王嘉達(dá)，沈志森，沈一鳴，王嘉寧

喉癌是一種常見的頭頸部惡性腫瘤[1]，病理類型主要是鱗狀細(xì)胞癌[2]。雖然近幾十年喉癌全球死亡率有所下降，但是東南亞地區(qū)喉癌疾病負(fù)擔(dān)依然嚴(yán)峻[3]。因而尋求新的治療靶點，抑制腫瘤進(jìn)展，提高喉癌患者的生活質(zhì)量是十分重要的。磷脂作為細(xì)胞膜的重要組成部分，是腫瘤細(xì)胞增殖必要的養(yǎng)分[4]。有研究顯示心磷脂酰基轉(zhuǎn)移酶1（LCLAT1）在肺癌中通過調(diào)節(jié)線粒體動力學(xué)來調(diào)節(jié)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[5]。但是LCLAT1在喉癌中的作用尚不清楚，因此本研究使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析了LCLAT1在喉癌上皮細(xì)胞亞群中的表達(dá)情況，并結(jié)合癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫、Reactome數(shù)據(jù)庫和String數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步分析LCLAT1潛在的作用?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料 來自3例喉鱗癌患者的腫瘤組織、癌旁組織及對應(yīng)的淋巴轉(zhuǎn)移組織共9個樣本用于單細(xì)胞RNA測序，喉癌標(biāo)本20例用于免疫組織化學(xué)實驗，這些標(biāo)本均來自2019年10—12月寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院的患者，本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批號：KY2020PJ191）。在Reactome數(shù)據(jù)庫（https://reactome.org） 下載甘油磷脂合成途徑相關(guān)基因128個。從TCGA數(shù)據(jù)庫下載喉鱗癌基因轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)及對應(yīng)的臨床信息，共123例，其中腫瘤組織111例，正常組織12例。

1.2 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序?qū)嶒?將腫瘤組織切成直徑約3 mm小塊，用磷酸鹽緩沖液（PBS）反復(fù)沖洗，去除表面雜質(zhì)。使用人腫瘤解離試劑盒（Miltenyi Biotec，Cat No.130-095-929，德國）解離組織。經(jīng)由70m細(xì)胞篩過濾及離心機離心后獲得細(xì)胞沉淀，將細(xì)胞再次置于PBS溶液中保存。使用10 XGenomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序平臺捕獲單細(xì)胞、極低量RNA反轉(zhuǎn)錄擴增和DNA文庫構(gòu)建。使用NovaSeq 6000測序平臺進(jìn)行測序。上機要求：樣本存活率＞85%，細(xì)胞濃度700～1200個/l。

1.3 生信分析方法 使用“Seurat”包分析單細(xì)胞測序下游數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)整合及去批次效應(yīng)通過CCA方法尋找錨定點細(xì)胞實現(xiàn)[6]。使用“AUCell”包對細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)功能富集分析。使用“copykat”包鑒定惡性細(xì)胞。采用R軟件（4.1.3版本）“l(fā)imma”包和“survival”包分析128個甘油磷脂合成途徑相關(guān)基因在TCGA喉癌隊列中的表達(dá)水平及與總體生存率的關(guān)系。使用Cytoscape軟件與String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)并鑒定核心基因。

1.4 免疫組織化學(xué)實驗 免疫組化實驗采用Envision兩步法。石蠟切片烘烤后，用常規(guī)二甲苯和乙醇脫臘，然后用PBS洗滌3次，每次3 min。在黑暗環(huán)境下3%過氧化氫孵育10 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶后，切片先后與一抗和二抗孵育。切片用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色，蘇木精復(fù)染，在不同濃度的乙醇中梯度脫水后，然后在病理醫(yī)師的協(xié)助下用顯微鏡檢查。抗原使用兔單克隆抗體LCLAT1[Abcam（ab122197），Cambridge，UK]。

1.5 統(tǒng)計方法 采用R軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，基因差異表達(dá)分析logFC=1。單因素回歸分析采用Cox分析和Kaplan-Meier分析，取交集。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 喉鱗癌單細(xì)胞測序分析 經(jīng)過多重質(zhì)量控制后，獲得50 618個細(xì)胞和36 567個基因用于下游分析。一共識別出10個主要細(xì)胞簇，基于一些經(jīng)典的細(xì)胞標(biāo)記基因，分別命名為上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞、漿細(xì)胞、髓系細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肥大細(xì)胞、漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，見圖1。對上皮細(xì)胞進(jìn)一步聚類，一共識別出11個細(xì)胞簇。使用“AUCell”R包計算每一個上皮細(xì)胞“細(xì)胞周期通路”的活性，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞簇1是細(xì)胞周期活性最高，見圖2左圖淺綠色細(xì)胞簇。使用“copykat”R包鑒定出惡性細(xì)胞主要是細(xì)胞簇0、1、2、4、8，見圖2右圖紅色細(xì)胞。

圖1 通過TSNE和UMAP分別展示喉鱗癌腫瘤微環(huán)境及上皮細(xì)胞異質(zhì)性注：左圖tSNE圖展示喉鱗癌腫瘤微環(huán)境10個主要的細(xì)胞亞群。右圖UMAP圖展示上皮細(xì)胞11個細(xì)胞亞群

