王佳敏，胡美麗，李宇輝

1(石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子，832000)2(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，新疆 烏魯木齊，830091)3(新疆農(nóng)墾科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，新疆 石河子，832000)

本研究從新疆伊犁、哈密、塔城地區(qū)具有代表性奶酪樣品中分離出乳酸菌株并進(jìn)行篩選，分別測(cè)定乳酸菌菌懸液、細(xì)胞破碎液、發(fā)酵上清液的DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力、超氧陰離子清除能力、還原能力及金屬離子螯合能力，選出具有高抗氧化性的菌株，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)具有抗氧化特性的乳制品和發(fā)酵制品提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳酸菌：自新疆伊犁、哈密、塔城地區(qū)具有代表性奶酪樣品中分離純化出的161株活性乳酸菌株，均保藏于石河子大學(xué)食品學(xué)院畜產(chǎn)品加工與安全控制研究中心實(shí)驗(yàn)室。

培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基和MRS固體培養(yǎng)基均購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

試劑：三氯乙酸、過(guò)氧化氫、O-菲羅啉、硫酸亞鐵、DPPH、鐵氰化鉀、鄰苯三酚、氯化鐵、二乙三胺五乙酸，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；細(xì)菌DNA基因組抽提試劑盒，生工生物工程股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

22331型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf AG公司；T100TTMhermal 型PCR擴(kuò)增儀，HP1020型凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司；BYY-BC型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；DNP-3272型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SW-JV2D型雙人單面潔凈工作臺(tái)，蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株活化

將實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱保存的菌株取出，每株菌按2%的接種量接種至MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)18～24 h活化3代后備用。

1.3.2 抗氧化乳酸菌初篩

按照林祥娜等的方法[6]，挑取菌株單菌落接種于含15 mmol/L H2O2的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)2 h后，吸取150 μL菌液進(jìn)行涂布并計(jì)算活菌數(shù)。

1.3.3 抗氧化乳酸菌復(fù)篩

1.3.3.1 樣品制備

按高利娥[7]的方法分別制備菌株發(fā)酵上清液、菌懸液及細(xì)胞破碎液。

1.3.3.2 DPPH清除能力測(cè)定

取2 mL待測(cè)樣品，加入2 mL DPPH無(wú)水乙醇溶液(0.2 mmol/L)混勻，室溫避光反應(yīng)30 min，8 000×g離心10 min，于517 nm處測(cè)定吸光度值。DPPH自由基清除率計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：A0為等體積無(wú)水乙醇代替樣品組吸光度值；A1為實(shí)驗(yàn)組吸光度值；A2為等體積無(wú)水乙醇代替DPPH無(wú)水乙醇溶液吸光度值。

1.3.3.3 ·OH清除能力測(cè)定

根據(jù)劉珊春[8]的方法?！H清除率計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

式中：A1為等體積蒸餾水代替H2O2的吸光度值；A2為等體積樣品代替蒸餾水的吸光度值。

(3)

式中：A0為不含樣品和鄰苯三酚的吸光度值；A1為不含樣品、含鄰苯三酚的吸光度值；A2為含樣品、不含鄰苯三酚的吸光度值；A3為含樣品和鄰苯三酚的吸光度值。

1.3.3.5 還原力的測(cè)定

參考劉珊春[8]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3.6 亞鐵離子螯合能力測(cè)定

參考蔣琰潔[9]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3.7 菌株的人工胃腸液及膽鹽耐受性

根據(jù)云月英等[10]的方法，測(cè)定菌株對(duì)人工胃腸液耐受性。

根據(jù)張悅等[11]的方法，測(cè)定菌株對(duì)膽鹽耐受性并作改動(dòng)，將2%的菌液分別接種至含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%、0.2%、0.3%及0.5%牛膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，以未接種的培養(yǎng)基為對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)24 h后計(jì)算活菌數(shù)。

1.3.3.8 乳酸菌DNA提取、PCR擴(kuò)增及16S rDNA測(cè)序

用生工生物工程(上海)股份有限公司細(xì)菌DNA基因組抽提試劑盒，提取DNA。

依照李曉楠等[12]的反應(yīng)條件，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交 NCBI 進(jìn)行 BLAST 比對(duì)分析。

