李慧君，衛(wèi)婷，黃楓城，陳藝杰，李高洋，張偉健，吳偉健，藺中，甄珍*

（1.廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.廣東海洋大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣東 湛江 524088）

四環(huán)素類抗生素是一類具有并四苯結(jié)構(gòu)的廣譜性抗生素，常用種類包括四環(huán)素（Tetracycline，TC）、金霉素（Chlortetracycline，CTC）和土霉素（Oxytetracycline，OTC），在防治細(xì)菌感染、促進(jìn)動(dòng)物生長和防止病蟲害等方面有巨大貢獻(xiàn)[1]。四環(huán)素因價(jià)格低廉、抑菌效果好[2]而被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)（年均用量10 002.73 t）中[3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，30%～90%的四環(huán)素可隨尿糞排出體外，并伴隨糞肥農(nóng)用在我國農(nóng)田土壤中累積[4]。我國農(nóng)業(yè)用地（菜田、大棚）四環(huán)素檢測(cè)范圍介于0～2 450 μg·kg-1之間[5]，部分地區(qū)抗生素濃度遠(yuǎn)超歐盟標(biāo)準(zhǔn)的生態(tài)安全風(fēng)險(xiǎn)值（100 μg·kg-1）[6]。進(jìn)入農(nóng)田土壤的四環(huán)素嚴(yán)重破壞土壤微生物種群結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)土壤中耐藥基因的產(chǎn)生，干擾土壤生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和流動(dòng)。更為關(guān)鍵的是，土壤中的四環(huán)素還會(huì)被蔬菜等作物吸收，并通過食物鏈傳播給人類[7]。土壤四環(huán)素污染已嚴(yán)重威脅我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)地環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全，進(jìn)而影響到人體健康。因此，尋求一種高效經(jīng)濟(jì)的措施促進(jìn)四環(huán)素去除，保障生態(tài)安全成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

農(nóng)田土壤四環(huán)素修復(fù)技術(shù)主要包括物理、化學(xué)和生物修復(fù)[8-9]。物理（如吸附）或化學(xué)（如氧化）修復(fù)技術(shù)，由于成本高昂、可持續(xù)性差、易造成二次污染等問題而難以大范圍推廣。與之相比，生物修復(fù)技術(shù)是一種更有效和環(huán)保的方法。目前，土壤四環(huán)素的生物修復(fù)多集中于接種馴化的降解菌。然而，實(shí)際應(yīng)用中面臨的環(huán)境適應(yīng)力差、與土著微生物相互競(jìng)爭(zhēng)、受污染物種類和濃度限制等諸多限制因素，致使田間修復(fù)效果欠佳。大量研究證實(shí)，土壤中的Trichosporon mycotoxinivorans、Stenotrophomonas maltophilia和Sphingobacterium等微生物能夠代謝四環(huán)素[10-12]。在自然環(huán)境中，降解微生物生長緩慢、豐度低、分解代謝活性差，致使其降解四環(huán)素能力較低。近年來，國內(nèi)外學(xué)者致力于激發(fā)土著微生物降解效率的驅(qū)動(dòng)因素研究，從而嘗試解決上述限制因素。例如改善微生物生存環(huán)境條件、添加營養(yǎng)物刺激微生物的代謝活性等[13-15]。

生物炭是由作物秸稈、污泥等生物質(zhì)材料在限氧條件下，經(jīng)過高溫?zé)峤馓炕纬傻亩嗫赘惶疾牧蟍16]，其理化性質(zhì)穩(wěn)定，比表面積大，孔隙結(jié)構(gòu)豐富，富含C、N、P等元素。一方面，生物炭不僅可以提高土壤的透氣性，改善土壤環(huán)境[17]，為微生物提供良好的棲息環(huán)境。另一方面，生物炭可作為土壤微生物代謝碳源，為微生物生長和繁殖提供必需的營養(yǎng)元素[18]。此外，生物炭含有羥基、羧基、羰基等官能團(tuán)，可有效吸附土壤中的四環(huán)素，減少四環(huán)素在環(huán)境中的遷移[19]。因此，生物炭作為一種新型改良劑，在四環(huán)素的去除中發(fā)揮著重要作用。不同劑量生物炭對(duì)土壤中四環(huán)素去除的影響效果和機(jī)制差異很大。低劑量生物炭的施入可能導(dǎo)致土著微生物活性激發(fā)不完全，效果不佳[15]。高劑量生物炭易產(chǎn)生較強(qiáng)的吸附固定效果，反而延緩?fù)寥乐兴沫h(huán)素的生物降解，且造成資源浪費(fèi)[20]。適宜的劑量是決定生物炭修復(fù)農(nóng)田土壤中四環(huán)素效果的關(guān)鍵因素，明確合適的生物炭劑量對(duì)于修復(fù)農(nóng)田土壤四環(huán)素污染具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

