覃 敏， 廖柯熹， 白 楊， 廖呈龍， 韋孟佼

(1. 西南石油大學(xué)石油與天然氣工程學(xué)院油氣儲(chǔ)運(yùn)研究所， 四川 成都 610500；2. 中國(guó)石油西南油氣田公司， 四川 成都 610051； 3. 中國(guó)石油西南油氣田輸氣管理處， 四川 成都 610213)

0 前 言

硫酸鹽還原菌(SRB)是一類(lèi)可以通過(guò)異化作用將硫酸鹽還原為硫離子的原核微生物[1]，并且SRB 種類(lèi)較多，據(jù)統(tǒng)計(jì)，已發(fā)現(xiàn)18 個(gè)屬40 多種SRB。 他們不僅形態(tài)差距大，有桿狀、球狀、卵狀、檸檬形等；并且代謝性能也具有差異，主要體現(xiàn)在異養(yǎng)和自養(yǎng)以及對(duì)溶解氧的耐受程度不同。 此外，學(xué)者在海洋、土壤、污水等缺氧的環(huán)境中發(fā)現(xiàn)了SRB，因此常認(rèn)為SRB 屬于嚴(yán)格厭氧生物[2]。 但隨著對(duì)SRB 認(rèn)識(shí)的不斷深入，學(xué)者發(fā)現(xiàn)部分種群的SRB 趨向于微需氧[3]。

SRB 廣泛存在于石油與天然氣輸送系統(tǒng)中，帶來(lái)腐蝕、環(huán)境污染等危害[4]。 SRB 能利用金屬表面的有機(jī)物作為碳源，并利用氫將硫酸鹽還原為硫化氫，引起腐蝕原電池的陰極去極化反應(yīng)[5]。 由于SRB 特殊的代謝過(guò)程，其對(duì)碳鋼、不銹鋼、合金均能造成嚴(yán)重腐蝕，威脅油氣田安全生產(chǎn)[6，7]。

國(guó)內(nèi)某頁(yè)巖氣管線1 a 內(nèi)連續(xù)發(fā)生7 次集氣管線腐蝕穿孔，經(jīng)過(guò)腐蝕產(chǎn)物分析，存在明顯的SRB 腐蝕特征[8，9]。 南川頁(yè)巖氣田油管在SRB 和CO2的共同作用下發(fā)生腐蝕斷裂[10]。 我國(guó)西南某頁(yè)巖氣井區(qū)井下管柱在淺井段出現(xiàn)SRB 腐蝕并導(dǎo)致了穿孔[11]。 因此，明確頁(yè)巖氣集氣系統(tǒng)內(nèi)硫酸鹽還原菌的類(lèi)別以及代謝特征對(duì)頁(yè)巖氣集氣系統(tǒng)的安全生產(chǎn)以及生物腐蝕控制具有重要意義。

本工作通過(guò)對(duì)頁(yè)巖氣管線水質(zhì)進(jìn)行測(cè)試發(fā)現(xiàn)，頁(yè)巖氣管線中存在大量的SRB。 為此，通過(guò)富集純化后，采用Illumina 高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)SRB 種群進(jìn)行分析，并測(cè)試了SRB 在不同溶解氧含量環(huán)境中的生長(zhǎng)代謝活性，為頁(yè)巖氣含氧集氣管線SRB 腐蝕的防護(hù)提供了參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在頁(yè)巖氣井口平臺(tái)分離器出口采集頁(yè)巖氣集氣管線水樣。 采集到的水樣裝于無(wú)菌密封袋中，并保存在4℃環(huán)境中。

1.2 水質(zhì)理化參數(shù)測(cè)定

采用ICS-5000 多功能離子色譜儀測(cè)定水樣的離子成分。 采用PHS-3C 雷磁pH 計(jì)測(cè)量水樣的pH 值。 采用JPB-607A 雷磁溶解氧測(cè)定儀對(duì)水樣的溶解氧濃度進(jìn)行測(cè)試。 根據(jù)SY/T 0532“油田注入水細(xì)菌分析方法絕跡稀釋法”，采用絕跡稀釋法(MPN)測(cè)量水樣中的硫酸鹽還原菌濃度。

1.3 硫酸鹽還原菌的分離

采用API corrected Postgate’s C 培養(yǎng)基富集SRB。培養(yǎng)基組成如下:1.000 g/L 酵母粉、4.500 g/L Na2SO4、1.000 g/L NH4Cl、0.060 g/L CaCl2·2H2O、0.500 g/L K2HPO4、0.060 g/L MgSO4·7H2O， 6.000 g/L 乳酸鈉，0.004 g/L FeSO4·7H2O 和0.300 g/L 檸檬酸鈉，培養(yǎng)基溶液總體積為1 L，然后用NaOH 調(diào)節(jié)pH 值至7.2[12]。 然后在高溫高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min。1 L培養(yǎng)基中注入1 mL 現(xiàn)場(chǎng)水樣，富集7 d。