1.3.4 抗氧化乳酸菌培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.3.4.1 菌株最適培養(yǎng)時(shí)間的確定

將MRS液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)初始pH值為7.0，接種量2%，培養(yǎng)溫度37 ℃，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定的菌株生長(zhǎng)曲線結(jié)果將培養(yǎng)時(shí)間調(diào)整為18、20、24、28、30 h，測(cè)定乳酸菌活菌數(shù)。

1.3.4.2 菌株培養(yǎng)初始pH的確定

用1 mol/L HCl調(diào)整培養(yǎng)基，pH值分別調(diào)至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，接種量2%，培養(yǎng)溫度37 ℃，培養(yǎng)時(shí)間18 h(對(duì)數(shù)期)，計(jì)算活菌數(shù)。

1.3.4.3 菌株最適培養(yǎng)溫度的確定

將培養(yǎng)基pH調(diào)節(jié)為7.0，接種量2%，置于不同培養(yǎng)溫度27、32、37、42 ℃培養(yǎng)18 h，測(cè)定活菌數(shù)。

1.3.4.4 菌株最適接種量的確定

將培養(yǎng)基pH調(diào)節(jié)為7.0，以1%、2%、3%、4%、5%的接種量接種，培養(yǎng)溫度37 ℃，培養(yǎng)時(shí)間18 h，計(jì)算活菌數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，所得結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，使用SPSS 26.0軟件數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析，圖表的繪制用Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化乳酸菌的初篩

初篩結(jié)果如表1所示(菌落數(shù)<10的未列出)，161株乳酸菌中大部分菌株對(duì)H2O2耐受力較差，其中41株菌表現(xiàn)出活性，26株菌活性良好，說(shuō)明菌株對(duì)H2O2有耐受能力，氧化應(yīng)激狀態(tài)中可存活，具備進(jìn)一步試驗(yàn)的條件。

表1 菌株對(duì)H2O2耐受結(jié)果

2.2 抗氧化乳酸菌的復(fù)篩

2.2.1 乳酸菌的·OH清除能力

如圖1所示，41株乳酸菌的菌懸液、發(fā)酵上清液、細(xì)胞破碎液都對(duì)羥自由基有清除能力。發(fā)酵上清液組中S2-7的清除率最高(P<0.05)，為95.28%，T1-4、T1-2次之且無(wú)顯著差異；細(xì)胞破碎液組S4-14的清除能力最強(qiáng)(P<0.05)，為57.98%，菌株B7-4、F2-6幾乎無(wú)清除能力；菌懸液組S5-7、B2-1的清除能力最大(81.56%、81.07%)。菌株發(fā)酵上清液的清除能力較好，與張開(kāi)屏等[13]對(duì)乳酸菌清除羥自由基研究結(jié)果相似，說(shuō)明乳酸菌清除羥自由基的物質(zhì)可能來(lái)自胞內(nèi)，當(dāng)菌體存活時(shí)通過(guò)代謝作用釋放，進(jìn)而起到清除羥自由基的效果；而菌株之間的清除能力各不相同，可能因?yàn)椴煌晟汕宄杂苫幕钚晕镔|(zhì)的種類(lèi)或含量不同。

圖1 菌株對(duì)·OH的清除率

圖2 菌株對(duì)清除率

2.2.3 乳酸菌的還原能力

41株菌的還原能力差異較大，如圖3所示，S5-11發(fā)酵上清液展現(xiàn)出較好的還原能力，為95.48%，T1-4、B3-2次之；S4-14細(xì)胞破碎液的還原能力最高(67.62%，P<0.05)；菌懸液組B6-4的還原能力最高(92.75%，P<0.05)。發(fā)酵上清液組及菌懸液組高于細(xì)胞破碎液組，由此推測(cè)乳酸菌的還原能力與菌株表面活性物質(zhì)和胞外釋放物有關(guān)，細(xì)胞破碎液中的還原活性可能來(lái)自于菌體內(nèi)部的酶等。

