李 娟，張 昱

（河北旅游職業(yè)學(xué)院，河北 承德 067000）

蒲公英（Taraxacum mongolicun）又名婆婆丁，其適應(yīng)性強(qiáng)，分布廣泛，在河北北部地區(qū)隨處可見(jiàn)，已被國(guó)家衛(wèi)生部列為藥食兩用品種。近年研究表明，蒲公英含有多種有效活性物質(zhì)，如黃酮類、萜類、酚酸類等，具有清除自由基、抗炎抑菌等功效[1-3]，既是具有悠久食用歷史的野菜，也是具有良好功效的中藥材。黃酮是蒲公英的重要活性成分之一，現(xiàn)已確定在蒲公英中含有20多種黃酮類化合物[4-5]，其中蘆丁、槲皮素、木犀草素三種黃酮類化合物研究較多[6-7]。本文以河北北部地區(qū)的蒲公英為主要試樣，對(duì)超聲法提取蒲公英總黃酮的工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，為蒲公英中黃酮物質(zhì)的提取提供理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試蒲公英（Taraxacum mongolicun）于2021年4月采集于河北承德白草洼森林公園。采集后去除不可食老殘葉和根后，立即于60~70℃下完全烘干，粉碎至40目以下供黃酮類化合物的提取測(cè)定。

試劑為標(biāo)準(zhǔn)品蘆?。?00mg/支）、槲皮素（100mg/支）、木犀草苷（20mg/支），色譜級(jí)甲醇、乙腈，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，超純水（自制）。

儀器為北京瑞利SY-4000型高壓液相色譜儀，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)UV-1600，超聲波清洗器SB-5200D，循環(huán)水式多用真空泵，超純水機(jī)和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.2 ?總黃酮提取方法的篩選

設(shè)計(jì)單因素篩選試驗(yàn)。選取提取溶劑、提取方法、提取溫度、液料比、提取時(shí)間和提取次數(shù)等6個(gè)因素進(jìn)行設(shè)計(jì)，選出單因素最佳提取條件。同一批次的蒲公英干粉準(zhǔn)確稱取0.1g，置于150ml具塞三角瓶中。加適量提取劑，用水浴熱回流法或超聲法提取總黃酮，提取液過(guò)濾，用提取溶劑沖洗殘?jiān)盀V紙，合并濾液，濃縮后用提取溶劑定容，按照分光光度法（NY/T1295-2007）測(cè)定總黃酮，計(jì)算提取率。

提取率=單位質(zhì)量樣品提取測(cè)得的黃酮含量/最佳提取條件下單位質(zhì)量樣品黃酮的測(cè)定值。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=0.104X-0.0004，R2=0.9933

待測(cè)液中總黃酮含量（以蘆丁的質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)%）=C×V×D/（M×1000）

C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出的待測(cè)試液的總黃酮濃度的數(shù)值，單位為毫克每毫升（mg/ml）；V為待測(cè)試液的體積，單位為毫升（ml），為50 ml；D為試料的總稀釋倍數(shù)，取值為10；M為試料的質(zhì)量，單位為克（g）；

選取相關(guān)度高的因素繼續(xù)設(shè)計(jì)L9（33）正交試驗(yàn)，確定最優(yōu)提取組合。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?不同溶劑對(duì)蒲公英總黃酮提取效果的比較

在70℃、超聲頻率50Hz、料液比1：30條件下，分別使用不同濃度的甲醇、乙醇、丙酮為提取溶劑，對(duì)相同質(zhì)量的蒲公英干樣一次提取30min，然后測(cè)定黃酮提取率。結(jié)果顯示：隨著溶劑濃度的增大，3種溶劑的提取率也在提升；在相同濃度、相同時(shí)間下乙醇的提取率最高，丙酮和甲醇較低，兩者差異不大；乙醇濃度達(dá)到80%以后，繼續(xù)提升濃度，提取率變化不明顯。因此用80%乙醇作為蒲公英黃酮提取溶劑較為合適。

2.2 ?不同提取溫度和提取方法效果比較

以80%乙醇作為提取液，分別在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，料液比1：30條件下，對(duì)相同質(zhì)量的蒲公英干樣分別以回流法和超聲法（超聲頻率50 Hz），進(jìn)行30min的提取。結(jié)果顯示：在不同溫度下兩種方法提取率的變化趨勢(shì)相同，而超聲法提取率均大于回流法。因此提取蒲公英黃酮以超聲法為宜。兩種方法中提取溫度在50~60℃時(shí)，黃酮提取率均較高。

2.3 ?不同超聲頻率提取效果比較

稱取相同質(zhì)量的蒲公英干樣，按照液料比 （g：ml）1：30加入80%乙醇，在60℃下分別以超聲頻率30Hz、40Hz、50Hz、60Hz、70Hz和80Hz提取30min后測(cè)定黃酮含量。結(jié)果顯示：在超聲頻率60Hz下，黃酮得率最高，為2.77mg/g。因此超聲提取黃酮選擇60Hz最為合適。