據(jù)此，本研究以南方農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常見的廢棄物甘蔗渣為原材料制備生物炭，選取3 種劑量（1%，2%，3%）生物炭對(duì)農(nóng)田土壤中四環(huán)素的去除性能進(jìn)行探究。運(yùn)用高通量測(cè)序測(cè)定不同劑量生物炭對(duì)農(nóng)田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，尋找潛在的降解微生物類群。通過測(cè)定土壤酶活性反映生物炭施入后對(duì)土壤健康質(zhì)量狀況的改善情況。進(jìn)一步運(yùn)用冗余分析（Redundancy analysis，RDA）對(duì)土壤理化性質(zhì)、四環(huán)素去除效率以及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行相關(guān)性研究，以期明確生物炭通過改變何種環(huán)境因子，促進(jìn)污染土壤四環(huán)素的去除。研究結(jié)果為開發(fā)一種高效環(huán)保的農(nóng)田四環(huán)素污染修復(fù)技術(shù)提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗(yàn)土壤采集自廣東省湛江市麻章區(qū)郊區(qū)農(nóng)田（21°04′1.85″N，110°19′27.86″E），用土壤取樣器取表層0～20 cm 的土壤，土樣采集后風(fēng)干研磨過0.25 mm 篩備用。土壤中未檢測(cè)出四環(huán)素。供試土壤理化性質(zhì)：pH 為5.35，有機(jī)質(zhì)含量為31.66 g·kg-1，腐殖質(zhì)含量為11.92 g·kg-1。

生物炭原材料為甘蔗渣，收集于廣東湛江市遂溪制糖廠，生物炭具體制備步驟：原材料經(jīng)自然風(fēng)干、粉碎、研磨后過2 mm 篩。將研磨的甘蔗渣置于陶瓷坩堝中，壓實(shí)蓋上蓋，于馬弗爐中按目標(biāo)溫度熱解炭化。馬弗爐升溫速率為10 ℃·min-1，升至550 ℃并保持2 h。待爐內(nèi)溫度自然冷卻后取出生物炭，置于廣口瓶中，干燥保存待用。生物炭理化性質(zhì)：pH 為9.03，有機(jī)質(zhì)含量為548.69 g·kg-1。

鹽酸四環(huán)素（純度＞98%）購于美國Sigma-Aldrich公司。乙腈、甲醇和乙酸乙酯購于美國Sigma-Aldrich 公司，為高效液相色譜（HPLC）級(jí)。其他化學(xué)品均購于中國科城生物技術(shù)有限公司，均為分析純。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共設(shè)置4 個(gè)處理：土壤+四環(huán)素（CK）、土壤+四環(huán)素+1%生物炭（BC-1）、土壤+四環(huán)素+2%生物炭（BC-2）、土壤+四環(huán)素+3%生物炭（BC-3），每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的農(nóng)田土壤中四環(huán)素污染現(xiàn)狀[21]（檢測(cè)范圍介于0.01～300.00 mg·kg-1），本研究以四環(huán)素含量為5.00 mg·kg-1（以干土質(zhì)量計(jì)）代表四環(huán)素在土壤中污染的情況。供試土壤初始含水率為10%，將60.00 mg 鹽酸四環(huán)素溶解于水中，并與1.00 kg 供試土壤充分混合30 min。將人工污染土壤與11.00 kg 供試土壤混合，制備成最終均勻土壤樣品。將土壤平均分成12份，放入寬10 cm、高30 cm的圓柱形培養(yǎng)瓶內(nèi)。按試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別添加1%、2%和3%的生物炭。隨后，將土壤的含水率調(diào)節(jié)到田間持水量的60%。所有處理均在25 ℃的恒溫和黑暗密封條件下培養(yǎng)。于第0、10、20、30、40 天，5 個(gè)時(shí)間段分別采集樣品，并置于-20 ℃冷凍保存，測(cè)定四環(huán)素殘留量、土壤理化性質(zhì)和酶活性指標(biāo)。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)（第40天）高通量測(cè)序土壤樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。

