維生素C為100 mg/kg bw)；(6)針葉櫻桃+維生素E組，灌胃556 mg/kg bw針葉櫻桃濃縮粉和2.66 mg/kg bw天然維生素E粉(即維生素C為100 mg/kg bw，混合生育酚為0.82 mg/kg bw)。灌胃體積為10 mL/kg，灌胃樣品用生理鹽水現(xiàn)配現(xiàn)用。除正常組，其余均進(jìn)行UV暴露處理，在飼養(yǎng)期間記錄小鼠體重變化與健康狀態(tài)。

1.3.1.2 光老化模型建立

根據(jù)文獻(xiàn)與預(yù)實(shí)驗(yàn)確定[19]：兩支 UVA燈管和一支UVB燈管營(yíng)造紫外線環(huán)境。紫外燈開(kāi)啟穩(wěn)定30 min后利用紫外輻照計(jì)測(cè)定紫外線輻照強(qiáng)度。將小鼠放入5 cm×9 cm×4 cm的透明小盒子中，盒子頂部用1 cm×1 cm鐵絲網(wǎng)固定小鼠，燈距離小鼠背部距離為30 cm。每周照射3次，連續(xù)2周，每次輻照劑量為5 600 mJ/cm2，UVA、UVB輻照強(qiáng)度分別1.44、0.14 mW/cm2。本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理經(jīng)江南大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)認(rèn)可，審核編號(hào)為JN.No20210630b0800812[236]。

1.3.1.3 樣品采集

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，禁食不禁水12 h，異氟烷麻醉，摘眼球取血，3 500 r/min，4 ℃離心15 min，取上層血清保存于-80 ℃。取背部皮膚約0.1 g加入0.9 mL預(yù)冷的生理鹽水，利用快速研磨儀制成10%組織勻漿，3 000 r/min，4 ℃離心15 min，取上清液保存于-80 ℃。

1.3.2 指標(biāo)測(cè)定

1.3.2.1 小鼠脾臟指數(shù)測(cè)定

取脾臟用濾紙擦干稱重，根據(jù)公式(1)計(jì)算脾臟指數(shù)：

(1)

1.3.2.2 血清、皮膚氧化應(yīng)激和抗氧化酶指標(biāo)測(cè)定

血清、皮膚組織上清液ROS、MDA、PC、SOD、GHS-Px、CAT根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2.3 皮膚Nrf2/ARE信號(hào)通路相關(guān)基因RT-PCR測(cè)定

根據(jù)試劑盒提取皮膚總RNA，測(cè)定濃度和純度，對(duì)OD260nm/OD280nm=1.8～2.0的樣品調(diào)整到相同濃度后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用RT-PCR擴(kuò)增測(cè)定Nrf2、血紅素加氧酶-1 (heme oxygenase-1，HO-1)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸醌氧化還原酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphatequinone oxidoreductase1，NQO1)的相對(duì)表達(dá)。引物信息如表1所示。

表1 RT-PCR引物序列

1.3.2.4 皮膚膠原降解指標(biāo)測(cè)定

皮膚組織上清液MMP-1、9、12根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2.5 血清炎癥因子測(cè)定

血清IL-6、TNF-α根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2.6 皮膚表觀指標(biāo)測(cè)定

分別利用色差計(jì)和皮膚彈性測(cè)試儀測(cè)定小鼠同一部位背部皮膚的a*、總彈性、凈彈性。取約0.1 g背部皮膚根據(jù)GB 5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》測(cè)定皮膚水分。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 26.0軟件，運(yùn)用LSD和Tukey進(jìn)行組間方差分析，結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”來(lái)表示，P<0.05表示組間具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抗氧化劑對(duì)小鼠生長(zhǎng)指數(shù)的影響

由圖1可知，體重整體呈上升趨勢(shì)，其中石榴組體重下降，但該組飼養(yǎng)和解剖中也未發(fā)現(xiàn)其明顯異常，其體重下降原因可能與石榴提取物及其代謝產(chǎn)物具有降脂效果有關(guān)[20]。各組脾臟指數(shù)無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

a-體重；b-脾臟指數(shù)

2.2 不同抗氧化劑對(duì)小鼠氧化還原穩(wěn)態(tài)的影響

2.2.1 不同抗氧化劑對(duì)小鼠氧化應(yīng)激程度的影響

紫外線照射誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生過(guò)量的ROS攻擊細(xì)胞膜，生物大分子被破壞，大量的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)過(guò)氧化氧化產(chǎn)物積累，如MDA和蛋白質(zhì)羰基，由此加快皮膚結(jié)構(gòu)損傷[21]。如圖2所示，較空白組，紫外線照射導(dǎo)致模型組ROS、PC含量顯著增加，石榴顯著減少PC含量，針葉櫻桃顯著減少M(fèi)DA含量，雨生紅球藻顯著減少ROS和PC含量，而針葉櫻桃+維生素E能顯著減少三者的含量(P<0.05)。說(shuō)明石榴、雨生紅球藻、針葉櫻桃、針葉櫻桃+維生素E干預(yù)能夠降低紫外線照射導(dǎo)致的氧化損傷，其中針葉櫻桃+維生素E的效果較好，雨生紅球藻次之。前人研究已表明，攝入蝦青素[10]、維生素C[13]、維生素E[22]可降低體內(nèi)氧化應(yīng)激程度，進(jìn)而保護(hù)皮膚免受損傷，但僅對(duì)單一抗氧化劑進(jìn)行研究，未進(jìn)行多種抗氧化劑之間的體內(nèi)對(duì)比。