2.4 ?不同液料比提取效果比較

稱取相同質(zhì)量的蒲公英干樣，分別按照液料比（g：ml）1：10、1：15、1：20、1：25、1：30加入80%乙醇，在60℃、超聲頻率60Hz下提取30 min后測(cè)定黃酮含量。結(jié)果顯示：料液比從1：10提升到1：15時(shí)，黃酮提取率從6.73mg/g提升到8.87mg/g，變化明顯；料液比大于1：20后黃酮得率曲線趨于平緩。差異顯著性分析得出，后3組料液比處理間差異不顯著，從節(jié)省提取溶劑考慮，選擇料液比1：15到1：20為宜。

2.5 ?不同提取時(shí)間提取效果比較

以40ml80%乙醇作為提取液，在60℃、超聲頻率60Hz下對(duì)相同質(zhì)量的蒲公英干樣分別提取15min、30min、45min、60min、75min后測(cè)定黃酮含量。結(jié)果顯示：提取時(shí)間超過(guò)45min后，黃酮得率幾乎不再上升。差異顯著性分析得出，水平3、4、5差異不顯著。從提高提取效率考慮，提取總時(shí)間控制在30~45min為宜。

2.6 ?不同提取次數(shù)的提取效果比較

以40ml80%乙醇作為提取液，對(duì)相同質(zhì)量的蒲公英干樣在60℃、超聲頻率60Hz下分別超聲提取1次、 2次、3次、4次，每次提取15min，合并提取液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮后定容到40 ml上機(jī)檢測(cè)黃酮含量。結(jié)果顯示：提取4次僅比提取三次黃酮得率多0.01mg/g。差異顯著性分析得出，提取3次或4次，黃酮得率差異不顯著。從提高提取效率考慮，提取3次即可。

2.7 超聲波提取影響因素的正交優(yōu)化

從以上單因素篩選試驗(yàn)可以看出，總黃酮提取率與提取次數(shù)A（1次、2次、3次）、提取溫度B（40℃、50℃、60℃）、乙醇溶液濃度C（60%、70%、80%）這3個(gè)因素的關(guān)系較大，為了全面考察這三個(gè)因素的作用大小和優(yōu)化組合，設(shè)計(jì)了三因素三水平的正交試驗(yàn)。將A、B、C分別放在1、2、4列，重復(fù)試驗(yàn)三次，根據(jù)正交試驗(yàn)組合結(jié)果進(jìn)行極差分析，并對(duì)各個(gè)處理間進(jìn)行差異顯著性分析。結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可看出提取次數(shù)、提取溫度、提取溶液濃度三因素對(duì)總黃酮的提取率的影響程度依次為B>C>A，即提取溫度影響最大，其次是提取濃度，最后是提取次數(shù)。正交試驗(yàn)方差分析F檢驗(yàn)結(jié)果表明，三因素對(duì)黃酮的提取效果都有極顯著影響，區(qū)組間差異不顯著。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)黃酮提取效果最優(yōu)的組合是A3B2C3，與單因素試驗(yàn)結(jié)果基本相符，即用80%酒精作為提取劑在液料比1：15、提取溫度50 ℃下提取三次，每次提取15 min。

表1 ?正交試驗(yàn)級(jí)差及差異顯著性分析

3 ? 結(jié)論

從植物中提取黃酮類化合物的方法目前有回流法、索氏提取法、浸提法、樹(shù)脂-硅膠層析法、解析和超聲波法[4、7-17]等。相對(duì)于傳統(tǒng)的提取方法，在超聲波輔助萃取過(guò)程中，超聲產(chǎn)生的沖擊流能有效地減少溶劑與水相之間的阻滯層，從而使溶質(zhì)擴(kuò)散加速；同時(shí)，沖擊波能使組織細(xì)胞變形、破裂，釋放其內(nèi)含物[13]，因此，超聲波輔助提取法能夠提高黃酮的提取率。作者曾以橙色葉球大白菜為試材對(duì)總黃酮的提取及含量測(cè)定進(jìn)行了研究[14]，最適合的提取工藝是以80%乙醇為溶劑，在料液比（g/ml）為1：20，溫度60℃條件下，用頻率為60Hz的超聲波連續(xù)提取2次，每次提取1 h。郭孝武[15]試驗(yàn)得出用頻率為20kHz的超聲波處理30min，從槐米中提取蕓香甙，提取率高，速度快。史振民等[16]利用正交設(shè)計(jì)蘆丁提取方案，在超聲頻率21.5 kHz，超聲時(shí)間10min，靜置時(shí)間12h時(shí)蘆丁提取率最高。木合塔爾·吐?tīng)柡閇17]認(rèn)為超聲法是提取昆侖雪菊中黃酮物質(zhì)的最佳提取方法。

本試驗(yàn)在蒲公英黃酮類化合物的提取中，也采用了超聲法作為提取方法。用80%酒精作為提取劑在液料比1：15、提取溫度50℃下，以60Hz超聲提取三次，每次提取15min。與前人提取條件略有不同，這可能與不同試驗(yàn)材料的物理結(jié)構(gòu)及所含黃酮的物質(zhì)不同有關(guān)。