易婉莎，羅 來，許金森，潘曉華△

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院，福建福州 350108；2.福建省中醫(yī)藥科學(xué)院，福建福州 350003；3.福建省經(jīng)絡(luò)感傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350003）

腦卒中，又稱中風(fēng)，是全球高致殘率和高致死率的代表性疾病，由大腦中動脈或其分支的血管栓塞引起，其中缺血性腦卒中占絕大比例。我國卒中發(fā)病風(fēng)險居全球首位，約40%的發(fā)病風(fēng)險率意味著每5 人中2 人有罹患腦卒中風(fēng)險[1]。2020 年，我國40 歲以上人群患腦卒中人數(shù)已達(dá)1780 萬，死亡患者約為230 萬，且相關(guān)數(shù)據(jù)呈上升趨勢[2]。伴隨老齡化社會的到來，我國腦卒中患病率并未得到緩解，腦卒中給患者及其家庭帶來的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)、疾病負(fù)擔(dān)仍在持續(xù)增加，對其展開相關(guān)研究已迫在眉睫。MCAO 模型是最接近人類缺血性中風(fēng)模型，缺血再灌注是制備模型的重要步驟，再灌注時間少至15min[3]，多至24h[4]，未見統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。不同缺血再灌注時間對MCAO 大鼠術(shù)后狀況是否產(chǎn)生不同影響，是制備MCAO 模型的重要考慮的因素。目前最常用缺血再灌注時間是1h、1.5h、2h[5]，三個時間點(diǎn)有一定間隔，如能確定最佳缺血再灌注時間將提高M(jìn)CAO 模型制備效率。本研究分別以1h、1.5h、2h 為缺血再灌注時間制備MCAO 模型大鼠，通過對比各組大鼠的術(shù)后狀況，尋找最適宜的缺血再灌注時間點(diǎn)，為MCAO模型制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF 級雄性SD 大鼠36 只，體重為（280±20）g，購自杭州醫(yī)學(xué)院，飼養(yǎng)于福建省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心［許可證號：SCXK（浙）2019-0002；合格證編號：20211015Aazz0100000132］。飼養(yǎng)條件：溫度（22±2）℃，濕度（55±15）%，12 h 明暗交替，自由進(jìn)食飲水。飼養(yǎng)一周后隨機(jī)分為3 組，每組12 只，擬制備缺血再灌注1 h、1.5 h、2 h MCAO模型大鼠，每組最終納入實(shí)驗(yàn)數(shù)量以造模成功只數(shù)為準(zhǔn)。

1.1.2 主要儀器與試劑 小動物呼吸麻醉系統(tǒng)（深圳瑞沃德生命科技公司，R407)、L3800號大鼠用MCAO線栓（廣州佳靈生物技術(shù)有限公司）、自制平衡木、2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC，美國Sigma）、PBS 緩沖液（北京索萊寶公司）、通用型組織固定液（武漢塞維爾生物科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物模型制作與分組 本實(shí)驗(yàn)使用線栓法制備MCAO 模型[6]，①麻醉：使用小動物呼吸麻醉系統(tǒng)進(jìn)行吸入式短效全身麻醉，經(jīng)5%濃度異氟烷誘導(dǎo)3～5 min后進(jìn)入麻醉昏迷，將其置于手術(shù)臺上固定，濃度降至1.5%～2%維持麻醉。②分離動脈：剔除大鼠頸部毛發(fā)，消毒，剪開，鈍器分離其頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈。③插栓：自頸外動脈進(jìn)栓，后轉(zhuǎn)至頸內(nèi)動脈，向左上45°緩緩插入，阻塞大腦中動脈分叉，感覺手下有阻塞感后停止。④縫合：進(jìn)行切口縫合，停止麻醉，將大鼠放回籠中，注意保溫，等待拔栓（模擬臨床中風(fēng)后自發(fā)再灌注現(xiàn)象）。⑤拔栓：各小組分別于切口縫合后1 h、1.5 h、2 h 進(jìn)行麻醉，拔栓時緩慢輕柔，將線栓包被部分退至頸動脈分叉處，剪去多余線栓，隨后放回籠中等待蘇醒。