a-血清活性氧熒光強(qiáng)度；b-皮膚MDA含量；c-皮膚蛋白質(zhì)羰基含量

2.2.2 不同抗氧化劑對(duì)小鼠皮膚抗氧化酶的影響

內(nèi)源性抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)能夠抵消機(jī)體產(chǎn)生的ROS，維持氧化還原平衡，當(dāng)紫外線照射產(chǎn)生ROS超出內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)的調(diào)節(jié)能力時(shí)，動(dòng)態(tài)平衡被打破，進(jìn)而導(dǎo)致皮膚細(xì)胞氧化損傷，加劇皮膚光老化[3]。由圖3所示，較空白組，模型組GSH-Px、CAT顯著下調(diào)(P<0.05)，說(shuō)明紫外線照射消耗機(jī)體內(nèi)源性抗氧化酶；較模型組，雨生紅球藻顯著提高GSH-Px表達(dá)量，針葉櫻桃+維生素E可顯著提高GSH-Px、CAT表達(dá)量(P<0.05)，這與上述氧化應(yīng)激的結(jié)果相對(duì)應(yīng)。雨生紅球藻是天然蝦青素的理想來(lái)源，蝦青素由于其“極性-非極性-極性”的結(jié)構(gòu)特性，使其可以跨膜穿插在脂質(zhì)雙分子層中，兼具親水區(qū)和疏水區(qū)捕獲自由基的能力，使得少量的蝦青素即可達(dá)到較高劑量普通抗氧化劑的效果[23]。針葉櫻桃提取物富含維生素C，與維生素E在皮膚抗氧化方面是相互依賴的關(guān)系，維生素C是水溶性，存在于細(xì)胞質(zhì)，維生素E為脂溶性，存在于細(xì)胞膜，紫外線照射產(chǎn)生的自由基攻擊細(xì)胞膜，誘導(dǎo)過(guò)氧化連鎖反應(yīng)的發(fā)生，同時(shí)維生素E作為抗氧化劑轉(zhuǎn)變?yōu)榫S生素E自由基，后者被維生素C還原為維生素E，二者的協(xié)同再生作用可能是其效果優(yōu)于其他干預(yù)組的原因[14]。FUCHS等[15]也證實(shí)，維生素C和維生素E協(xié)同作用優(yōu)于單獨(dú)作用。提示親水和親脂互補(bǔ)可增強(qiáng)氧化應(yīng)激的改善效果。

a-皮膚超氧化物歧化酶表達(dá)量；b-皮膚谷胱甘肽過(guò)氧化物酶表達(dá)量；c-皮膚過(guò)氧化氫酶表達(dá)量

2.2.3 不同抗氧化劑對(duì)小鼠皮膚Nrf2/ARE信號(hào)通路的影響

Nrf2/ARE是維持氧化還原平衡的重要調(diào)控通路，在外界刺激下， Nrf2移位進(jìn)入細(xì)胞核，并結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件ARE，轉(zhuǎn)錄激活下游抗氧化酶，如NQO1、HO-1[24]。由圖4所示，較空白組，模型組NQO1相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)，較模型組，針葉櫻桃+維生素E、石榴分別顯著上調(diào)Nrf2、HO-1相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)。上述結(jié)果說(shuō)明各抗氧化劑可通過(guò)調(diào)節(jié)氧化還原通路中相關(guān)因子表達(dá)，來(lái)提高皮膚抗氧化效果和抑制氧化損傷，與LOHAKUL等[25]研究結(jié)果相似。

a-皮膚Nrf2的mRNA相對(duì)表達(dá)量；b-皮膚HO-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量；c-皮膚NQO1的mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.3 不同抗氧化劑對(duì)小鼠皮膚膠原降解代謝的影響

