穆麗君，管 冰，田娟華，杜岳峰，李旭東

(西安交通大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710061)

前列腺癌(prostate cancer,PCa)是發(fā)達國家男性最常見的癌癥，2008年約有64.84萬例新發(fā)病例和13.65萬例死亡病例[1]。目前，雄激素剝奪療法是轉(zhuǎn)移性PCa的主要治療方法，然而許多患者卻出現(xiàn)了去勢抵抗PCa，使得治療效果不甚理想，這也是發(fā)達國家男性病例死亡的主要原因[2]。因此，我們迫切需要進一步的研究來開發(fā)更有效的治療方法。

microRNA(miRNA)是一類非編碼單鏈RNA，通過結合靶基因mRNA的3’-UTR來調(diào)節(jié)腫瘤相關基因的表達[3-5]。已有研究報道，miRNAs(miR)在人類癌癥生物學過程中發(fā)揮著重要作用，包括腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、遷移和轉(zhuǎn)移[6-8]。就PCa的進展而言，miR-34a可通過直接抑制CD44[9]從而抑制PCa干細胞(cancer stem cell，CSC)特性和癌細胞轉(zhuǎn)移；miR-132/212可通過靶向SOX4抑制TGF-β介導的PCa細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)[10]。腫瘤抑制性miR-29可靶向PCa中的LAMC1抑制癌細胞遷移和侵襲[11]。我們先前的研究也報道了miR-218在PCa中起到腫瘤抑制的作用，但miR-218在調(diào)節(jié)PCa干細胞和EMT中的作用仍不明確。為此，本研究就miR-218在PCa細胞系中的表達及在體外實驗中對PCa細胞系遷移、EMT和腫瘤干細胞特性的影響作一探索并報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞系與細胞培養(yǎng)PCa細胞系LNCaP和C4-2購買自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American type culture collection，ATCC)，前列腺-上皮細胞(BPH-1)細胞由美國德克薩斯州達拉斯德克薩斯大學西南醫(yī)學中心Jer-Tsong Hsieh博士提供。這3種細胞均培養(yǎng)于添加了10% 胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(Hyclone， GE Healthcare Life Sciences)的RPMI-1640培養(yǎng)基中(Gibco，Thermo Fisher Scientific)，培養(yǎng)條件為37 ℃，5%(體積分數(shù))CO2。

1.2 總RNA提取和qPCR分析依據(jù)試劑使用說明，應用Trizol(Thermo Fisher Scientific)從收獲的細胞中提取總RNA，并使用miSccript Ⅱ RT試劑盒(Qiagen，GmbH，Hilden)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。CFX96 PCR系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories)和SYBR-Green PCR Master Mix(TaKaRa Bio)用于檢測miR-218的轉(zhuǎn)錄表達。PCR反應程序如下：95 ℃下30 s，然后在95 ℃下40次循環(huán)每次5 s，最后在60 ℃下30 s。使用U6作為內(nèi)參，并使用2-ΔΔCq方法計算相對基因表達[12]。使用的引物序列如下：miR-218正向引物5’-CGA GTG CAT TTG TGC TTG ATC TA-3’，反向引物5’-TAA TGG TCG AAC GCC TAA CGT C-3’；U6正向引物5’-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3’，反向引物5’-TGG TGT CGT GGA GTC G-3’。

1.3 慢病毒轉(zhuǎn)染LNCaP和C4-2細胞接種培養(yǎng)皿并培養(yǎng)24 h，在細胞融合度達到40%～50%時進行慢病毒轉(zhuǎn)染。委托上海吉瑪制藥技術有限公司構建慢病毒載體3(LV3-miR-218)，和LV3加擾慢病毒載體(LV3-NC)作為陰性對照，用于隔夜培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細胞。慢病毒感染細胞后48 h，通過嘌呤霉素(2～3 μg/mL)(Sigma-Aldrich)抗性培養(yǎng)維持miR-218過表達組和對照組的穩(wěn)定克隆。