1.3 四環(huán)素殘留量的測(cè)定

將冷凍干燥后的土壤樣品過0.15 mm 篩，隨后稱取土壤樣品1.00 g。將土樣置于50 mL帶蓋塑料離心管中。先向離心管中加入20 mL McIlvaine -Na2EDTA-甲醇提取液用于提取四環(huán)素，在漩渦振蕩器上室溫（約25 ℃）提取1 min，使土壤與提取液混合均勻，然后將離心管置于超聲波清洗儀下10 min，最大程度破碎土壤顆粒，在機(jī)械振蕩提取儀中室溫（約25 ℃）提取20 min，充分提取四環(huán)素，于15 ℃下置于4 000 r·min-1的離心機(jī)上，離心10 min 后取上清液至另一離心管中。向殘?jiān)幸来渭尤?0、10 mL Mc-Ilvaine-Na2EDTA-甲醇提取液，重復(fù)提取兩次，合并上清液并用提取液定容至50 mL。取5 mL 上清液置于氮?dú)獯蹈蓛x上，室溫下避光吹至原體積的一半左右，加適量水稀釋至5 mL，然后以1.00 mL·min-1的速度通過已活化處理的固相萃取柱。依次用5 mL 水、5 mL 甲醇－水淋洗固相萃取柱，將以上過程的流出液全部棄去，減壓抽干5 min，再用5 mL 色譜純甲醇洗脫目標(biāo)物。將洗脫出的樣品再次置于氮?dú)獯蹈蓛x上吹至近干，最后用1 mL 的甲醇溶解殘?jiān)?，過0.22 μm有機(jī)相濾膜，樣品待測(cè)。色譜柱為安捷倫的規(guī)格為4.66 mm×260.00 mm 的烷基C18 反相柱；流動(dòng)相為三元流動(dòng)相，甲醇∶草酸∶乙腈=10∶80∶10；流速1 mL·min-1；柱溫為左右端均25 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；紫外燈檢測(cè)波長為355 nm。每個(gè)試驗(yàn)樣品進(jìn)行3 次重復(fù)測(cè)定，回收率在95.80%～102.50%之間。

1.4 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

土壤理化性質(zhì)測(cè)定依據(jù)《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》[22]，具體為：

土壤pH 的測(cè)定：土壤pH 采用電位法（水土比為2.5∶1）測(cè)定。稱取過2 mm篩的風(fēng)干土樣10.00 g，將其置于50 mL 燒杯中，加入25 mL 無CO2的水，攪動(dòng)1 min，使土樣充分分散。靜置30 min 后將校準(zhǔn)過的雷磁pH 計(jì)（型號(hào)為PHSJ-3F，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）插入上部澄清液中，待讀數(shù)穩(wěn)定后讀取pH值。

有機(jī)質(zhì)的測(cè)定：在外加熱的條件下（油浴溫度為180 ℃，沸騰5 min），用一定濃度的重鉻酸鉀-硫酸溶液氧化土壤有機(jī)碳，剩余的重鉻酸鉀用硫酸亞鐵滴定，通過所消耗的重鉻酸鉀量按校正系數(shù)計(jì)算出有機(jī)碳含量。

腐殖質(zhì)的測(cè)定：用含有焦磷酸鈉和氫氧化鈉的浸提劑提取腐殖質(zhì)，將土壤中難溶和易溶的結(jié)合態(tài)腐殖質(zhì)一次結(jié)合成易溶的腐殖酸鈉鹽，從而將腐殖質(zhì)浸出，然后用重鉻酸鉀氧化外加熱法進(jìn)行測(cè)定。

1.5 土壤酶活性測(cè)定

蔗糖酶活性的測(cè)定：蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定[23]。采用還原糖共熱法將3，5-二硝基水楊酸還原為3-氨基-5-硝基水楊酸，利用分光光度計(jì)在508 nm 波長下進(jìn)行比色測(cè)定，其活性以每日每克土生成葡萄糖的量表示，單位為mg·g-1·d-1。

脲酶活性的測(cè)定：脲酶活性測(cè)定采用靛酚藍(lán)比色法測(cè)定[24]。酶促產(chǎn)物氨在堿性基質(zhì)中與苯酚及次氯酸鈉作用產(chǎn)生靛酚藍(lán)，靛酚藍(lán)的生成量與氨濃度呈正比，利用分光光度計(jì)在578 nm 處進(jìn)行比色分析，其活性以每日每克土壤生成銨態(tài)氮的量表示，單位為mg·g-1·d-1。

過氧化氫酶活性的測(cè)定：過氧化氫酶活性采用高錳酸鉀滴定法測(cè)定[25]。用高錳酸鉀滴定量之差計(jì)算分解量，以1.00 g 干土每1 h 內(nèi)消耗0.10 mol·L-1KMnO4的體積數(shù)（以mL計(jì)）表示，單位為mL·g-1·h-1。

