孟鑫王慶美侯夫云李愛賢董順旭周媛媛秦楨張立明

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 青島 266109；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃淮海薯類科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，山東 濟(jì)南 250100；3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250100；4.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014)

甘薯(Ipomoea batatasL.)為旋花科甘薯屬的藤本植物，是我國重要的糧食和經(jīng)濟(jì)作物[1]。因具有高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、適應(yīng)性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)效益好等諸多優(yōu)勢，甘薯種植遍布世界100多個(gè)國家[2]。塊根作為甘薯的重要收獲器官，富含淀粉、維生素和礦質(zhì)元素等營養(yǎng)物質(zhì)[3]，其中淀粉的含量和組成是甘薯產(chǎn)量和品質(zhì)的主要決定因素[4]。

堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)是家族成員眾多的一類轉(zhuǎn)錄因子，在真核生物轉(zhuǎn)錄因子中分布最廣泛、最保守[5]。bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族具有一個(gè)bZIP結(jié)構(gòu)域，由堿性區(qū)和亮氨酸拉鏈區(qū)兩部分組成，堿性區(qū)含有識別并結(jié)合啟動(dòng)子上特定序列N-x7-R/K的基序；亮氨酸拉鏈區(qū)具有寡聚功能，行使轉(zhuǎn)錄激活或抑制功能。bZIP蛋白不僅參與植物的生長發(fā)育過程，而且參與響應(yīng)逆境脅迫[6]。

有研究表明，bZIP轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控淀粉代謝途徑。ZmbZIP22基因過表達(dá)導(dǎo)致玉米和水稻中糖的含量、淀粉的結(jié)構(gòu)和含量以及淀粉合成基因的表達(dá)水平發(fā)生變化[7]。bZIP基因參與木薯ABA信號通路且影響塊根淀粉積累[8]。然而bZIP轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)甘薯淀粉代謝途徑中的作用尚不清楚。本研究以濟(jì)薯25為材料，克隆得到IbbZIP22的基因序列及其啟動(dòng)子序列，并對其含有的順式元件及在濟(jì)薯25和徐紫薯8號中的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，以期為深入研究IbbZIP22基因功能及進(jìn)一步解析該基因調(diào)節(jié)甘薯淀粉代謝的機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2021年11月在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所甘薯試驗(yàn)基地進(jìn)行。本研究用到的植物材料有甘薯栽培品種濟(jì)薯25(淀粉含量為22.6%)和徐紫薯8號(淀粉含量為18.0%)。將兩個(gè)甘薯品種的塊根種于大棚中的花盆內(nèi)，重復(fù)3次，30 d后剪取長勢良好且大小一致、長度約為10 cm的甘薯嫩枝若干，在24℃恒溫室用Hoagland營養(yǎng)液進(jìn)行水培，14 d后分別對塊根、須根、莖、葉取樣，經(jīng)液氮快速冷凍，置于-80℃超低溫冰箱保存，用于后續(xù)表達(dá)分析。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1IbbZIP22基因克隆 使用Trizol法提取濟(jì)薯25塊根的總RNA，使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。以野生甘薯(Ipomoea trifida)的ItZIP22基因CDS序列為模板，用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)克隆引物(表1)，以濟(jì)薯25的cDNA為模板，使用LA酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為20μL:10×Buffer 2μL，dNTPmix 1μL，正反向引物各0.5μL，cDNA模板1μL，LA酶0.2μL，ddH2O補(bǔ)足到20μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性2 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，68℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；68℃延伸5 min。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用DNA膠回收試劑盒(TIANGEN，北京)回收目的片段；將目的片段連接007VS-T載體并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)中，挑選陽性克隆送青島擎科有限公司測序，保存測序正確菌液，完成克隆。

1.2.2IbbZIP22基因的生物信息學(xué)分析 使用NCBI ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)分析基因的ORF序列；利用NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析IbbZIP22蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；利用ExPASy(http://web.expasy.org/protparam/)在線工具分析IbbZIP22蛋白的理化性質(zhì)；利用SOPMA(http://pbil.ibcp.fr/)在線網(wǎng)站對IbbZIP22蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測；利用SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)對IbbZIP22蛋白的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測；利用Cell-PLoc 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plantmulti/)對IbbZIP22蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測；在NCBI數(shù)據(jù)庫中選取不同物種的bZIP22同源蛋白，利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.3IbbZIP22基因在兩個(gè)甘薯品種不同部位的表達(dá)分析 根據(jù)獲得的IbbZIP22基因的全長cDNA序列，設(shè)計(jì)qRT-PCR引物(表1)。使用Trizol法分別提取濟(jì)薯25和徐紫薯8號的莖、葉、須根和塊根的總RNA并合成cDNA，以IbActin序列為內(nèi)參，以兩個(gè)甘薯品種莖、葉、須根和塊根的cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，該反應(yīng)在羅氏公司的LightCycler?480ⅡPCR儀上進(jìn)行。每個(gè)樣品設(shè)置3次重復(fù)，基因相對表達(dá)量的計(jì)算采用2-ΔΔCt法。