圖2 上皮細(xì)胞AUCell和copykat分析結(jié)果

2.2 LCLAT1在喉癌中的表達(dá)分析 單細(xì)胞測序結(jié)果表明在上皮細(xì)胞中LCLAT1主要在細(xì)胞簇c1與c10表達(dá)，簇c1為細(xì)胞增殖活躍的惡性細(xì)胞簇，簇c10整體上遠(yuǎn)離上皮細(xì)胞，僅包含15個細(xì)胞，并且檢測出大量線粒體相關(guān)基因，該細(xì)胞簇是凋亡的細(xì)胞，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖3?；赥CGA喉癌隊列分析，結(jié)果表明LCLAT1在腫瘤組織中高表達(dá)（LogFC=1.214，P＜0.005），128個甘油磷脂合成途徑相關(guān)基因中有30個基因在腫瘤與正常組織中表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），使用這30個基因構(gòu)建了蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，LCLAT1是甘油磷脂合成途徑中的關(guān)鍵基因之一，見圖3。20例喉癌標(biāo)本免疫組織化學(xué)實驗結(jié)果表明LCLAT1在腫瘤組織中高表達(dá)，見圖4。

圖3 LCLAT1在喉癌上皮細(xì)胞中的表達(dá)情況及在甘油磷脂合成途徑中的核心價值

圖4 喉鱗癌腫瘤組織和正常組織的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（HE染色，×7）

2.3 LCLAT1與喉癌預(yù)后的關(guān)系 在30個表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義的基因中，有2個基因與喉癌的總體生存率相關(guān)，其中LCLAT1是危險系數(shù)最高的基因（HR=2.296，95%CI：1.172～4.498，P＜0.05），另外一個是MBOAT2（HR=1.336，95%CI：1.018～1.756，P＜0.05）。單因素和多因素Cox風(fēng)險回歸分析顯示LCLAT1是喉癌的獨立預(yù)后指標(biāo)，見表1～2，ROC曲線分析顯示LCLAT1是喉癌可靠的預(yù)后指標(biāo)，1、3和5年生存率曲線下面積分別為0.657、0.608和0.629。

表1 影響喉癌患者生存預(yù)后的多因素回歸分析

3 討論

本研究使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)重點探討了喉鱗癌上皮細(xì)胞的異質(zhì)性，檢測樣本包含3例喉鱗癌患者的腫瘤組織、癌旁組織及對應(yīng)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織，觀察了LCLAT1在上皮細(xì)胞亞群中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示LCLAT1大部分位于線粒體內(nèi)，主要參與甘油磷脂合成途徑。因此筆者收集了128個甘油磷脂合成途徑相關(guān)基因，分析了它們在喉癌中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系，評估LCLAT1在喉鱗癌甘油磷脂合成途徑中的重要作用。最后通過對20例喉鱗癌標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)實驗驗證了LCLAT1在喉癌腫瘤組織中高表達(dá)，在癌旁組織中低表達(dá)。

表2 影響喉癌患者生存預(yù)后的單因素回歸分析

代謝重編程是癌癥發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的主要特點[7]。線粒體作為各種代謝途徑的交匯點，在癌癥發(fā)展中起著重要作用。心磷脂含有大量不飽和脂肪酸，主要位于線粒體內(nèi)膜，病理情況下可以易位至外膜，調(diào)控氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)等[8-10]。有研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌干細(xì)胞中存在心磷脂結(jié)構(gòu)改變[11]，靶向線粒體功能的治療可以明顯改善癌癥宿主的能量和蛋白質(zhì)代謝[12]。目前已有多種靶向線粒體的納米技術(shù)試圖通過能量代謝干擾、線粒體蛋白干擾及活性氧調(diào)節(jié)等方法治療癌癥[13]。有研究發(fā)現(xiàn)心磷脂可以改變線粒體膜的脂質(zhì)成分，導(dǎo)致膜透化，心磷脂與脂質(zhì)包埋的柔紅霉素共同遞送，可以增加乳腺癌細(xì)胞的藥物攝取量，提高藥物細(xì)胞毒性[14]。將藥物靶向遞送到細(xì)胞器是分子藥理學(xué)的現(xiàn)代趨勢之一[15]。

線粒體對機體免疫系統(tǒng)至關(guān)重要，線粒體的細(xì)胞代謝和代謝編程與先天免疫反應(yīng)密切相關(guān)[16]。免疫細(xì)胞激活后需要大量的能量，供給不同的免疫細(xì)胞線粒體會采取不同的措施，例如在活化的T細(xì)胞中線粒體通過增加糖酵解供給能量，而在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中則通過增加 氧化供能[17]。除了能量供給外，線粒體還可以通過產(chǎn)生三羧酸循環(huán)的活性氧和代謝物來調(diào)控免疫細(xì)胞活化和免疫反應(yīng)的信號級聯(lián)[18]。有研究發(fā)現(xiàn)線粒體特異性心磷脂的從頭合成是CD8+T細(xì)胞維持正常的抗原反應(yīng)性所必需的[19]。心磷脂不光可以影響外周免疫系統(tǒng)，還可以調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫功能[20]。還有研究發(fā)現(xiàn)胞外的心磷脂可以通過Toll樣受體4依賴途徑調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和細(xì)胞毒素[21]。胞質(zhì)接觸的錯位心磷脂還可以作為損傷相關(guān)分子模式通過模式識別受體誘導(dǎo)炎癥，參與干燥綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病[22]。

本文結(jié)果提示LCLAT1是喉癌的危險因素。其主要功能是調(diào)節(jié)心磷脂的代謝以及進(jìn)而調(diào)控線粒體功能，雖然這項研究尚在初始階段，仍需要大量實驗驗證LCLAT1在喉鱗癌甘油磷脂代謝過程中的作用，但是本研究為靶向甘油磷脂代謝途徑或者靶向線粒體的癌癥新治療提供了思路。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明 王嘉達(dá)：實驗操作、論文撰寫；王嘉達(dá)、沈一鳴、王嘉寧：數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計學(xué)分析；沈志森：研究指導(dǎo)、論文修改、經(jīng)費支持