真皮中最為豐富的成分是膠原蛋白，膠原蛋白的類型以Ⅰ和Ⅲ型為主，膠原蛋白交織成膠原纖維平行于皮膚表面，賦予皮膚抗拉強(qiáng)度；微纖維成分包埋在彈性蛋白中形成彈性纖維，維持皮膚彈性[1]。當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)會(huì)激活一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，如絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路，誘導(dǎo)下游MMPs表達(dá)，將膠原、彈性蛋白大分子降解為片段化，失去抗拉和彈性結(jié)構(gòu)[2]。其中MMP-1、9是降解Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白的主要活性蛋白[2]；MMP-12除了能夠降解彈性蛋白，還能夠激活其他MMPs家族成員，加速細(xì)胞外基質(zhì)降解的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[1]。如圖5所示，較空白組，模型組MMP-1、9、12均顯著增加，較模型組，石榴、雨生紅球藻、針葉櫻桃、針葉櫻桃+維生素E可顯著減少M(fèi)MP-1、9或12(P<0.05)，說(shuō)明各抗氧化劑均可抑制MMPs表達(dá)，維持膠原蛋白和彈性蛋白穩(wěn)定性，延緩皮膚老化，其中針葉櫻桃+維生素E效果較好，這可能得益于其良好的抗氧化效果。不僅如此維生素C作為脯氨酸羥化酶、賴氨酰羥化酶的輔助因子，還能夠促進(jìn)膠原蛋白合成，這已得到JEONG等[26]的證實(shí)。

a-皮膚基質(zhì)金屬蛋白酶-1表達(dá)量；b-皮膚基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達(dá)量；c-皮膚基質(zhì)金屬蛋白酶-12表達(dá)量

2.4 不同抗氧化劑對(duì)小鼠機(jī)體炎癥的影響

ROS積累促使核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)活化，介導(dǎo)下游促炎細(xì)胞因子分泌，進(jìn)而刺激炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致皮膚泛紅，另外炎癥不僅會(huì)加劇ROS生成，而且又會(huì)促進(jìn)MMPs表達(dá)，加重皮膚損傷[4]。由圖6所示，較空白組，模型組IL-6、TNF-α含量顯著增加，雨生紅球藻顯著減少I(mǎi)L-6和TNF-α含量，針葉櫻桃+維生素E干預(yù)可顯著減少I(mǎi)L-6含量(P<0.05)，說(shuō)明雨生紅球藻和針葉櫻桃+維生素E可抑制促炎因子表達(dá)，改善皮膚炎癥。該結(jié)果與上述雨生紅球藻和針葉櫻桃+維生素E提高皮膚氧化還原穩(wěn)態(tài)以及抑制膠原降解的結(jié)果相一致。MELO等[4]也表明攝入含有酚類抗氧化成分的馬鞭草提取物可通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化-炎癥-膠原代謝三者關(guān)系，改善紫外照射導(dǎo)致的皮膚損傷。

a-IL-6含量；b-TNF-α含量

2.5 不同抗氧化劑對(duì)小鼠皮膚表型的影響

色差a*值代表紅綠值(紅色>0，綠色<0)，用以表征紫外照射導(dǎo)致的皮膚色差變化，過(guò)度暴露于紫外會(huì)導(dǎo)致皮膚泛紅，是皮膚炎癥的外在表現(xiàn)。由圖7可知，較空白組，模型組a*值顯著升高，較模型組，石榴、雨生紅球藻、針葉櫻桃、針葉櫻桃+維生素E顯著下調(diào)a*值(P<0.05)，直觀地反映了各抗氧化劑具有一定的皮膚炎癥改善效果。這與STAHL等[17]研究結(jié)果相似，即攝入抗氧化劑后可改善紫外照射導(dǎo)致的皮膚泛紅。除此之外，干燥、松弛也是常見(jiàn)的皮膚光老化問(wèn)題，表現(xiàn)為水分流失以及彈性下降，石榴干預(yù)使得水分顯著增加(P<0.05)，但皮膚彈性未見(jiàn)顯著性改善，可能是由于干預(yù)時(shí)間過(guò)短而未能體現(xiàn)在皮膚表型上。

a-皮膚色差a*值；b-皮膚水分含量；c-皮膚總彈性；d-皮膚凈彈性

3 結(jié)論

本研究利用UVA+UVB聯(lián)合紫外照射建立小鼠皮膚光老化模型，準(zhǔn)確真實(shí)地比較常見(jiàn)抗氧化劑對(duì)皮膚的改善效果。結(jié)果顯示，口服攝入抗氧化劑不僅具有上調(diào)抗氧化酶表達(dá)，減少氧化產(chǎn)物積累，平衡皮膚氧化還原調(diào)節(jié)的作用，其中雨生紅球藻和針葉櫻桃+維生素E效果較好。而且雨生紅球藻和針葉櫻桃+維生素E在抑制膠原、彈性蛋白降解相關(guān)酶和促炎因子的分泌上也表現(xiàn)出最優(yōu)性，并使皮膚泛紅程度下降。上述結(jié)果可為今后開(kāi)發(fā)護(hù)膚產(chǎn)品提供原料選擇，提升產(chǎn)品抗皮膚光老化效果，提高市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。

本文主要采用了單一天然抗氧化劑及其組合，進(jìn)行皮膚抗氧化效果的對(duì)比研究，在后續(xù)的研究中，可考慮復(fù)配其他皮膚功效成分，如活性多肽，探究在維持皮膚健康方面是否有協(xié)同功效。此外，各抗氧化劑經(jīng)體內(nèi)消化吸收后的產(chǎn)物及其護(hù)膚作用機(jī)理，還可進(jìn)一步研究。