將上述培養(yǎng)基煮沸后，通入N2除氧，加入2%(摩爾分?jǐn)?shù))的瓊脂，待溫度降低后，采用富集菌液均勻涂布在平板上，蓋上皿蓋，并裝入?yún)捬醢矊幇湃?7 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)7 d 出現(xiàn)黑色菌落。 將黑色菌落接入API corrected Postgate’s C 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7 d。 重復(fù)多次得到純化的SRB。

1.4 DNA 提取與PCR 擴(kuò)增

取純化后的SRB 菌液10 mL，放入100 mL 離心管中，10 000 r/min 離心10 min，去除上清液，得到黑色沉淀，并在-80 ℃環(huán)境下儲(chǔ)存。

在測(cè)試前，將得到的黑色沉淀在冰上融化并混合均勻后離心，得到菌液的DNA 粗提液。 采用Nano-Drop2000 分光光度計(jì)測(cè)試樣品的DNA 純度和濃度，DNA 純度和濃度若滿足要求則進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。 基于1%(摩爾分?jǐn)?shù))的瓊脂糖凝膠，實(shí)驗(yàn)20 min，電場(chǎng)強(qiáng)度為5 V/cm，采用瓊脂凝膠電泳對(duì)菌液DNA 的完整性進(jìn)行檢測(cè)[13]。

基于Illumina 高通量測(cè)序技術(shù)，采用的3 組引物相關(guān)信息見(jiàn)表1。 以基因組DNA 為模板，對(duì)硫酸鹽還原菌的2 種基因(dsrB、soxB) 進(jìn)行擴(kuò)增。 基因擴(kuò)增(PCR)反應(yīng)溫度條件為: 98 ℃/5 min，98 ℃/30 s，55℃/40 s，72 ℃/1 min，32 個(gè)循環(huán)，72 ℃/7 min[3，14]。

表1 Illumina 高通量測(cè)序引物信息Table 1 Illumina high-throughput sequencing primer information

采用VecScreen(Screen for Vector Contamination，一種用于嵌合體檢測(cè)軟件)在線檢測(cè)工具檢測(cè)嵌合體，采用Mothur 軟件(一種可用于生物信息學(xué)中的微生物生態(tài)群落分析的軟件)將大于或等于90%的有效序列按照相似性歸類(lèi)到統(tǒng)一的OTU(Operational Taxonomic Unit，操作分類(lèi)單元)。

1.5 溶解氧與SRB 生長(zhǎng)特征測(cè)試

實(shí)驗(yàn)溶液選擇API corrected Postgate’s C 培養(yǎng)基250 mL，注入1 mL SRB 富集溶液。 在三口燒杯中，放入溶解氧電極，如圖1 所示。 按比例通入CO2、O2，控制瓶?jī)?nèi)溶解氧的含量。 設(shè)計(jì)溶解氧的濃度梯度分別為0，2.5，4.5，6.5 mg/L。 每隔1 d 通過(guò)取樣口取樣，測(cè)定溶液的pH 值并對(duì)SRB 計(jì)數(shù)。

圖1 SRB 在不同溶解氧條件下的生長(zhǎng)特征測(cè)試裝置Fig. 1 Test device for growth characteristic of SRB under different dissolved oxygen conditions

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 水質(zhì)理化參數(shù)

分離器液相出口水質(zhì)礦化度高達(dá)36 993 mg/L，pH值為6.55，偏酸性，富含K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、CO32-、Cl-、SO42-，其中Cl-含量為21 913 mg/L，SO42-含量為179 mg/L。 采用MPN 計(jì)數(shù)法對(duì)SRB 進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，頁(yè)巖氣集氣管內(nèi)水樣中SRB 濃度為1.1×105個(gè)/mL。 取3 組水樣進(jìn)行溶解氧測(cè)試，水中的溶解氧為3.18 mg/L。

2.2 頁(yè)巖氣集氣管道內(nèi)SRB 種群分析

頁(yè)巖氣集氣管道內(nèi)SRB 樣品經(jīng)過(guò)純化后，樣品純度和濃度測(cè)試結(jié)果為:DNA 溶液OD260/280 的值為2.33，樣品濃度為8.31 μg/μL，表明提取的DNA 純度較高。 樣品Ladder 圖如圖2 所示，提取的DNA 主要為長(zhǎng)度10 000 bp 左右的DNA 片段，條帶較亮且無(wú)其他長(zhǎng)度條帶，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 樣品Ladder 圖Fig. 2 Ladder diagram of sample

圖3 為吸附在頁(yè)巖氣集氣管道中的SRB 的形態(tài)，可見(jiàn)SRB 主要呈桿狀，吸附在管道內(nèi)壁，并在管壁上形成了一層生物腐蝕產(chǎn)物膜。

圖3 吸附在頁(yè)巖氣集氣管道中的SRB 的形態(tài)Fig. 3 Morphology of SRB adsorbed in shale gas gathering pipeline

通過(guò)高通量測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，從門(mén)水平上，頁(yè)巖氣中存在的SRB 主要可以分為3 類(lèi)，分別是Bacteroidota、Firmicutes 和Desulfobacterota。 其中Bacteroidota 的豐度最高，為53.62%，F(xiàn)irmicutes 的豐度次之，為39.4%，Desulfobacterota 的豐度較小，占有7.02%。 以上種群的硫酸鹽還原菌均會(huì)產(chǎn)生H2S。