1.2.2 平衡木實(shí)驗(yàn) 將大鼠置于一根長30 cm，寬1.5 cm，平放在距離地面高30 cm 處的木條上，觀察其穩(wěn)定性及四肢狀況進(jìn)行評分，得分為0～6分，見表1。分?jǐn)?shù)越高，神經(jīng)損傷越嚴(yán)重。將36 只大鼠進(jìn)行為期一周的術(shù)前適應(yīng)訓(xùn)練，早晚各一次。造模后，將再灌注2 h 組、1.5 h 組、1 h 組大鼠分別于術(shù)后第1、3、7 天進(jìn)行平衡木實(shí)驗(yàn)。

表1 平衡木得分表

1.2.3 Longa 五分法 待大鼠拔栓蘇醒后采用改良Longa五分法神經(jīng)功能評分判定造模成功與否，見表2。剔除0 分、4 分，1～3 分即為造模成功。再于大鼠造模后第1、7天進(jìn)行神經(jīng)功能評分。

表2 Longa五分法

1.2.4 造模成功率 比較三組大鼠造模成功情況，造模成功率=造模成功只數(shù)/總只數(shù)×100%。

1.2.5 體質(zhì)量 造模成功后，記錄大鼠術(shù)后第1、7天體質(zhì)量。

1.2.6 TTC染色 造模7天后將大鼠處死，取其大腦置于-20 ℃冰箱冷凍2 h，后將腦組織置于切片模具中，由額部至枕部做冠狀面切片，每片厚度約2 mm，取6片放入2%的TTC 溶液中，再放入37 ℃溫箱避光染色，30 min 之后去除TTC 溶液，加入通用型組織固定液固定，24 h 后用相機(jī)拍照。使用Image.Pro Plus 6軟件進(jìn)行梗死體積計(jì)算，計(jì)算公式為：梗死體積率=梗死體積/（梗死體積+未梗死體積）×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 27.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組內(nèi)比較依據(jù)正態(tài)性檢驗(yàn)結(jié)果，采用配對樣本t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)；組間比較采用單因素方差分析，方差齊性采用Least Sig Difference 方法，方差不齊采用Dunnett′s T3方法，不符合正態(tài)性則采用多樣本秩和檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模成功率比較 大鼠造模蘇醒后采用Longa 五分法進(jìn)行神經(jīng)功能評分，評分標(biāo)準(zhǔn)見表2，1～3分表示造模成功，0、4分予以剔除。三組大鼠造模成功率差別不大，其中1 h 組出現(xiàn)Longa 評分為0 分大鼠2 只，1.5 h 組、2 h 組出現(xiàn)Longa 評分為4 分大鼠各三只。最終各組大鼠只數(shù)為：缺血再灌注1 h 組（n=10）、再灌注1.5 h組（n=9）、再灌注2 h組（n=9），1 h組造模成功率高于其他兩組，但無明顯差別，見表3。

表3 大鼠造模成功率

2.2 體質(zhì)量 與第1 天相比，3 組大鼠體質(zhì)量在第7 天均有所下降。其中，1.5 h 組與2 h 組大鼠第7 天體質(zhì)量與第1天體質(zhì)量相比差異顯著（P＜0.05），見表4。

表4 大鼠體質(zhì)量情況表（g，）

表4 大鼠體質(zhì)量情況表（g，）

注：與同組第1天相比較，①P＜0.05

2.3 神經(jīng)功能評分 采用Longa 五分法于造模成功后第1、7天對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分。第1天神經(jīng)功能評分中3 組大鼠無明顯差異，第7 天1.5 h 組、2 h組神經(jīng)功能評分顯著高于1 h 組（P＜0.05）；與第1 天相比，1.5 h 組、2 h 組大鼠第7 天神經(jīng)功能評分增高明顯（P＜0.05），1 h 組大鼠神經(jīng)功能評分前后無明顯差異，見表5。

表5 各組大鼠Longa 評分情況表（分，）

表5 各組大鼠Longa 評分情況表（分，）

注：與第1天比較，①P＜0.05；與1h組比較，②P＜0.05

2.4 平衡木實(shí)驗(yàn)評分3 組大鼠在術(shù)后第1 天平衡木評分無明顯差異（P＞0.05）；1.5 h組、2 h組大鼠在術(shù)后第3、7天平衡木評分高于1 h組（P＜0.05）；1.5 h組、2 h組大鼠在術(shù)后第3、7天平衡木評分與同組第1天相比無明顯差異；1 h 組大鼠在術(shù)后第7 天平衡木評分較第1天降低（P＜0.05），見表6。