圖3 菌株的還原能力

2.2.4 乳酸菌的亞鐵離子螯合能力

如圖4所示，B7-5發(fā)酵上清液的螯合能力最大(P<0.05)，為87.18%，S4-9、B3-2稍弱；B3-2細(xì)胞破碎液最高(58.54%，P<0.05)；菌懸液組S5-7、B3-3、S4-14的螯合能力最強(qiáng)且無(wú)明顯差異，為94.33%～95.85%。發(fā)酵上清液組與菌懸液組的螯合能力相差不大，細(xì)胞破碎液的螯合能力較弱，與黃煜等[15]類(lèi)似，可以看出乳酸菌的活性影響著金屬離子的螯合能力。

圖4 菌株對(duì)亞鐵離子的螯合能力

2.2.5 乳酸菌的DPPH自由基清除能力

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，去除發(fā)酵上清液、細(xì)胞破碎液、菌懸液三部分的抗氧化活性低于整組平均水平的菌株，以下實(shí)驗(yàn)選取綜合抗氧化活性較高的前15株進(jìn)行，分別是菌株B2-1、B3-2、B3-3、B5-8、E3-2、S2-7、S4-14、S4-4、S4-7、S4-9、S5-11、S5-6、S5-7、T1-4、T2-10。

DPPH自由基清除率與抗氧化能力呈正相關(guān)。如圖5所示，發(fā)酵上清液組清除能力最強(qiáng)的是菌株S2-7，為88.22%；菌懸液組最強(qiáng)是T1-4(74.95%)；細(xì)胞破碎液組清除能力最強(qiáng)的是菌株B3-2，為74.28%。在此實(shí)驗(yàn)中，菌株發(fā)酵上清液組清除能力82%～88%，菌懸液組清除率為31%～60%，具有顯著差異，細(xì)胞破碎液清除率為7%～74%，差異顯著，這可能說(shuō)明不同菌株之間抗氧化活性的胞內(nèi)分泌物迥異，影響其抗氧化能力。大多數(shù)菌株的發(fā)酵上清液顯示出更高的清除能力[16]，可能是乳酸菌產(chǎn)生的胞外多糖釋放到周?chē)h(huán)境中，提供的電子與DPPH自由基中和，達(dá)到猝滅的效果。

圖5 菌株對(duì)DPPH自由基的清除率

2.2.6 菌株的人工胃腸液耐受性

如圖6所示，菌株在模擬胃液中培養(yǎng)3 h后，8株菌的存活率在80%以上，其中B2-1、S4-9、T2-10的存活率最高，為96.26%～97.35%(P<0.05)，菌株T1-4的存活率最低，為23.08%。經(jīng)人工腸液處理后的菌株有8株存活率在80%以上，其中B2-1(98.79%，P<0.05)存活率最高，最低為菌株T1-4(37.89%)，高于夏海燕等[17]從酢辣椒中分離出的6株乳酸菌在人工腸液中的存活率。通過(guò)模擬胃腸液實(shí)驗(yàn)可知，12株菌株對(duì)胃腸液都有耐受性，4株菌的適應(yīng)能力較差，難以在胃腸液中長(zhǎng)時(shí)間生存，分別是菌株B3-3、S4-14、S5-11、T1-4。

圖6 乳酸菌人工胃腸液耐受率

2.2.7 菌株的膽鹽耐受性

乳酸菌的存活率與膽鹽濃度成反比，由圖7可知，膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%時(shí)，對(duì)菌株的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響，均表現(xiàn)出良好耐受性；膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%時(shí)，有7株存活率在90%以上；膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%時(shí)，有4株菌的存活率仍在90%以上，其中S4-9的存活率最高，為96.89%(P<0.05)；當(dāng)膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)，有4株菌的存活率在80%以上，分別是菌株S2-7、S4-7、S5-11、T1-4。王祎然等[18]分離出的6株乳酸菌在0.3%的膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)下處理3 h后的存活率在87.37%～92.65%。本實(shí)驗(yàn)的12株菌對(duì)膽鹽耐受性均較好，在低濃度膽鹽脅迫中保持較高的存活率，高質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.5%)脅迫中逐漸下降。結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)，挑選以下8株菌進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)：B2-1、B5-8、E3-2、S4-7、S4-9、S5-7、S5-11、T2-10。

圖7 乳酸菌的膽鹽耐受性

2.2.8 PCR擴(kuò)增及16S rDNA測(cè)序

將篩選出的8株菌經(jīng)16S rDNA測(cè)序，通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，結(jié)果如圖8所示，菌株S5-7、E3-2、B5-8、S4-7、S4-9、B2-1、T2-10為乳酸片球菌；S5-11為干酪乳桿菌。

