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        不同來(lái)源乳中乳鐵蛋白含量的高通量毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)

        2023-03-04 08:05:42路夢(mèng)凡孫娜娜李香云李漢芳徐丹徐秦峰
        中國(guó)乳品工業(yè) 2023年2期
        關(guān)鍵詞:實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法

        路夢(mèng)凡,孫娜娜,李香云,李漢芳,徐丹,徐秦峰

        (1.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院國(guó)家羊乳制品加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心,西安 710021;2.西安喜洋洋生物科技有限公司,西安 710021)

        0 引 言

        乳鐵蛋白(lactoferrin,LF)是一種活性蛋白[1-4],已廣泛添加在嬰幼兒配方食品和保健品中[5-7]。在不同物種來(lái)源乳中LF的含量差異很大,并且受加工工藝影響[8-10]。因此檢測(cè)各種特色乳品中LF的含量對(duì)其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的評(píng)估十分有必要。

        目前,已經(jīng)建立了多種牛源LF的檢測(cè)方法[11-14]。其中,高效液相色譜法可以用來(lái)測(cè)定不同來(lái)源乳中LF的含量[9,15-18],但由于其對(duì)樣品的純度要求較高,需用肝素親和柱對(duì)樣品進(jìn)行前處理,并且經(jīng)純化后的生鮮羊乳和人乳樣品,其他蛋白依然存在干擾[9]。同樣地,高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用也能夠?qū)Σ煌瑏?lái)源乳中的LF進(jìn)行分析[19],但設(shè)備昂貴,對(duì)操作人員要求較高,缺少?gòu)V泛地適用性。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法電泳分離,也可以半定量不同來(lái)源乳中LF含量[20],但該方法每次檢測(cè)的樣品數(shù)量有限,操作繁瑣且耗時(shí)長(zhǎng)。因此,目前仍缺少快速、簡(jiǎn)便、高通量、無(wú)需復(fù)雜樣品前處理的,具有普適性的不同來(lái)源乳中的LF含量檢測(cè)方法。

        本研究在前期建立的全自動(dòng)高通量毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)牛源乳鐵蛋白(bovine lactoferrin,BLF)的基礎(chǔ)上[21-22],通過篩選分別能夠與人源乳鐵蛋白(human lactoferrin,HLF)、羊源乳鐵蛋白(goat lactoferrin,GLF)特異性結(jié)合的DNA序列,將方法進(jìn)一步拓展到了HLF、GLF的定性定量檢測(cè),驗(yàn)證了該方法的普適性,為不同來(lái)源特色乳中LF含量檢測(cè)提供新方案。

        1 材料與方法

        1.1 試劑和儀器

        DNA1[23](5'-TCC ATG ACG TTC CTC TCC ATG ACG TTC CTC TCC ATG ACG TTC TTC CTC-3')、DNA2[24](5'-AGG CAG GAC ACC GTA ACC GGT GCA TCT ATG GCT ACT AGC TCT TCC TGC CT-3')、DNA3[25](5'-TAG AAG ATC AAA-3'),由上海生工生物工程公司;DL500 bp DNA marker(Takara),100×TE緩沖液以及磷酸鹽緩沖液PBS(Sigma-Aldrich),人源乳鐵蛋白(human lactoferrin,HLF)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)、α1-抗胰蛋白酶(α-antitrypsin from human plasma,AAT)、纖維蛋白原(Fibrinogen from human plasma,F(xiàn)ib)、血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、α-乳白蛋白(α-lactabumin,α-Lac)、β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-LG)、酪蛋白(Casein),Sigma-Aldrich;羊源乳鐵蛋白(goat lactoferrin,GLF),西安優(yōu)博(YOB IOS);全自動(dòng)高通量毛細(xì)管凝膠電泳儀器(Qsep1)及卡夾臺(tái)灣光鼎(Bioptic)公司。

        1.2 實(shí)驗(yàn)材料

        實(shí)驗(yàn)中所用到的母乳來(lái)源于自愿參加此研究的志愿者,羊奶粉購(gòu)于西安市某超市,液態(tài)乳樣品冰箱4℃儲(chǔ)存待用,奶粉樣品常溫儲(chǔ)存待用。

