王紫雯陳雨吳曉宇趙玉梅任鑫如呂金枝李嘉利段巧紅黃家保

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院/作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271018)

TLP(Tubby-like protein)最早在肥胖小鼠中發(fā)現(xiàn)，并且廣泛存在于真核生物中[1]。植物TLP蛋白C末端通常含有一個(gè)由270個(gè)氨基酸組成的Tubby保守結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由一個(gè)包含12條反向平行鏈和一個(gè)中央疏水的α螺旋組成，能與特定的磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(PIP2)結(jié)合，從而與質(zhì)膜連接[2，3]。與保守的C末端Tubby結(jié)構(gòu)域相反，TLP的N端在不同物種間存在較大差異，動(dòng)物TLP蛋白N末端高度分化，大多數(shù)植物TLP蛋白N末端含有一個(gè)保守的F-box結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域同蛋白泛素化密切相關(guān)[4，5]，且有研究表明Tubby結(jié)構(gòu)域和F-box結(jié)構(gòu)域是協(xié)同進(jìn)化的[6]。

動(dòng)物中TLP基因的生物學(xué)功能已經(jīng)得到深入研究，例如，在人體中發(fā)現(xiàn)TLP基因突變可能會(huì)導(dǎo)致肥胖、視力喪失和神經(jīng)感覺喪失等[7，8]。在植物中發(fā)現(xiàn)了更多的TLP基因，但是研究較少，許多功能機(jī)制仍不清楚[9]。已有的研究更多集中在植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)，目前已在擬南芥、水稻、番茄、玉米、楊樹中分別鑒定出了11、14、11、15、11個(gè)TLP基因家族成員[6，10-12]。通過酵母雙雜交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，擬南芥TLP家族成員At-TLP3參與了種子萌發(fā)過程中脫落酸(ABA)信號(hào)的調(diào)節(jié)，AtTLP9在鹽脅迫與干旱脅迫中發(fā)揮作用[10，13]。在鷹嘴豆中，CaTLP1在脫水、高鹽、脫落酸(ABA)處理下表達(dá)上調(diào)，過表達(dá)CaTLP1可以提高轉(zhuǎn)基因煙草植株對(duì)脫水、鹽脅迫和氧化脅迫的耐受性，同時(shí)改善植株地上部和根構(gòu)型，其在細(xì)胞核中的優(yōu)先表達(dá)可能與抗逆性增強(qiáng)有關(guān)[14]。過表達(dá)MdTLP7基因可以顯著提高擬南芥幼苗對(duì)滲透脅迫、鹽脅迫、冷熱脅迫的耐受性[15]。這都證明了TLP基因參與了植物的非生物脅迫反應(yīng)，在植物應(yīng)對(duì)非生物脅迫響應(yīng)的過程中發(fā)揮重要作用。

白菜(Brassica rapa)為十字花科蕓薹屬蔬菜，是中國(guó)、韓國(guó)和日本等國(guó)的主要蔬菜之一，在世界各地廣泛種植。目前，土壤鹽堿化成為制約我國(guó)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素之一，我國(guó)部分白菜產(chǎn)區(qū)土壤鹽漬化嚴(yán)重影響白菜的正常生長(zhǎng)發(fā)育過程，因此，亟需培育耐鹽、抗鹽的白菜品種?，F(xiàn)有研究表明，TLP家族在植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)中發(fā)揮一定作用，所以本研究對(duì)白菜TLP家族進(jìn)行了鑒定，并對(duì)其基因結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育等系列生物信息學(xué)進(jìn)行了分析，同時(shí)，對(duì)其組織表達(dá)模式及鹽脅迫響應(yīng)情況進(jìn)行了研究，以期為其后續(xù)功能研究及種質(zhì)改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 白菜TLP家族成員鑒定及理化性質(zhì)分析

根據(jù)擬南芥已經(jīng)鑒定出來的11個(gè)TLP成員蛋白序列，通過雙向Blast在白菜基因組搜索候選白菜TLP家族成員，再通過保守結(jié)構(gòu)域分析等方法進(jìn)一步確定候選基因。應(yīng)用軟件TBtools[16]和Expasy(https://www.expasy.org/)[17]分析白菜TLP家族的蛋白質(zhì)分子量(MW)、等電點(diǎn)(pI)等理化性質(zhì)。