脫氫酶活性的測(cè)定：脫氫酶活性采用TTC還原法測(cè)定[26]。采用氯化三苯基四氮唑還原法，用三苯基四唑氯化物作為氫的受體生成紅色三苯基甲?（TPF），TPF 的量與紅色深淺有關(guān)。利用分光光度計(jì)在485 nm 處進(jìn)行比色測(cè)定，脫氫酶活性以每日每克土生成的TPF的量表示，單位為μg·g-1·d-1。

1.6 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)測(cè)定

利用Bio Fast 土壤DNA 提取試劑盒（BIOEER，杭州）提取土壤樣品DNA，利用NanoDrop 200 檢測(cè)DNA濃度和純度。用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增區(qū)域?yàn)?6S rRNA V3+V4高變區(qū)。PCR反應(yīng)體系由KOD FX Neo緩沖液5 μL（2 mmol·L-1）、dNTP 2 μL（各2 mmol·L-1）、KOD FX Neo 0.2 μL、引物0.3 μL、模板DNA 50 ng、去離子水（加至終體積10 μL）組成。PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30個(gè)循環(huán)，最后于72 ℃延伸5 min。將擴(kuò)增后的產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)并回收，并委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行純化和測(cè)序。

1.7 數(shù)據(jù)分析

在Illumina MiSeq 高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行雙末端測(cè)序后，使用Usearch 11.0 對(duì)序列在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類獲得操作分類單元（Operational taxonomic units，OTUs）。使用Silva 數(shù)據(jù)庫（https：//www.arbsilva.de/）對(duì)所有OTUs進(jìn)行分類學(xué)注釋。為了評(píng)估細(xì)菌微生物群落的豐富度和復(fù)雜性，使用QIIME 1.8.0獲得屬水平上的物種組成圖和聚類熱圖[27]。土壤理化性質(zhì)、酶活性均采用SPSS 25.0 進(jìn)行正態(tài)性分布和方差齊性檢驗(yàn)后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（Oneway ANOVA），采用鄧肯（Duncan′s）法進(jìn)行多重比較（P＜0.05），來檢驗(yàn)不同處理間的顯著差異性。利用Origin 2022 繪制柱形圖，利用Canoco 5.0 中的線性模型RDA 分析降解率與微生物群落結(jié)構(gòu)及環(huán)境因子的相關(guān)關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同劑量生物炭對(duì)土壤四環(huán)素去除的影響

如圖1 所示，生物炭處理下的土壤中四環(huán)素含量均顯著低于CK（P＜0.05），說明添加生物炭可以顯著加速四環(huán)素的降解效率。經(jīng)過40 d的培養(yǎng)后，BC-2處理下四環(huán)素的去除效率（79.50%）顯著高于BC-3（62.50%）和BC-1（50.30%）處理（P＜0.05），表明不同劑量的生物炭對(duì)四環(huán)素的去除效果有一定差異，其中BC-2處理效果最優(yōu)。

圖1 不同處理下的四環(huán)素殘留量Figure 1 Residual concentrations of tetracycline under different treatments

2.2 不同劑量生物炭對(duì)四環(huán)素污染土壤理化性質(zhì)的影響

不同劑量生物炭對(duì)土壤理化性質(zhì)有顯著影響（表1）。與CK相比，添加生物炭提高了土壤pH值和有機(jī)質(zhì)、腐殖質(zhì)含量。培養(yǎng)40 d 后，生物炭處理（BC-1、BC-2 和BC-3）的pH 值分別比CK 提高了0.46、0.54個(gè)和0.80 個(gè)單位。不同劑量生物炭對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)的含量也有較大影響。施入生物炭后（0 d 時(shí)），BC-1、BC-2和BC-3處理土壤有機(jī)質(zhì)含量較CK顯著增加了5.37%、8.85%和19.23%（P＜0.05）。在整個(gè)培養(yǎng)期間，各生物炭處理組有機(jī)質(zhì)含量呈逐漸下降趨勢(shì)，但均高于CK 處理。40 d 后，BC-1、BC-2 和BC-3 處理土壤的腐殖質(zhì)含量均顯著大于CK，與CK 處理相比，BC-1、BC-2 和BC-3 處理增幅分別為37.06%、54.18%和43.09%（P＜0.05），且生物炭處理組腐殖質(zhì)含量始終呈逐漸上升的趨勢(shì)。

表1 不同處理下土壤理化性質(zhì)的變化Table 1 Changes of soil physical and chemical properties under different treatments