頁(yè)巖氣SRB 在OTU 水平上的群落分析如圖4 所示，頁(yè)巖氣SRB 存在6 個(gè)OTUs。 其中OTU1 和OTU3含量最大，OTU5 和OTU4 次之，OTU2 和OTU6 含量最小。 Bacteroidota 含有OTU1 和OTU3。 Firmicutes 含有3 個(gè)OTUs，分別是OTU4、OTU5 和OTU6。 Desulfobacterota 只含有OTU2。

圖4 頁(yè)巖氣SRB 在OTU 水平上的群落分析Fig. 4 Community analysis of shale gas SRB at OTU level

2.3 不同濃度溶解氧作用下SRB 的生長(zhǎng)特征

SRB 代謝過(guò)程中，消耗ATP(腺嘌呤核苷三磷酸)和H+，在ATP 硫?；缸饔孟?，激活硫酸根，產(chǎn)生APS(腺苷磷酰硫酸)和PPi(焦磷酸)。 PPi 會(huì)被水解為Pi(磷酸)。 而為了推動(dòng)硫酸根離子活化反應(yīng)向正反應(yīng)方向進(jìn)行，APS 必須通過(guò)APS 還原酶進(jìn)行還原，生成亞硫酸鹽和AMP(腺嘌呤核糖核苷酸)。 亞硫酸進(jìn)一步消耗H+還原為H2S 和水。 在SRB 代謝活動(dòng)中，每消耗10 mol H+會(huì)產(chǎn)生1mol H2S。 因此SRB 代謝越旺盛，溶液的pH 值就會(huì)升高得越快[9，15]。

硫酸根活化:

總反應(yīng):

APS 還原:

亞硫酸鹽還原:

取富集與純化SRB 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 在不同濃度溶解氧條件下，4 組SRB 溶液的pH 值隨試驗(yàn)時(shí)間的變化如圖5 所示，15 d 內(nèi)，溶液的pH 值與初始pH 值相比整體處于上升趨勢(shì)。 其中無(wú)氧環(huán)境和溶解氧濃度為2.5 mg/L條件下的變化趨勢(shì)一致，均為pH 值持續(xù)增大到第9 d后下降并保持穩(wěn)定。 但無(wú)氧條件的pH 值一直高于2.5 mg/L 溶解氧下的pH 值，這是因?yàn)樵跓o(wú)氧條件下，細(xì)菌代謝更為旺盛，需消耗更多的H+。 而在4.5 mg/L 溶解氧下，pH 值總體仍然呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，最后穩(wěn)定在7.5 附近。 在6.5 mg/L 溶解氧下，pH 值在第7 天就穩(wěn)定在7.0附近。 從SRB 代謝原理可知，無(wú)氧條件下，SRB 代謝最為旺盛。 溶解氧濃度為2.5 mg/L 時(shí)，SRB 仍然能夠存活，但代謝程度低于無(wú)氧條件。 在4.5 mg/L 溶解氧的作用下，SRB 代謝活動(dòng)受到了明顯的抑制；而在6.5 mg/L 溶解氧的作用下，SRB 幾乎全部失活。

圖5 不同溶解氧濃度下SRB 溶液的pH 值隨試驗(yàn)時(shí)間的變化Fig. 5 Canges of pH value of SRB solution with test time under different dissolved oxygen concentrations

圖6 為不同溶解氧濃度下SRB 溶液濃度隨試驗(yàn)時(shí)間的變化。

圖6 不同溶解氧濃度下SRB 溶液濃度隨試驗(yàn)時(shí)間的變化Fig. 6 Change of SRB solution concentration with test time under different dissolved oxygen concentrations

在無(wú)氧環(huán)境和2.5 mg/L 溶解氧下，SRB 濃度整體呈明顯的上升趨勢(shì)，但在2.5 mg/L 溶解氧環(huán)境中，SRB的生長(zhǎng)已經(jīng)得到了抑制。 在4.5 mg/L 和6.5 mg/L 溶解氧下，SRB 的生長(zhǎng)幾乎停滯，并且SRB 甚至呈負(fù)增長(zhǎng)，充分說(shuō)明SRB 在高溶解氧環(huán)境下，不僅代謝失活，還發(fā)生了徹底的死亡。

3 結(jié) 論

(1)頁(yè)巖氣集氣管線內(nèi)環(huán)境適宜SRB 生長(zhǎng)繁殖。

(2)頁(yè)巖氣中存在的SRB 主要可以分為3 類(lèi)，分別是Bacteroidota、 Firmicutes 和Desulfobacterota。 其 中Bacteroidota 和Desulfobacterota 均會(huì)產(chǎn)生H2S，從而加速管道腐蝕穿孔，威脅頁(yè)巖氣正常生產(chǎn)。

(3)SRB 在有氧條件下會(huì)受到一定的抑制，但仍然能夠生長(zhǎng)代謝，SRB 耐受氧的極限為4.5 mg/L。