1.2 白菜TLP基因家族染色體定位、共線性分析及進(jìn)化樹構(gòu)建

從白菜數(shù)據(jù)庫下載gff3基因組注釋數(shù)據(jù)文件，使用TBtools繪制TLP基因在染色體上的分布圖。利用MCScanX[18]繪制白菜與擬南芥TLP基因家族共線性分析圖。在Ensembl Plants(http://plants.ensembl.org/index.html)獲取番茄及水稻TLP家族氨基酸序列，通過MEGA-X[19]采用最大似然法(Maximum Likelihood Estimate，MLE)構(gòu)建白菜、擬南芥、番茄及水稻TLP家族系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3 白菜TLP基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析

使用TBtools繪制白菜TLP基因結(jié)構(gòu)圖；通過MEME(http://meme-suite.org/)[20]預(yù)測(cè)白菜TLP蛋白保守基序；利用軟件DNAMAN對(duì)白菜TLP序列進(jìn)行比對(duì)，分析其保守氨基酸位點(diǎn)。

1.4 順式作用元件分析

通過Ensembl Plants[21]查找并下載白菜TLP基因家族的起始密碼子上游2 000 bp序列，使用PlantCARE(http:/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/htm1/)在線網(wǎng)站[22]對(duì)獲取的序列進(jìn)行分析。

1.5 白菜TLP基因表達(dá)分析

試驗(yàn)材料為山東農(nóng)業(yè)大學(xué)蔬菜生長(zhǎng)與生殖研究組植物培養(yǎng)室的‘848蛋黃白’，于2022年2月20日定植，分別取定植70 d白菜幼苗的根、莖、葉和當(dāng)天開放的花、果莢進(jìn)行RNA提取，用于組織特異性表達(dá)研究；使用150 mmol/L NaCl分別處理0、2、4、6、12 h，各部位及各時(shí)間段均取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，進(jìn)行基因表達(dá)分析。

通過qPrimerDB-qPCR Primer Database(https:/biodb.swu.edu.cn/qprimerdb/)[23]查找并設(shè)計(jì)引物(表1)，內(nèi)參基因?yàn)锽rActin7，由青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。采用RNA提取試劑盒提取白菜樣品的總RNA，參照HiScriptⅡQ RT SuperMix for qPCR(南京諾唯贊生物科技有限公司)試劑盒產(chǎn)品說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司)試劑盒進(jìn)行定量PCR試驗(yàn)。反應(yīng)體系(20μL):上、下游引物各0.4 μL，SYBR 10μL，cDNA 2μL，用滅菌ddH2O補(bǔ)至20μL。PCR反應(yīng)程序:95℃30 s；95℃10 s，60℃22 s，40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel進(jìn)行整理，并使用TBtools進(jìn)行熱圖繪制。

表1 白菜TLP基因序列引物

2 結(jié)果與分析

2.1 白菜TLP基因家族成員鑒定及理化性質(zhì)分析

經(jīng)鑒定得到14個(gè)白菜TLP基因家族成員，命名為BrTLP1～BrTLP14(表2)，這些基因不均勻地分布在白菜10條染色體中的7條，BrTLP1、BrTLP8、BrTLP13未在染色體中發(fā)現(xiàn)，根據(jù)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)其可能分布于葉綠體或線粒體中。

表2 白菜TLP基因家族信息

白菜TLP家族蛋白分子量介于38 735.69～52 747.34 D，等電點(diǎn)介于9.16～9.88。所有TLP家族成員的等電點(diǎn)均大于7.0，說明其均富含堿性氨基酸。

2.2 白菜TLP蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

對(duì)白菜的14個(gè)TLP蛋白序列進(jìn)行保守性分析，每個(gè)基因均含有Motif 2、Motif 3、Motif 7、Motif 10。除了BrTLP14，其他基因的Motif分布都比較均勻。Motif 9僅在BrTLP3、BrTLP4、BrTLP5上出現(xiàn)，BrTLP14中Motif的數(shù)目最少，與其他基因成員差異明顯，推測(cè)該基因在功能上與其他基因存在較大不同(圖1)。

圖1 白菜TLP基因家族結(jié)構(gòu)域分析

2.3 白菜TLP基因家族結(jié)構(gòu)分析

在鑒定到的14個(gè)BrTLP基因中，BrTLP14含有9個(gè)CDS，絕大部分BrTLP基因含有4～5個(gè)CDS(圖2)。BrTLP14的CDS數(shù)目與其他基因存在較大差別，推測(cè)其可能在白菜器官中發(fā)揮特異性功能。對(duì)蛋白的保守功能域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)白菜TLP家族基因都含有F-box結(jié)構(gòu)域，其中Motif 4序列為F-box結(jié)構(gòu)域序列信息。4個(gè)保守功能域分別對(duì)應(yīng)Motif 4、Motif 6、Motif 5、Motif 1保守基序(圖3)。