2.3 抗氧化乳酸菌培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.3.1 菌株培養(yǎng)初始pH的確定

由表2可知，不同初始pH下菌株的生長(zhǎng)活性不同。在pH=7.0時(shí)，B2-1、S4-7、S4-9、S5-11長(zhǎng)勢(shì)較好，菌株E3-2、B5-8在pH=5.5～7.5活性變化不大，說(shuō)明它們具有良好的耐酸能力，菌株S5-7和T2-10在pH=6.5時(shí)長(zhǎng)勢(shì)好(P<0.05)。每菌株的適宜初始pH值有差異，在一定pH范圍內(nèi)能快速繁殖，這8株菌在pH為7.0左右時(shí)有大量生長(zhǎng)。

表2 不同初始pH活菌數(shù)

2.3.2 菌株的最適培養(yǎng)溫度

溫度對(duì)微生物的生長(zhǎng)繁殖具有顯著影響[19]，如圖9-a所示，在一定范圍內(nèi)，溫度與菌株活菌數(shù)呈正相關(guān)，在27 ℃時(shí)菌株顯示較低活性，當(dāng)溫度為37 ℃和42 ℃的生長(zhǎng)情況較好(P<0.05)。溫度不僅影響微生物的生長(zhǎng)發(fā)育繁殖，對(duì)其代謝產(chǎn)物的品質(zhì)與產(chǎn)量也有影響[20]，適宜的溫度培養(yǎng)對(duì)菌株生長(zhǎng)和功效的發(fā)揮具有重大意義。

2.3.3 菌株的最適培養(yǎng)時(shí)間

由圖9-b可知，8株菌分別在培養(yǎng)18、28、28、24、18、20、24、18 h時(shí)達(dá)到其最大活菌數(shù)(P<0.05)，多數(shù)菌株在18～24 h時(shí)差異不顯著，可能是因?yàn)樵诖藭r(shí)菌株處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期或穩(wěn)定前期，而此時(shí)的菌株在活力、耐受不良環(huán)境能力、代謝能力等的巔峰時(shí)期[21]，為最佳培養(yǎng)時(shí)間。

2.3.4 菌株的最適接種量

如圖9-c所示，所有菌株的活菌數(shù)都在接種量為2%～3%達(dá)到峰值(P<0.05)，當(dāng)接種量為4%～5%時(shí)，活菌數(shù)逐漸下降，可能是因?yàn)榻臃N量越大，越難達(dá)到菌株生長(zhǎng)的穩(wěn)定期[22]，不利于生長(zhǎng)，即在接種量為2%～3%時(shí)可以達(dá)到最大利用率。

a-培養(yǎng)溫度；b-培養(yǎng)時(shí)間；c-接種量

綜上所述，培養(yǎng)條件優(yōu)選結(jié)果如表3所示。

表3 培養(yǎng)條件優(yōu)選結(jié)果

3 結(jié)論

從161株乳酸菌中篩選出了41株能耐受H2O2溶液的菌株，對(duì)其進(jìn)行了多種自由基清除能力的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)菌株與菌株之間抗氧化性有所區(qū)別，菌株各個(gè)部分的抗氧化性也不相同，表明乳酸菌對(duì)于不同自由基的清除部位不同。綜合來(lái)看菌株各部分抗氧化性由強(qiáng)到弱依次為發(fā)酵上清液，菌懸液，細(xì)胞破碎液。再通過(guò)測(cè)試人工胃腸液與膽鹽耐受性，最終篩選出8株乳酸菌，16S rDNA鑒定分別是乳酸片球菌7株：S5-7、E3-2、B5-8、S4-7、S4-9、B2-1、T2-10；干酪乳桿菌1株：S5-11。對(duì)其培養(yǎng)條件優(yōu)化，得到最佳條件培養(yǎng)基初始pH為6.5～7.5、培養(yǎng)時(shí)間在18 ～28 h、培養(yǎng)溫度為37 ℃～42 ℃、接種量為2%～3%。這8株抗氧化乳酸菌可為今后開(kāi)發(fā)具有抗氧化特性的食品奠定基礎(chǔ)。