2.3 不同劑量生物炭對(duì)四環(huán)素污染土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，在所有土壤中共獲得386 984 條有效序列，每個(gè)樣品的有效序列范圍為80 254～80 796條，其中共鑒定出3 055 個(gè)OTUs，相似度為97%。在屬水平上，將相對(duì)豐度前20 的細(xì)菌屬選為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，剩余的歸為其他（Others）。圖2a 為不同處理下屬水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化，CK 中Achromobacter（無色桿菌屬）、Sphingomonas（鞘脂單胞菌屬）、Stenotrophomonas（寡養(yǎng)單胞菌屬）、Trichosporon（毛孢子菌屬）、Shewanella（希瓦氏菌屬）、Pseudomonas（假單胞菌屬）等為主要優(yōu)勢(shì)菌。不同劑量生物炭添加后，Achromobacter（無色桿菌屬）、Sphingomonas（鞘脂單胞菌屬）、Stenotrophomonas（寡養(yǎng)單胞菌屬）、Trichosporon（毛孢子菌屬）、Shewanella（希瓦氏菌屬）、Pseudomonas（假單胞菌屬）、Ralstonia（雷爾氏菌屬）和Klebsiella（克雷伯菌屬）的豐度發(fā)生了顯著的變化。添加不同劑量的生物炭顯著提升了土壤中優(yōu)勢(shì)微生物的豐度。和CK相比，BC-1、BC-2和BC-3處理中Achromobacter（無色桿菌屬）的相對(duì)豐度分別提升103.02%、224.22%和145.41%，Sphingomonas（鞘脂單胞菌屬）的相對(duì)豐度分別提升138.12%、209.53% 和5.22%，Trichosporon（毛孢子菌屬）的相對(duì)豐度分別提升8.31%、150.42%和25.01%，Pseudomonas（假單胞菌屬）的相對(duì)豐度分別提升150.00%、283.31%和16.34%，Ralstonia（雷爾氏菌屬）的相對(duì)豐度分別提升175.21%、300.43%和500.20%，Klebsiella（克雷伯菌屬）的相對(duì)豐度分別提升12.13%、240.31%和17.64%，其中除Ralstonia（雷爾氏菌屬）外的其他菌屬的相對(duì)豐度均為BC-2 處理提升的幅度最大。Stenotrophomonas（寡養(yǎng)單胞菌屬）僅在BC-2 處理中增長了20.61%，在BC-1 和BC-3 處理中分別下降了13.82%和10.44%。Shewanella（希瓦氏菌屬）也僅在BC-2 處理中增長了17.60%，在BC-1 和BC-3 處理中分別下降了58.90%和35.30%。Bacillus（芽孢桿菌屬）僅在BC-1 處理中增長了68.70%，在BC-2 和BC-3 處理中分別下降了28.50%和28.70%。與CK 相比，BC-1、BC-2、BC-3處理中Comamonas（叢毛單胞菌屬）的相對(duì)豐度分別下降了17.20%、14.30%和7.60%。圖2b 為不同處理下屬水平微生物群落結(jié)構(gòu)聚類熱圖，根據(jù)細(xì)菌屬的層次聚類熱圖，將樣品分為三大類。BC-1、BC-2 與CK 和BC-3 組合分離，表明添加生物炭對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有顯著影響。與CK處理相比，BC-2處理的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化最大。

圖2 不同處理下微生物群落結(jié)構(gòu)的變化Figure 2 Changes of microbial community structure under different treatments

2.4 不同劑量生物炭對(duì)四環(huán)素污染土壤酶活性的影響

添加不同劑量生物炭均可以提升土壤脲酶、蔗糖酶、過氧化氫酶和脫氫酶的活性。圖3a 顯示，添加不同劑量生物炭處理中土壤脲酶活性在20 d 時(shí)達(dá)到峰值，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，BC-1、BC-2 和BC-3 的脲酶活性分別為4.27、5.16、4.47 mg·g-1·d-1，顯著高于CK（3.61 mg·kg-1·d-1），其中BC-2 對(duì)脲酶活性的促進(jìn)作用最顯著。添加不同劑量生物炭處理中土壤蔗糖酶活性在30 d 時(shí)達(dá)到峰值，隨后降低（圖3b），40 d 后BC-1、BC-2、BC-3 的土壤蔗糖酶活性分別較CK 增加了164.10%、183.30%、128.50%。生物炭處理中，過氧化氫酶活性在20 d 時(shí)達(dá)到峰值，但脫氫酶活性在整個(gè)培養(yǎng)過程中持續(xù)升高。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，BC-1、BC-2和BC-3 處理的過氧化氫酶活性分別為6.86、7.39 mL·g-1·h-1和6.97 mL·g-1·h-1，均顯著高于CK（4.47 mL·g-1·h-1），脫氫酶活性分別為0.89、1.39 μg·g-1·d-1和1.14 μg·g-1·d-1，也均顯著高于CK（0.54 μg·g-1·d-1）。綜上所述，生物炭的施入大幅度提升了土壤的酶活性，其中以BC-2 處理提升效果最好。