1.4 Transwell遷移試驗在24孔板內(nèi)加入1 mL含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基作為趨化劑。將孔徑為8 μm的Transwell小室(Millipore)放入24孔板中，再將懸浮在無血清培養(yǎng)基中的細胞以(5～8)×104個細胞/mL的密度接種到小室上層，接種體積為400 μL/孔。培養(yǎng)20 h后，用40 g/L多聚甲醛固定30 min，接著用棉簽輕擦除上室表面未穿出的細胞，然后將小室在室溫下用0.1%結晶紫染色20 min，最后用PBS清洗干凈。在顯微鏡下觀察，放大200倍，每孔隨機選6個視野進行計數(shù)。

1.5 蛋白印跡實驗用提前在4 ℃預冷的PBS涮洗細胞，然后加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取蛋白，接著通過Bradford法進行蛋白質(zhì)濃度定量(Abcam)。每份樣品取30 μg蛋白質(zhì)所需的體積，通過12%SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜中。轉(zhuǎn)膜完成后，將膜在室溫下于50 g/L脫脂牛奶中封閉1 h，然后將膜孵育在一抗中，4 ℃過夜。應用一抗?jié)舛燃皩浱柸缦拢篏APDH (1∶10 000;貨號KC-5G4; 康成生物); E-cadherin (1∶1 000; 貨號sc-8426; Santa Cruz); Vimentin (1∶200; 貨號sc-6260; Santa Cruz); CD44 (1∶800; 貨號 3 570; Cell Signaling Technology); Oct4 (1∶500; 貨號 ab18976; Abcam); Nanog (1∶200;貨號 ab21624; Abcam)。接著將膜在含有0.1%吐溫(Tween)的三緩沖鹽水(tris-buffered saline)中緩慢洗滌3次，并與辣根過氧化物酶結合的二抗山羊抗兔IgG(1∶2 000；貨號ZB-2301，傲銳東源)或山羊抗鼠IgG(1∶2 000；貨號ZB-2305，傲銳東源)在室溫下孵育1 h。最后使用分子成像儀ChemiDoc XRS系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories)對蛋白質(zhì)條帶進行成像。

1.6 平板克隆形成實驗6孔板中每孔接種約2×103個細胞，孵育10～14 d。用PBS涮洗3次，接著用40 g/L多聚甲醛在室溫固定30 min，再用0.1%結晶紫染色20 min，用PBS清洗干凈后，對每孔的細胞克隆進行計數(shù)。

1.7 腫瘤成球?qū)嶒炘诘驼掣叫?孔板中每孔接種約1×104個細胞，添加無血清F12培養(yǎng)基，及20 ng/mL表皮生長因子，10 ng/mL基礎成纖維細胞生長因子以及2% B27(皆來自Invitrogen; Thermo Fisher Scient)。培養(yǎng)2周后，使用倒置顯微鏡放大200倍觀察細胞成球情況。

1.8 統(tǒng)計學方法所有統(tǒng)計分析均使用GraphPad Prism 6.0版本進行。兩組之間的差異采用t檢驗比較；3組及以上的比較，采用單因素方差分析和Tukey法檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 miR-218在PCa細胞中表達下調(diào)應用RT-qPCR比較PCa細胞和人正常前列腺上皮細胞(BPH-1)miR-218的表達。結果顯示，與人正常BPH-1相比，PCa細胞系LNCaP和C4-2中miR-218的表達顯著下調(diào)(U6作為內(nèi)參)。

2.2 構建穩(wěn)定的過表達miR-218的PCa細胞系為了揭示miR-218對PCa細胞遷移、EMT以及CSC特性的影響，我們通過搭載LV3-miR-218的慢病毒載體轉(zhuǎn)染PCa細胞系LNCaP和C4-2，構建了2種穩(wěn)定過表達miR-218的PCa細胞系，接著RT-qPCR檢驗過表達效率。