        1.3 檢測(cè)方法

        DNA序列處理:實(shí)驗(yàn)中的DNA序列由1×TE緩沖液溶解至100μmol/L,1×PBS稀釋至1μmol/L。為獲得具有功能性的DNA序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu),使用前對(duì)DNA序列進(jìn)行95±0.5℃,5 min退火處理,冰箱-20℃下2 min冷卻待用。

        選取出的非標(biāo)記-DNA序列(0.5μmol/L)加入濃度梯度(0~150μg/mL)HLF(1 mg/mL),加入1.0μL 20×PBS,加入超純水至最終體系為20μL,混勻孵育30 min后進(jìn)行全自動(dòng)毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)。GLF的樣品檢測(cè)濃度為0~25μg/mL。

        全自動(dòng)毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)參數(shù)為:LED激發(fā)光源:480 nm;檢測(cè)器:PMT熒光檢測(cè)器;進(jìn)樣電壓:4 k V;進(jìn)樣時(shí)間:10 s;分離電壓:8 k V;分離時(shí)間:240 s;毛細(xì)管的有效分離長(zhǎng)度為13 cm。

        瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè):樣品中加入2μL SYBR Gold染料(20×)以及3μL上樣緩沖液(6×)后進(jìn)行電泳。電泳參數(shù):1%的瓊脂糖凝膠,1×TAE電泳緩沖液,電壓為100 V,電泳時(shí)間為30 min。電泳結(jié)束后使用藍(lán)光透射儀觀察電泳結(jié)果。

        1.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

        實(shí)際樣品前處理:新鮮母乳在4℃,12 000 rcf離心處理10 min,取中間層;嬰幼兒奶粉溶解方式為稱取1 g奶粉用超純水定容至7 mL,4℃,12 000 rcf離心處理10 min,取中間層。

        實(shí)際樣品檢測(cè):用所建立的檢測(cè)HLF、GLF的方法,分別檢測(cè)新鮮母乳(取0.5μL)、嬰幼兒奶粉(取3μL)中LF含量。在實(shí)際樣品中加入LF標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行加標(biāo)回收檢測(cè)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 人源乳鐵蛋白的毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)

        在凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)中,選取合適的DNA序列對(duì)LF檢測(cè)的成功實(shí)現(xiàn)至關(guān)重要。在前期LF檢測(cè)中采用的是針對(duì)牛源LF的特異性DNA結(jié)合序列[21,24],但是由于人LF和牛LF的蛋白質(zhì)氨基酸序列僅具有69%的同源性,因此,DNA序列篩選實(shí)驗(yàn)中增加另外兩種能與HLF特異性結(jié)合的DNA序列(DNA2、DNA3)[23,25]。由于毛細(xì)管凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)中無(wú)法觀察到復(fù)合物的電泳峰[21],采用瓊脂糖凝膠電泳表征了上述3條DNA序列用于HLF檢測(cè)的可行性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1(a)所示,3條DNA序列在高濃度HLF存在時(shí),均能夠觀察到明顯的復(fù)合物條帶,但是對(duì)于低濃度HLF,只有DNA1和DNA2能夠出現(xiàn)復(fù)合物條帶,并且DNA2在高濃度HLF時(shí),觀察到二聚體條帶,影響HLF的準(zhǔn)確定量,因此選用DNA1進(jìn)行HLF的毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)。

        由于毛細(xì)管凝膠中已經(jīng)包含了DNA染料,本實(shí)驗(yàn)中直接采用了非標(biāo)記的DNA序列,相比于之前采用的熒光標(biāo)記DNA[21],顯著降低了檢測(cè)試劑成本。將上述選取的DNA1序列分別和不同濃度的HLF標(biāo)準(zhǔn)品孵育后進(jìn)行毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果如圖1(b)所示。不同濃度的HLF與DNA1序列混合的樣品及陰性樣品均出現(xiàn)DNA1序列的峰。由于HLF和DNA1序列特異性結(jié)合,導(dǎo)致體系中剩余的游離DNA1序列減少,含有HLF的樣品的游離DNA信號(hào)和峰面積明顯低于不含HLF的樣品,與前期BLF檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[21]。驗(yàn)證了采用非標(biāo)記DNA序列進(jìn)行HLF定量檢測(cè)的可行性。