圖3 不同處理下土壤酶活性的變化Figure 3 Changes of soil enzyme activities under different treatments

2.5 環(huán)境因子、土壤微生物及四環(huán)素降解效率的關(guān)聯(lián)分析

土壤微生物群落、環(huán)境因子和四環(huán)素降解效率之間的相關(guān)性如圖4所示。RDA 結(jié)果表明，第一軸解釋關(guān)聯(lián)性信息的57.70%，第二軸解釋25.10%，累計(jì)解釋信息量為82.80%。由此得出，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、環(huán)境因子與四環(huán)素降解效率的相關(guān)性主要是由第一軸來解釋。第一軸主要與Achromobacter（無色桿菌屬）、Sphingomonas（鞘脂單胞菌屬）、Stenotrophomonas（寡養(yǎng)單胞菌屬）、Trichosporon（毛孢子菌屬）、Shewanella（希瓦氏菌屬）、Pseudomonas（假單胞菌屬）、Ralstonia（雷爾氏菌屬）、Klebsiella（克雷伯菌屬）等細(xì)菌屬有關(guān)。第二軸主要與土壤理化性質(zhì)（pH、有機(jī)質(zhì)和腐殖質(zhì)含量）有關(guān)。添加不同劑量生物炭對(duì)土壤四環(huán)素降解效率的影響主要源于其對(duì)土壤蘊(yùn)含的微生物種群結(jié)構(gòu)和豐度的影響，土壤理化性質(zhì)的改變貢獻(xiàn)率次之。第一軸微生物群落中，Achromobacter（無色桿菌屬）、Sphingomonas（鞘脂單胞菌屬）、Stenotrophomonas（寡養(yǎng)單胞菌屬）、Trichosporon（毛孢子菌屬）、Shewanella（希瓦氏菌屬）、Pseudomonas（假單胞菌屬）、Ralstonia（雷爾氏菌屬）、Klebsiella（克雷伯菌屬）和Nocardioides（諾卡氏菌屬）與四環(huán)素降解效率呈正相關(guān)，Mycobacterium（分枝桿菌屬）、Streptomyces（鏈霉菌屬）、Bacillus（芽孢桿菌屬）和Comamonas（叢毛單胞菌屬）與四環(huán)素去除效率呈負(fù)相關(guān)。第二軸土壤理化性質(zhì)中，四環(huán)素去除效率主要與pH 和腐殖質(zhì)含量呈正相關(guān)。

圖4 環(huán)境因子、土壤微生物與四環(huán)素去除效率的冗余分析Figure 4 Redundancy analysis of environmental factors，soil microorganisms and tetracycline removal efficiency

3 討論

本研究探討生物炭的不同劑量對(duì)土壤中四環(huán)素去除效率的影響。培養(yǎng)40 d后，生物炭處理的四環(huán)素殘留量顯著低于CK，說明生物炭處理顯著加快了土壤中四環(huán)素的去除，且BC-2 處理的四環(huán)素去除效率（79.50%）顯著高于BC-3（62.50%）和BC-1（50.30%）處理。同時(shí)發(fā)現(xiàn)土壤原生微生物在四環(huán)素污染土壤的解毒凈化中發(fā)揮著重要作用。不同劑量的生物炭在不同程度上提高了土壤降解微生物的豐度。結(jié)果表明，生物炭能改善土壤理化性質(zhì)和土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，提升具有四環(huán)素降解功能的微生物的豐度，進(jìn)而加速四環(huán)素在土壤中的降解。本研究發(fā)現(xiàn)四環(huán)素降解在土壤中既有生物因素也有非生物因素，其中生物因素占主導(dǎo)作用。

