王偉力

胸腹腔積液是臨床常見的病癥，發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，由炎癥、腫瘤等多種因素導(dǎo)致[1]。胸腹腔積液檢查對判定良、惡性疾病的診斷及治療具有重要的意義[2-3]。脫落細(xì)胞學(xué)檢查是病理診斷常規(guī)方法之一，常規(guī)的細(xì)胞學(xué)涂片存在細(xì)胞數(shù)量少、細(xì)胞結(jié)構(gòu)損壞和細(xì)胞涂片厚薄不均等缺陷，導(dǎo)致抗原丟失，細(xì)胞學(xué)診斷的陽性率較低，易發(fā)生漏診[4-6]；并且，細(xì)胞涂片上腫瘤細(xì)胞數(shù)量有限，診斷醫(yī)師較難判斷腫瘤細(xì)胞的來源，也無法進(jìn)行免疫組化或基因檢測等后續(xù)檢測[7]。有研究報(bào)道將這些脫落細(xì)胞學(xué)檢查標(biāo)本制作成細(xì)胞蠟塊，可明顯提高細(xì)胞病理診斷的準(zhǔn)確性[8]。固定液的選擇對整個(gè)細(xì)胞蠟塊最后的陽性檢測率、免疫組化的定量和定性有著重要的作用。因此，本研究采用三種固定液對79例肺腺癌胸水脫落細(xì)胞蠟塊進(jìn)行對比染色，觀察其效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2021年8月至2022年8月湖州師范學(xué)院附屬第一醫(yī)院均診斷為肺腺癌的胸水樣本79例，分別采用4%中性甲醛固定（實(shí)驗(yàn)組1），95%乙醇固定（實(shí)驗(yàn)組2），乙醚-乙醇聯(lián)合4%中性緩沖甲醛固定（實(shí)驗(yàn)組3）制作細(xì)胞蠟塊，以免疫組化Envision法染色。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞蠟塊固定方法及固定后處理 3組實(shí)驗(yàn)均接受細(xì)胞沉渣包埋制塊，沉渣包埋方法為：采集胸水200 ml，先靜置沉淀，倒去上清液，用膠頭滴管吸取3管沉淀物質(zhì)20 ml，實(shí)驗(yàn)組3加入乙醚-乙醇40 ml，作為前固定，靜置10 min后搖勻離心，離心速度控制為2 000 r/min，時(shí)間為10 min，去除上清液，加入40 ml的4%中性緩沖甲醛于沉淀中進(jìn)行后固定，時(shí)間為24 h。實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2均搖勻離心，離心速度控制為2 000 r/min，時(shí)間10 min，分別加入40 ml 4%中性甲醛和95%乙醇于沉淀中，固定24 h。均用濾紙包裹沉淀，常規(guī)脫水，并經(jīng)石蠟包埋、切片。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 采用Envision兩步法，將切片于65℃烤箱過夜，先后經(jīng)二甲苯、梯度乙醇脫蠟。使用Tris/EDTApH9.0直接煮沸法抗原修復(fù)：將pH9.0 Tris/EDTA濃縮液用蒸餾水按1∶50稀釋，配置適量修復(fù)液于不銹鋼鍋中，置于電磁爐上，大功率加熱至沸騰。將電磁爐功率調(diào)到最?。ū貭顟B(tài)），小火煮沸計(jì)時(shí)20 min，終止加熱，室溫放置10 min，自來水沖冷取出切片，將切片浸泡于3%過氧化氫水溶液，室溫孵育10 min后，于PBS浸泡1～2 min/缸（6缸）。于切片上滴加適量吐溫，室溫孵育10～15 min。除去血清（不清洗），切片上分別滴加一抗MC、CK7、Ki-67，室溫孵育1 h，于PBS浸泡1～2 min/缸（6缸）。除去PBS，切片上滴加二抗，室溫下孵育15～25 min；PBS浸泡1～2 min/缸（6缸）。除去PBS，滴加二抗孵育15 min，二氨基聯(lián)苯胺顯色，Harris蘇木素復(fù)染，酒精脫水，二甲苯透明，全自動封片機(jī)封片。

1.3 免疫組化結(jié)果判定 Ki-67表達(dá)定位于細(xì)胞核內(nèi)，CK7表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，MC表達(dá)定位于細(xì)胞膜，陽性染色均為棕黃色。根據(jù)染色強(qiáng)度和表達(dá)的完整性評判IHC染色質(zhì)量：陽性表達(dá)強(qiáng)且標(biāo)志物位置準(zhǔn)確，非特異性染色淡或無，核質(zhì)分明，邊界清楚，判定為優(yōu)良；未達(dá)到上述任何一項(xiàng)則判定為不合格。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以百分率表示，采用2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