        當(dāng)增加HLF的濃度時(shí),觀察到了預(yù)期的游離DNA1電泳峰高降低圖1(b)。以HLF的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo),游離DNA1的峰面積為縱坐標(biāo)繪制工作曲線,線性范圍0~150μg/mL,檢出限11.74μg/mL圖1(c)。特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1(d)所示,只有含HLF的樣品和DNA1序列特異性結(jié)合使得游離DNA1序列的峰面積明顯減少。因此,所建立的毛細(xì)管凝膠電泳方法能夠用于HLF含量的特異性定量檢測(cè)。

        圖1 HLF毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)的DNA序列選擇(a)、線性范圍(b)、(c)和特異性(d)

        2.2 羊源乳鐵蛋白的毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)

        采用同樣的方式驗(yàn)證了GLF的毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)的可行性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。與HLF不同,3條DNA序列中,DNA2對(duì)于低濃度GLF復(fù)合物電泳條帶現(xiàn)象最明顯圖2(a),因此后續(xù)選用DNA2序列用于毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)GLF。隨著GLF濃度的增加,游離DNA2序列峰的面積減少,濃度在0~25μg/m L的范圍內(nèi)均具有良好的線性圖2(c),計(jì)算獲得檢出限3.53μg/m L,低于HLF的11.74μg/mL,表明該方法對(duì)于GLF具有更高的檢測(cè)靈敏度。同時(shí),該方法也具有良好的特異性圖2(d)。

        圖2 GLF毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)的DNA序列篩選(a)、線性范圍(b)、(c)、特異性驗(yàn)證(d)

        2.3 實(shí)際乳品樣品檢測(cè)

        為驗(yàn)證本研究建立的毛細(xì)管凝膠電泳法檢測(cè)HLF、GLF的實(shí)用性,采用上述建立的方法對(duì)母乳及羊奶粉中的LF含量進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果見表1。新鮮母乳中LF的檢測(cè)值為3.25 mg/mL,且加標(biāo)回收率為107.45%,與文獻(xiàn)報(bào)道相符[10]。羊奶粉中未檢出GLF,分別添加1、3、5μL羊乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(0.1 mg/m L),測(cè)得加標(biāo)回收率為85.5%~114.9%。表明本研究建立的毛細(xì)管凝膠電泳可用于實(shí)際樣品中不同來(lái)源LF的簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確檢測(cè)。為添加LF的嬰幼兒配方奶粉以及特色乳營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)提供一定的技術(shù)參考。

        表1 實(shí)際樣品中乳鐵蛋白的檢測(cè)結(jié)果

        3 結(jié) 論

        本實(shí)驗(yàn)建立的毛細(xì)管凝膠電泳快速檢測(cè)HLF和GLF的方法,可實(shí)現(xiàn)母乳及羊奶粉等實(shí)際樣品中不同來(lái)源LF的定量檢測(cè),提高了該方法的通用性。實(shí)驗(yàn)中只需簡(jiǎn)單的離心除脂以防止毛細(xì)管發(fā)生堵塞,不需要復(fù)雜的樣品前處理過程,簡(jiǎn)化了操作,同時(shí)減小了樣品前處理過程中引入的誤差;用非標(biāo)記DNA序列取代熒光標(biāo)記的DNA序列,降低了檢測(cè)成本。本方法準(zhǔn)確度高,重現(xiàn)性較好,適合工廠大批生產(chǎn)嬰幼兒配方羊奶粉及其它奶制品等添加LF含量的測(cè)定。同時(shí),本方法用于多種特色乳源中LF的定量檢測(cè)具有很好的應(yīng)用前景。

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