1.2.4IbbZIP22基因的啟動(dòng)子克隆與分析 根據(jù)IbbZIP22基因的cDNA序列，在I.trifida數(shù)據(jù)庫中預(yù)測IbbZIP22基因上游2 000 bp的序列作為啟動(dòng)子擴(kuò)增模板，利用濟(jì)薯25葉片基因組DNA、bZIP-pro-S1/A1引物(表1)擴(kuò)增啟動(dòng)子序列，連接純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物至007VS-T克隆載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，陽性克隆送青島擎科生物技術(shù)有限公司測序，測序正確的序列利用PlantCARE在線進(jìn)行順式作用元件預(yù)測和分析。

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 IbbZIP22基因的克隆

利用引物bZIP-S1和bZIP-A1，以濟(jì)薯25塊根cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增及電泳檢測，得到1 400 bp左右的目的條帶(圖1)。經(jīng)測序，得到大小為1 368 bp的IbbZIP22基因CDS序列(圖2)。

圖1 IbbZIP22基因的克隆

圖2 IbbZIP22基因cDNA序列和編碼氨基酸序列

2.2 IbbZIP22基因的生物信息學(xué)分析

經(jīng)ORF finder分析，IbbZIP22基因開放閱讀框全長1 368 bp，編碼455個(gè)氨基酸(圖2)。利用NCBI分析保守結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)該基因在第313～376位氨基酸殘基上有bZIP＿plant＿RF2保守結(jié)構(gòu)域(圖3)，推測其屬于RF2類bZIP轉(zhuǎn)錄因子。

圖3 IbbZIP22基因的保守結(jié)構(gòu)域分析

使用ExPASy在線分析IbbZIP22表達(dá)蛋白，推測該蛋白分子式為C2116H3402N632O702S24，相對分子量為49.6 kDa，其理論等電點(diǎn)為6.10，負(fù)電荷殘基總數(shù)和正電荷殘基總數(shù)分別為58和52；推測其半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為56.65，脂肪族指數(shù)為65.21，親水性總平均值為-0.649，推測IbbZIP22蛋白為親水、不穩(wěn)定蛋白。

通過SOPMA在線網(wǎng)站對IbbZIP22蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明該蛋白含有α螺旋37.80%，β轉(zhuǎn)角1.54%，折疊延伸鏈3.30%和無規(guī)卷曲57.36%(圖4)；通過SWISS-MODEL預(yù)測并構(gòu)建IbbZIP22蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型(圖5)；通過Cell-PLoc2.0對IbbZIP22蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，預(yù)測該蛋白位于細(xì)胞核中。

圖5 IbbZIP22蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建甘薯(Ipomoea batatasL.)和煙草(Nicotianatabacum，XP＿016451524)、可 可(Theobromacacao，XP＿017971734)、木 薯(Manihot esculenta，XP＿021610187)、三裂葉薯(Ipomoea triloba，XP＿031125140)、牽牛(Ipomoea nil，XP＿01916537)等16種植物基于bZIP同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果(圖6)表明，甘薯的bZIP22蛋白與三裂葉薯的RF2a-like蛋白親緣關(guān)系最近，其次是煙草的bZIP19-like蛋白，與月季、山梨獼猴桃的bZIP蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，符合系統(tǒng)分類學(xué)特征。

圖6 IbbZIP22蛋白與其他植物同源蛋白進(jìn)化分析

2.3 IbbZIP22基因在兩個(gè)甘薯品種不同部位的表達(dá)分析

以IbActin作為內(nèi)參基因，對濟(jì)薯25和徐紫薯8號不同部位中IbbZIP22基因的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果(圖7)表明，IbbZIP22基因在兩個(gè)品種的葉、莖、須根和塊根中均有不同程度的表達(dá)，且均以塊根中的表達(dá)量最高，顯著高于在其他部位中的表達(dá)量。IbbZIP22基因在濟(jì)薯25須根中、在徐紫薯8號葉中的表達(dá)量最低，顯著低于其他部位。比較IbbZIP22在兩個(gè)品種塊根中的表達(dá)量(圖8)發(fā)現(xiàn)，IbbZIP22基因在濟(jì)薯25塊根中的表達(dá)量顯著高于徐紫薯8號，是徐紫薯8號的1.39倍。