2.3 過表達miR-218可抑制PCa細胞遷移和EMTTranswell遷移實驗結果表明，miR-218過表達抑制了LNCaP和C4-2細胞的遷移(圖1)。同時EMT標記物的Western blot結果顯示，miR-218過表達導致E-鈣黏蛋白(E-Cadherin)表達輕微增加，波形蛋白(vimentin)表達顯著降低。以上結果說明，miR-218的過度表達可抑制PCa細胞的遷移和EMT。

A：miR-218過表達抑制了LNCaP細胞的遷移；B：在C4-2細胞中也觀察到類似的結果。以上數(shù)據(jù)代表3個獨立實驗(×200)。與LV3-NC相比，*P<0.05。miR-218：microRNA-218；LV3：慢病毒載體3；NC，陰性對照。

2.4 過表達miR-218可抑制PCa細胞CSC特性在驗證miR-218過表達可抑制PCa細胞遷移和EMT之后，我們通過Western blot實驗對癌癥干細胞標記物進行蛋白質(zhì)表達譜分析。結果表明，miR-218的過表達能夠下調(diào)CD44、Oct4和Nanog的表達。此外，我們進行平板克隆形成實驗以進一步評估PCa細胞的自我更新能力。結果表明，與對照組細胞相比，過表達miR-218的LNCaP細胞形成的細胞克隆更少、更小(圖2A)。在C4-2細胞中進行的平板克隆形成實驗也獲得了類似的結果(圖2B)，這表明miR-218可能在腫瘤生長抑制中起關鍵作用。腫瘤成球試驗已被廣泛應用于測量干細胞的自我更新能力，表明miR-218的過表達可降低PCa細胞的干細胞特性。

A：在集落形成試驗中，與對照組LV3-NC細胞相比，LNCaP-LV3-miR-218細胞形成的集落更少、更??；B：C4-2-LV3-miR-218細胞較LV3-NC細胞相比，形成的細胞集落更少且更小。miR-218：microRNA-218；LV3：慢病毒載體3；NC:陰性對照。

3 討 論

近年來，PCa的診斷和治療雖取得了一定的進展[13]，但有關PCa的研究仍具挑戰(zhàn)。據(jù)文獻報道，EMT和CSC對癌癥的發(fā)生和發(fā)展至關重要[14-18]，且先前研究表明，miRNA在人類癌癥生物學過程中也起著重要作用，包括發(fā)生、發(fā)展、遷移和轉(zhuǎn)移[19-23]。miR-218作為腫瘤抑制因子，在多種類型的人類癌癥中表達下調(diào)[24-28]。miR-218可抑制膠質(zhì)瘤、宮頸癌、胃癌和膀胱癌等腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移、EMT、淋巴結轉(zhuǎn)移和自我更新[29-33]。有研究闡明，PCa中miR-218的表達降低，而其可通過抑制富含亮氨酸重復序列的G蛋白偶聯(lián)受體4(leucine-rich repeat containing G protein-coupled receptor 4，LGR4)表達阻止白細胞介素-6(interleukin 6，IL-6)誘導的PCa細胞增殖和侵襲[34]。miR-218還被證明通過抑制TPD52表達進而抑制PCa細胞生長和促進凋亡[35]，并通過靶向LASP1抑制PCa細胞遷移和侵襲[36]。因此，我們推測miR-218也可能抑制PCa細胞的EMT和CSC特性。

在本研究中，miR-218在PCa細胞中的表達顯著下調(diào)，構建過表達miR-218的LNCaP/C4-2細胞可顯著抑制PCa細胞的遷移。Western blot結果顯示，miR-218的過表達下調(diào)了波形蛋白、CD44、Oct4和Nanog的表達。在集落形成試驗中，miR-218過表達細胞所形成的集落比對照組要少且小。此外，與miR-218過表達組的細胞相比，對照組細胞產(chǎn)生的腫瘤球數(shù)量更多，這表明miR-218過度表達可抑制PCa的干細胞特性。

總之，本研究表明miR-218在抑制PCa細胞的遷移、EMT和CSC特性方面起著關鍵作用。這為闡明PCa癌變的潛在機制提供了新的見解，并表明miR-218可能是PCa的潛在治療靶點。