表6 各組大鼠平衡木評分情況表（分，）

表6 各組大鼠平衡木評分情況表（分，）

注：與同組第1 天比較，①P＜0.05；與1h 組同一天比較，②P＜0.05

2.5 TTC 染色 如圖為每組大鼠隨機(jī)抽取1 只，每只6片相同腦組織切片的腦組織梗死對比圖，經(jīng)TTC 染色后3 組大鼠均可見不同體積的灰白色梗死灶，1 h組梗死灶多出現(xiàn)在皮質(zhì)區(qū)，1.5 h組和2 h組在皮質(zhì)區(qū)及基底核區(qū)均可見梗死灶，見圖1；三組大鼠梗死體積隨著時間的延長而增大；1.5 h 組、2 h 組大鼠梗死體積明顯大于1 h組（P＜0.05），見表7。

圖1 各組大鼠腦梗死對比圖

表7 各組大鼠腦梗死體積率情況表（率，）

表7 各組大鼠腦梗死體積率情況表（率，）

注：與第1 h組比較，①P＜0.05

3 討論

缺血性腦卒中占腦卒中絕大比例，是一種急性和嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，可導(dǎo)致嚴(yán)重殘疾和死亡[7]。大腦缺血缺氧后一段時間血管再通引起更大程度的損傷，稱為腦缺血再灌注損傷。缺血性腦卒中病理機(jī)制十分復(fù)雜，包括基因表達(dá)變化、氧化應(yīng)激、離子失衡、炎癥反應(yīng)、血腦屏障功能障礙、線粒體功能障礙等多種病理過程，最終造成腦損傷和神經(jīng)功能障礙[8]。臨床表現(xiàn)為肢體麻木、共濟(jì)失調(diào)、吞咽困難，甚至?xí)幸庾R障礙、偏癱、失語、昏迷等癥狀。在臨床中還有一個不可忽視的現(xiàn)象，就是13%～43%中風(fēng)患者會發(fā)生自發(fā)性再灌注，給患者帶來更大損傷[9]。在動物實(shí)驗(yàn)方面，MCAO 模型是目前運(yùn)用最為廣泛的缺血性腦卒中模型，線栓法屬最常用制備方法，MCAO 線栓制備模型通過阻塞大腦中動脈造成腦梗死，并通過拔栓造成缺血再灌注損傷，最大程度模擬缺血性中風(fēng)患病過程。該模型導(dǎo)致大量梗死組織及功能障礙，有助于腦卒中的研究，如血腦屏障破壞、缺血的炎癥反應(yīng)、康復(fù)治療等研究。但缺血再灌注時間的選擇在現(xiàn)有研究中未見統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。如果不同缺血再灌注時間對MCAO 術(shù)后狀況產(chǎn)生一定影響，缺血再灌注時間的選擇將成為模型制備的又一考慮因素。

既往研究表明[10]，根據(jù)缺血時間不同，大鼠的梗死區(qū)域涉及紋狀體、上覆的額頂葉和顳葉皮質(zhì)，以及部分枕葉皮質(zhì)，也會導(dǎo)致丘腦和下丘腦的梗死。早在2000 年，Zhang[11]等制造缺血30 min 和120 min MCAO 模型，分別誘導(dǎo)出輕癥(基底核區(qū))和重癥(皮質(zhì)加基底核區(qū))的梗死，發(fā)現(xiàn)缺血面積可能和缺血時間有關(guān)。譚杰[12]等用MCAO 法制作缺血100min MCAO 模型，術(shù)后經(jīng)MRI掃描也表現(xiàn)出皮質(zhì)下基底核區(qū)梗死和皮質(zhì)梗死兩種類型。梗死體積會根據(jù)缺血時間不同而產(chǎn)生差別，梗死體積與缺血時間呈正相關(guān)是多數(shù)研究中的趨勢[13]，但也有研究表明[14]，缺血時間超過1 h 對腦梗死體積影響無顯著差異。本次實(shí)驗(yàn)中，3組大鼠腦梗死體積隨著時間的的延長逐漸增加，缺血1 h后差異不明顯；1.5 h組和2 h組大鼠梗死體積較大，梗死區(qū)域較廣，1 h 組大鼠梗死體積較小，可能只涉及皮質(zhì)梗死。