生物炭在土壤中的應(yīng)用被認(rèn)為是一種環(huán)保且具有成本效益的方法，它可以加速污染物降解并減少污染物帶來的風(fēng)險(xiǎn)[28]。本研究表明，添加生物炭后土壤中某些細(xì)菌群落的豐度發(fā)生了變化，這些細(xì)菌群落可能可以作為評(píng)價(jià)四環(huán)素對(duì)土壤環(huán)境污染程度的生物指標(biāo)。施入生物炭后，Achromobacter（無色桿菌屬）、Sphingomonas（鞘脂單胞菌屬）、Stenotrophomonas（寡養(yǎng)單胞菌屬）、Trichosporon（毛孢子菌屬）、Shewanella（希瓦氏菌屬）、Pseudomonas（假單胞菌屬）、Ralstonia（雷爾氏菌屬）、Klebsiella（克雷伯菌屬）、Bacillus（芽孢桿菌屬）和Comamonas（叢毛單胞菌屬）的細(xì)菌豐度相比于CK 顯著提高。RDA 冗余分析表明，Achromobacter（無色桿菌屬）、Sphingomonas（鞘脂單胞菌屬）、Stenotrophomonas（寡養(yǎng)單胞菌屬）、Trichosporon（毛孢子菌屬）、Shewanella（希瓦氏菌屬）、Pseudomonas（假單胞菌屬）、Ralstonia（雷爾氏菌屬）和Klebsiella（克雷伯菌屬）與四環(huán)素降解效率呈正相關(guān)，說明他們顯著影響著四環(huán)素在土壤中的降解。Achromobacter（無色桿菌屬）、Sphingomonas（鞘脂單胞菌屬）、Stenotrophomonas（寡養(yǎng)單胞菌屬）、Trichosporon（毛孢子菌屬）、Shewanella（希瓦氏菌屬）、Pseudomonas（假單胞菌屬）和Klebsiella（克雷伯菌屬）被發(fā)現(xiàn)為潛在的降解菌。其中，Achromobacter（無色桿菌屬）被發(fā)現(xiàn)是四環(huán)素潛在降解菌，可以促進(jìn)四環(huán)素的高效降解，Wang 等[29]研究發(fā)現(xiàn)在四環(huán)素的污染環(huán)境下，Achromobacter（無色桿菌屬）在降解四環(huán)素過程中起主導(dǎo)作用。Shao等[30]發(fā)現(xiàn)Klebsiella（克雷伯菌屬）可以在8 d 內(nèi)降解超過89.66%的四環(huán)素。Sphingomonas（鞘脂單胞菌屬）含有編碼NADP 依賴的單加氧酶的tetX基因，可針對(duì)性地對(duì)土壤中的四環(huán)素進(jìn)行降解[11]。Stenotrophomonas（寡養(yǎng)單胞菌屬）可以將四環(huán)素或其代謝物作為碳源，在四環(huán)素降解過程中保持較高的活性[31]。Pseudomonas（假單胞菌屬）可以礦化多種藥物，包括四環(huán)素、磺胺甲惡唑和環(huán)丙沙星[32]。在生物炭處理中，這些細(xì)菌在BC-2 處理中的豐度提升幅度最大，說明適宜濃度的生物炭可以促進(jìn)土壤中四環(huán)素降解菌群豐度的提高，進(jìn)一步加速微生物對(duì)四環(huán)素的生物降解。

土壤酶作為土壤組分之一，是一種具有加速土壤生化反應(yīng)速率功能的蛋白質(zhì)，其參與土壤生物化學(xué)過程中許多有關(guān)物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)的反應(yīng)[10]。土壤酶活性的高低能夠表征土壤中微生物活性的高低，同時(shí)反映出土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化及其運(yùn)移能力的強(qiáng)弱，是土壤綜合肥力特征的有效反映[33]。土壤脲酶是唯一能對(duì)尿素起轉(zhuǎn)化作用的酶，能夠破壞C--N鍵，催化尿素分解生成氨、二氧化碳和水，為植物提供氮素營養(yǎng)[34]。土壤蔗糖酶是一種能將蔗糖水解為葡萄糖和果糖，增加土壤中易溶性營養(yǎng)物質(zhì)，為微生物提供能源的水解酶[33]。土壤脫氫酶和過氧化氫酶是直接參與異生物解毒的主要微生物催化劑，已得到廣泛的研究[33，35]。本研究表明，四環(huán)素污染降低了土壤的酶活性，這與Chessa 等[36]關(guān)于外源添加四環(huán)素會(huì)對(duì)土壤微生物活性產(chǎn)生不利影響的研究結(jié)果一致，也與李研等[37]研究抗生素菌渣作為有機(jī)肥施入土壤中對(duì)土壤酶活性產(chǎn)生影響的結(jié)果一致。造成抑制作用的原因是四環(huán)素進(jìn)入土壤后與土壤內(nèi)的酶分子形成了穩(wěn)定的絡(luò)合物，從而使酶活性降低，表現(xiàn)出抑制性。施入生物炭之后，土壤酶活性得到了提升，其中BC-2處理提升能力最強(qiáng)。由于生物炭自身含碳豐富，施入土壤直接增加了碳源，為微生物提供了溫床，使優(yōu)勢(shì)微生物得到生長，間接提高了土壤中的微生物數(shù)量和酶活性[38]。同時(shí)，生物炭可以為微生物提供生活所需的能量，生物炭蘊(yùn)含的有效養(yǎng)分和可溶性碳可促進(jìn)土壤微生物的生存與繁殖，使之生命活動(dòng)旺盛，從而間接增強(qiáng)土壤酶活性[39]。生物炭由于自身的吸附能力，減緩了四環(huán)素對(duì)酶活性的抑制作用。生物炭吸附在土壤酶基上，促進(jìn)酶促反應(yīng)位點(diǎn)，提高土壤酶活性[40]，并間接增強(qiáng)土壤自身的解毒能力，本研究與Briceno 等[41]研究一致。生物炭的施入極大促進(jìn)了土壤中四環(huán)素污染物降解菌群豐度的提高，加速了微生物對(duì)四環(huán)素的消耗，從而降低了土壤中四環(huán)素對(duì)微生物的毒害，使得土壤過氧化氫酶、脲酶、脫氫酶和蔗糖酶的活性提高。