圖2 白菜TLP基因家族結(jié)構(gòu)分析

圖3 白菜TLP家族氨基酸序列比對(duì)

2.4 白菜與擬南芥、番茄、水稻TLP家族系統(tǒng)發(fā)育分析

由系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)可知，TLP家族被劃分為3個(gè)亞族，其中亞族A包括1個(gè)BrTLP、1個(gè)AtTLP和1個(gè)OsTLP，亞族B包括3個(gè)BrTLP、2個(gè)AtTLP、4個(gè)SlTLP和1個(gè)OsTLP，亞族C包括10個(gè)BrTLP、8個(gè)AtTLP、7個(gè)SlTLP和12個(gè)Os-TLP。白菜和擬南芥、番茄、水稻的TLP家族成員進(jìn)化關(guān)系較近，推測(cè)其直系同源基因之間可能存在相似的功能。

圖4 白菜、擬南芥、番茄、水稻TLP家族進(jìn)化樹

2.5 白菜TLP基因家族染色體定位及與擬南芥基因的共線性分析

通過TBtools工具對(duì)白菜與擬南芥的TLP基因家族成員進(jìn)行共線性分析(圖5)，結(jié)果顯示，有10個(gè)白菜TLP家族成員在擬南芥TLP家族中找到了對(duì)應(yīng)的直系同源基因，表明TLP基因家族在白菜與擬南芥間有較高的保守性。

圖5 白菜與擬南芥TLP基因家族共線性分析

根據(jù)基因位置信息對(duì)14個(gè)BrTLP基因家族染色體進(jìn)行定位分析(圖6)，結(jié)果顯示其不均勻分布在大白菜7條染色體上，其中7號(hào)染色體上的基因最多，有3個(gè)成員；其次是8號(hào)、10號(hào)染色體上有2個(gè)基因成員；1號(hào)、2號(hào)、6號(hào)、9號(hào)分別各有1個(gè)基因成員。

圖6 白菜TLP基因在染色體上的分布

2.6 白菜TLP基因家族順式作用元件分析

通過對(duì)白菜TLP基因家族啟動(dòng)子上游2 000 bp的序列進(jìn)行順式作用元件分析(圖7)發(fā)現(xiàn)，14條白菜TLP基因中均含有光響應(yīng)元件，除了BrTLP9、BrTLP11、BrTLP14，其他11個(gè)基因均含有脫落酸響應(yīng)元件，且BrTLP12最多；除了BrTLP4、BrTLP5、BrTLP10、BrTLP12、BrTLP13，其他基因均含有赤霉素響應(yīng)元件和生長(zhǎng)素響應(yīng)元件；除了BrTLP7，其他基因均含有厭氧響應(yīng)位點(diǎn)，且BrTLP14含量最多，推測(cè)其可能在厭氧逆境脅迫中起重要作用。除了BrTLP4、BrTLP8、BrTLP11、BrTLP14、BrTLP13，其他9個(gè)基因均含有茉莉酸甲酯響應(yīng)元件，6個(gè)白菜TLP基因含有水楊酸響應(yīng)元件和干旱響應(yīng)元件。

圖7 白菜TLP基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

2.7 白菜TLP基因家族亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

白菜TLP基因家族主要集中在細(xì)胞核、線粒體和細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)(表3)，其次為葉綠體、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞骨架。細(xì)胞核中所有的基因均有定位，在線粒體中僅有BrTLP2、BrTLP3、BrTLP14沒有定位信號(hào)，僅有BrTLP6定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。每個(gè)基因在不同細(xì)胞器中的表達(dá)位置和表達(dá)量各不相同，推測(cè)這與基因所執(zhí)行的功能有關(guān)。

表3 白菜TLP基因家族亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

2.8 白菜TLP基因家族表達(dá)分析

2.8.1 組織特異性表達(dá)分析 以根的表達(dá)量為對(duì)照，大多數(shù)BrTLPs在白菜花中表達(dá)量較高，在莖、葉和果莢中的表達(dá)量與根相似。其中BrTLP14在果莢、葉和莖中的表達(dá)量最高，BrTLP5在花中的表達(dá)量最高，同時(shí)在花中表達(dá)量較高的基因還有BrTLP8、BrTLP10(圖8)。