圖7 IbbZIP22基因在兩個(gè)甘薯品種中的表達(dá)模式分析

圖8 IbbZIP22基因在兩個(gè)甘薯品種塊根中的相對表達(dá)量

2.4 IbbZIP22基因的啟動(dòng)子克隆與分析

以濟(jì)薯25基因組DNA為模板，通過PCR反應(yīng)克隆得到長度為1 688 bp的啟動(dòng)子片段(圖9)。利用PlantCARE在線軟件對IbbZIP22基因的啟動(dòng)子進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)序列中除了含有TATAbox、CAAT-box等啟動(dòng)子核心元件，還包括光響應(yīng)元件(GT1-motif，TCT-motif，MRE，ACE)、干旱脅迫的MYB響應(yīng)元件(MBS)、參與低溫響應(yīng)的順式作用元件(LTR)、玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控中的順式調(diào)控元件(O2-site)、厭氧誘導(dǎo)元件(ARE)及茉莉酸甲酯(TGACG-motif，CGTCA-motif)、脫落酸(ABRE)等激素相關(guān)的響應(yīng)元件，以及一些功能未知的元件如MYB、MYC和STRE(表2)。

表2 IbbZIP22基因啟動(dòng)子作用元件分析

圖9 IbbZIP22基因啟動(dòng)子的克隆

3 討論與結(jié)論

堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)家族的轉(zhuǎn)錄因子是真核生物許多器官發(fā)育和生理過程的主要調(diào)節(jié)因子，包括形態(tài)發(fā)生、種子形成、非生物和生物脅迫反應(yīng)[9，10]。本研究從濟(jì)薯25中克隆出IbbZIP22基因，根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域分析IbbZIP22蛋白含有bZIP＿plant＿RF2保守結(jié)構(gòu)域，推測其屬于RF2類bZIP轉(zhuǎn)錄因子。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，IbbZIP22蛋白與三裂葉薯的RF2a-like蛋白具有較高的同源性。

植物bZIP轉(zhuǎn)錄因子的研究進(jìn)展大多與其參與非生物脅迫和發(fā)育有關(guān)，如種子成熟、花和維管發(fā)育、脅迫信號和病原體防御[11]。近年來，在小麥和玉米中bZIP轉(zhuǎn)錄因子參與淀粉合成的機(jī)理也逐漸被深入研究，結(jié)果表明，在過度表達(dá)TubZIP28的小麥中，成熟籽粒中的總淀粉含量升高，說明TubZIP28上調(diào)淀粉合成[12]。塊根是甘薯貯存營養(yǎng)的器官，淀粉在甘薯塊根中大量存在[13]。本研究選用濟(jì)薯25和徐紫薯8號兩個(gè)品種，對它們不同部位中IbbZIP22基因的表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該基因在兩個(gè)品種塊根中均表達(dá)量最高。淀粉型品種濟(jì)薯25的淀粉含量為22.6%，比淀粉含量18.0%的徐紫薯8號略高，本研究發(fā)現(xiàn)，IbbZIP22基因在濟(jì)薯25號塊根中的表達(dá)量顯著高于徐紫薯8號，是徐紫薯8號的1.39倍，與這兩個(gè)品種淀粉含量的高低趨勢一致，因此推測IbbZIP22基因參與了淀粉的合成和代謝。

啟動(dòng)子是基因表達(dá)調(diào)控的重要元件。本研究發(fā)現(xiàn)IbbZIP22基因啟動(dòng)子上不僅包含核心元件TATA-box、CAAT-box等，還包含參與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)，推斷該基因可能受MYB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。此外，IbbZIP22基因啟動(dòng)子序列上還包含玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控中的順式調(diào)控元件，有研究表明，bZIP型轉(zhuǎn)錄因子ZmbZIP22可以直接與27 kDγ-玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)節(jié)27 kDγ-玉米醇溶蛋白基因的表達(dá)[14]，因此，在甘薯中是否可能存在相應(yīng)的調(diào)控機(jī)制也值得被深入探討。該啟動(dòng)子也含有參與干旱、低溫和光響應(yīng)元件及與茉莉酸甲酯(MeJA)和脫落酸(ABA)反應(yīng)的順式作用元件，說明IbbZIP22基因可能在甘薯非生物脅迫應(yīng)答等過程中發(fā)揮作用，而且該基因的表達(dá)可能受MeJA和ABA等激素的調(diào)控。

本研究克隆了甘薯的IbbZIP22基因及其啟動(dòng)子，并對該基因在不同淀粉含量品種中的表達(dá)進(jìn)行了分析，可為探究甘薯抗逆和淀粉調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)，并為進(jìn)一步明確IbbZIP22基因的功能奠定基礎(chǔ)。