土壤是一個(gè)復(fù)雜的多相體系。土壤的理化性質(zhì)（pH 和有機(jī)質(zhì)、腐殖質(zhì)含量）會(huì)影響四環(huán)素的降解[42]。RDA 結(jié)果表明，四環(huán)素的降解效率與土壤pH 和有機(jī)質(zhì)、腐殖質(zhì)含量呈正相關(guān)關(guān)系（圖4）。土壤pH 是影響四環(huán)素降解的重要因素，施入生物炭顯著提高了土壤pH。大量研究表明，與酸性土壤相比，四環(huán)素在中性或堿性土壤中更容易被降解[43-44]。在堿性環(huán)境中，四環(huán)素苯環(huán)C6位置的羥基在氫氧根離子的作用下容易形成氧負(fù)離子，向C11發(fā)生分子內(nèi)親核進(jìn)攻，破壞C環(huán)，從而生成非活性的內(nèi)酯異構(gòu)體，加速四環(huán)素的去除[45]。此外，pH 可以影響有機(jī)質(zhì)對(duì)四環(huán)素的吸附和固定作用，從而改變四環(huán)素的生物利用度，加速其在土壤中的去除[21]。四環(huán)素在土壤中的吸附率隨土壤pH 的增加而降低。腐殖質(zhì)結(jié)構(gòu)以芳香核為主體，附以大量羰基、酚羥基等基團(tuán)。當(dāng)腐殖質(zhì)增多時(shí)，羧基和酚羥基與四環(huán)素的--N（CH3）2基團(tuán)結(jié)合發(fā)生反應(yīng)，從而促進(jìn)四環(huán)素的氧化降解[46]。因此，生物炭可以通過提高土壤pH 和有機(jī)質(zhì)、腐殖質(zhì)含量加速四環(huán)素的去除。同時(shí)，土壤中的電子傳遞作用會(huì)影響四環(huán)素的降解，促使四環(huán)素結(jié)構(gòu)中雙鍵的電子轉(zhuǎn)移到配位鍵上，強(qiáng)化的親核性質(zhì)，削弱雙鍵的穩(wěn)定性，使得更容易破壞四環(huán)素的結(jié)構(gòu)，使得四環(huán)素的毒性顯著降低[47]。

4 結(jié)論

（1）1%（BC-1）、2%（BC-2）、3%（BC-3）3 種不同劑量的生物炭均可加速四環(huán)素在土壤中的去除，表現(xiàn)為BC-2（79.50%）＞BC-3（62.50%）＞BC-1（50.30%）。

（2）3 種不同劑量的生物炭提升土壤原生四環(huán)素潛在降解微生物Achromobacter（無色桿菌屬）、Sphingomonas（鞘脂單胞菌屬）、Stenotrophomonas（寡養(yǎng)單胞菌屬）、Trichosporon（毛孢子菌屬）、Shewanella（希瓦氏菌屬）、Pseudomonas（假單胞菌屬）、Klebsiella（克雷伯菌屬）的豐度，進(jìn)而顯著加速土壤四環(huán)素的去除，其中BC-2處理對(duì)土壤原生潛在降解微生物豐度的提升最強(qiáng)。3 種不同劑量的生物炭均可提升土壤的理化性質(zhì)（pH、有機(jī)質(zhì)、腐殖質(zhì)），其中BC-3 處理對(duì)pH 和有機(jī)質(zhì)的提升效果最好，BC-2 處理對(duì)腐殖質(zhì)的提升效果最好。

（3）3 種不同劑量生物炭的施入均可以顯著提高四環(huán)素污染土壤中脲酶、過氧化氫酶、蔗糖酶和脫氫酶的活性，提高土壤健康質(zhì)量狀況，其中BC-2處理對(duì)酶活性的提升效果最優(yōu)。