圖8 BrTLPs在大白菜不同器官中的表達(dá)

2.8.2 鹽脅迫下的基因表達(dá)分析 由圖9可知，隨著鹽脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，BrTLP2、BrTLP6兩個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)；BrTLP4、BrTLP7、BrTLP10、BrTLP13的相對(duì)表達(dá)量均在2 h時(shí)最高，包括BrTLP5在內(nèi)均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)；BrTLP1、BrTLP3、BrTLP8、BrTLP9、BrTLP11、BrTLP12相對(duì)表達(dá)量較低；BrTLP14在鹽脅迫12h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高。

圖9 鹽脅迫下白菜TLP基因家族表達(dá)分析

3 討論與結(jié)論

在動(dòng)植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中，TLP家族在維持細(xì)胞正常生理功能及應(yīng)對(duì)脅迫過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。本研究通過雙向Blast在白菜基因組中初步完成了白菜TLP家族成員的鑒定，并對(duì)其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、保守性及表達(dá)特性進(jìn)行了初步分析，為后續(xù)探究白菜中TLP基因功能奠定了基礎(chǔ)。

白菜與擬南芥在進(jìn)化上具有較近的祖先，而白菜經(jīng)歷的全基因組三倍化(WGT)事件導(dǎo)致了其與擬南芥在基因組層面上的一些差異。根據(jù)WGT理論，白菜TLP基因數(shù)量應(yīng)為擬南芥的三倍左右[24]，而本研究結(jié)果表明BrTLP家族數(shù)量并未出現(xiàn)顯著增加。在其他幾種植物中發(fā)現(xiàn)的TLP基因家族成員數(shù)量均為十幾個(gè)，表明在不同物種之間具有高度的保守性，白菜與擬南芥TLP基因家族的共線性分析也證明了兩個(gè)物種間顯著的共線性關(guān)系。在動(dòng)物中的研究表明盡管Tubby結(jié)構(gòu)域高度保守，但不同TLP基因成員在功能上卻無法相互補(bǔ)償[25]，推測(cè)在進(jìn)化過程中TLP家族可能丟棄了部分冗余基因，僅保留了現(xiàn)有的少數(shù)成員高度參與眾多真核生物生長(zhǎng)發(fā)育中的調(diào)控過程。

基因結(jié)構(gòu)與蛋白序列的解析為相關(guān)基因生物學(xué)功能的研究奠定了基礎(chǔ)。對(duì)白菜TLP基因家族結(jié)構(gòu)及保守基序進(jìn)行分析表明，白菜TLP家族在進(jìn)化上距離較近成員之間的基因結(jié)構(gòu)具有一定相似性，而與距離較遠(yuǎn)的成員基因結(jié)構(gòu)存在一定差異，暗示了家族成員在生物學(xué)功能上可能存在不同。另外，保守基序分析表明白菜TLP家族成員雖然在基因結(jié)構(gòu)上存在一定差異，但部分序列仍具有很強(qiáng)的保守性。非保守區(qū)段氨基酸序列的變化導(dǎo)致了白菜TLP家族在多物種TLP家族進(jìn)化樹中的不均勻分布，這也進(jìn)一步暗示了該家族不同成員間的生物學(xué)功能可能存在較大差異，而在物種間進(jìn)化距離較近的TLP成員在功能上可能高度保守。

以往研究證明TLP基因家族在植物應(yīng)對(duì)非生物脅迫過程中發(fā)揮了重要調(diào)控作用。本研究發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)白菜TLP成員均對(duì)鹽脅迫有不同程度的響應(yīng)，其中BrTLP10在鹽脅迫發(fā)生后的4～12 h表達(dá)明顯降低，對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)十分顯著。研究表明，擬南芥中的基因AtTLP9在響應(yīng)鹽脅迫及干旱脅迫過程中具有重要作用[13]，多物種TLP進(jìn)化分析的結(jié)果表明BrTLP10與AtTLP9在進(jìn)化上距離最近，另外，在白菜與擬南芥的共線性分析中也表明這兩個(gè)成員存在一定共線性關(guān)系[10]。根據(jù)AtTLP10現(xiàn)有的研究推測(cè)BrTLP9不僅參與鹽脅迫響應(yīng)，可能也在白菜應(yīng)對(duì)干旱脅迫過程中具有重要作用，但其在鹽脅迫下的具體調(diào)控機(jī)理以及是否在白菜應(yīng)對(duì)干旱脅迫的過程中發(fā)揮作用還有待進(jìn)一步研究。