Longa 評分以0～5 分評價神經(jīng)功能缺損狀況，得分越高神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。在模型評判中，1 h 組2 只大鼠以無神經(jīng)功能缺損剔除，1.5 h 組、2 h 組各3只皆以神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重剔除，提示1 h組大鼠整體神經(jīng)功能缺損較輕。造模后第1 天，各組大鼠神經(jīng)功能評分無明顯差異；第7 天，1.5 h、2 h 組大鼠神經(jīng)功能評分顯著上升，且明顯高于1 h 組，1 h 組評分無上升趨勢，甚至評分下降，可能是1 h 組大鼠神經(jīng)功能缺損較輕，不足以引起神經(jīng)纖維損傷。

體質(zhì)量是大鼠一般情況的重要指標(biāo)，體質(zhì)量變化能反映MCAO 大鼠的健康狀況，腦缺血、手術(shù)過程都有可能造成大鼠體重下降，但主要因?yàn)榇笫笮g(shù)后受損嚴(yán)重，自發(fā)性進(jìn)食減少。譚杰[12]等發(fā)現(xiàn)MCAO 后2 周內(nèi)皮質(zhì)梗死組大鼠的相對體質(zhì)量明顯小于皮質(zhì)下梗死組大鼠，體質(zhì)量下降的程度與腦缺血的嚴(yán)重程度有關(guān)。1 h組大鼠7天內(nèi)體質(zhì)量下降不明顯，1.5 h 組與2 h 組大鼠均出現(xiàn)顯著下降，原因可能為1 h 組大鼠受損較輕，MCAO 后已恢復(fù)，而1.5 h組、2 h 組大鼠缺血時間較長，腦組織受損嚴(yán)重，可能累及攝食中樞[15]。同樣的現(xiàn)象也出現(xiàn)在平衡木評分中，平衡木功能評分能反應(yīng)大鼠的運(yùn)動功能及肢體協(xié)調(diào)能力[16]，1h 組大鼠平衡木功能評分在術(shù)后呈現(xiàn)下降趨勢，提示運(yùn)動功能、四肢協(xié)調(diào)能力得到改善；1.5 h組、2 h組術(shù)后平衡木功能評分差異不明顯，提示運(yùn)動功能、四肢協(xié)調(diào)能力恢復(fù)狀況不佳。

婁惠娟[17]等利用光化學(xué)法和線栓法制備局灶性腦梗死大鼠模型，分析不同造模方法所致實(shí)驗(yàn)動物梗死體積與行為學(xué)之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)線栓法制備MCAO 模型梗死體積大小與行為學(xué)結(jié)果密切相關(guān)。譚杰[18]、張乾[19]等發(fā)現(xiàn)線栓法制備MCAO 模型會出現(xiàn)皮質(zhì)下梗死與皮質(zhì)梗死兩種類型，大鼠行為學(xué)結(jié)果與梗死類型相關(guān)，皮質(zhì)梗死與皮質(zhì)下梗死大鼠相比體質(zhì)量輕、行為學(xué)結(jié)果差。大鼠梗死體積與不同梗死類型均受缺血時間的影響。由此可知，不同缺血再灌注時間對大鼠術(shù)后狀況存在一定影響。1 h組大鼠缺血時間短，梗死程度輕，存在一定自愈性，不適用于長期實(shí)驗(yàn)及康復(fù)治療等研究；1.5 h、2 h 組大鼠術(shù)后各數(shù)據(jù)相似，梗死程度較重，可引起大鼠神經(jīng)功能與運(yùn)動功能障礙，且一周內(nèi)無修復(fù)現(xiàn)象，更加適用于腦卒中各項(xiàng)研究。

綜上所述，本研究通過觀察1 h、1.5 h、2 h 缺血再灌注大鼠在術(shù)后7 天腦梗死體積、體質(zhì)量、神經(jīng)功能、平衡功能等狀況發(fā)現(xiàn)1.5 h 組與2 h 組大鼠腦損傷程度較1 h 組高，符合MCAO 模型制備要求，1.5 h與2 h 更適合作為線栓法制備MCAO 模型的再灌注時間點(diǎn)。