采用3種固定液固定的胸水蠟塊在相同腫瘤中均呈陽性，僅用單純的95%乙醇、4%中性甲醛固定液固定的細(xì)胞蠟塊免疫標(biāo)記染色效果欠佳，標(biāo)記稍減弱。采用乙醚-乙醇作前固定、4%中性緩沖甲醛作為后固定的細(xì)胞蠟塊免疫標(biāo)記染色效果最好，標(biāo)記清晰，表達(dá)率高，MC、CK7、Ki-67在3組中的表達(dá)情況差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。Ki-67在實(shí)驗(yàn)組3中呈彌漫、深黃到棕褐色核陽性，見圖1a，在其他實(shí)驗(yàn)組中呈散在分布的核陽性，核呈淺黃到深黃色，部分抗原甚至表達(dá)缺失，見圖1b、c。CK7和MC表達(dá)定位于細(xì)胞膜，在實(shí)驗(yàn)組3中呈棕褐色漿陽性，見圖2a、3a，但在其他實(shí)驗(yàn)組部分細(xì)胞中呈淺黃色或陰性表達(dá)，見圖2b、2c、3b、3c。

圖1 Ki-67表達(dá)情況（Envision法，×100）

圖2 CK7表達(dá)情況（Envision法，×100）

表1 3種抗原標(biāo)記物在各組中的表達(dá)情況（n=79）例（%）

3 討論

傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)涂片缺陷為細(xì)胞離心量少[9]，樣本需反復(fù)多次離心，耗時(shí)長，且大量涂片細(xì)胞存在厚薄不均的現(xiàn)象，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清晰、細(xì)胞重疊及細(xì)胞成團(tuán)等情況，嚴(yán)重影響病理診斷[10]。細(xì)胞蠟塊技術(shù)的應(yīng)用較大程度改善了細(xì)胞的組織學(xué)形態(tài)，更好的保存了細(xì)胞結(jié)構(gòu)，減少抗原丟失[11]。細(xì)胞蠟塊利用胸腹水標(biāo)本制作切片進(jìn)行免疫組化及基因檢測等病理學(xué)檢查，對于腫瘤晚期無法手術(shù)切除的患者進(jìn)行基因靶向治療具有較好的參考價(jià)值。

固定細(xì)胞蠟塊是為了固定組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，防止其變形或破裂，保存細(xì)胞的抗原，提高檢測效率[12]。細(xì)胞蠟塊的固定也是免疫組織化學(xué)染色最初的一個(gè)關(guān)鍵步驟，可以提高抗原檢測的陽性率，彌補(bǔ)組織學(xué)上取材的不足，對診斷醫(yī)生判斷細(xì)胞的來源、分型及評估患者預(yù)后有很大的幫助。細(xì)胞蠟塊的固定要求細(xì)胞核保存好，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，核質(zhì)分明，顏色鮮明[13-14]。

圖3 MC表達(dá)情況（Envision法，×100）

本研究結(jié)果顯示4%中性甲醛為病理組織良好的固定液，但缺乏脫水能力，導(dǎo)致沉淀物不易凝集，細(xì)胞浸于體液中造成細(xì)胞腫脹，結(jié)構(gòu)模糊，胞核不清。95%乙醇固定液穿透能力強(qiáng)，凝集較快，但細(xì)胞嚴(yán)重收縮，胞漿呈泡沫狀，胞核不清，免疫組化標(biāo)記欠佳。通過乙醚-乙醇的前脫水固定及4%中性緩沖甲醛后固定，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，核漿分明，免疫組化定位準(zhǔn)確，抗原量表達(dá)較為完整。前固定中乙醇具有脫水和凝集作用，使細(xì)胞核收縮明顯；乙醚溶解脂肪從而利于細(xì)胞的著色，兩者混合同時(shí)具有固定和脫水作用。固定液中還含有冰醋酸的成分，如體液中含有大量紅細(xì)胞，還可對其進(jìn)行破壞和裂解，防止其造成污染。

綜上所述，通過比較3種固定液對細(xì)胞蠟塊免疫組化染色質(zhì)量的影響，筆者認(rèn)為在胸水細(xì)胞學(xué)的固定過程中，采用乙醚-乙醇作為前固定聯(lián)合4%中性緩沖甲醛作為后固定的細(xì)胞蠟塊，可有效保存細(xì)胞的良好形態(tài)，有效減少抗原丟失，免疫組化染色結(jié)果好，為正確高效的病理診斷提供了重要的技術(shù)支持。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突