路夢(mèng)凡，孫娜娜，李香云，李漢芳，徐丹，徐秦峰

（1.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院國(guó)家羊乳制品加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，西安 710021；2.西安喜洋洋生物科技有限公司，西安 710021）

0 引 言

乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）是一種活性蛋白[1-4]，已廣泛添加在嬰幼兒配方食品和保健品中[5-7]。在不同物種來(lái)源乳中LF的含量差異很大，并且受加工工藝影響[8-10]。因此檢測(cè)各種特色乳品中LF的含量對(duì)其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的評(píng)估十分有必要。

目前，已經(jīng)建立了多種牛源LF的檢測(cè)方法[11-14]。其中，高效液相色譜法可以用來(lái)測(cè)定不同來(lái)源乳中LF的含量[9,15-18]，但由于其對(duì)樣品的純度要求較高，需用肝素親和柱對(duì)樣品進(jìn)行前處理，并且經(jīng)純化后的生鮮羊乳和人乳樣品，其他蛋白依然存在干擾[9]。同樣地，高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用也能夠?qū)Σ煌瑏?lái)源乳中的LF進(jìn)行分析[19]，但設(shè)備昂貴，對(duì)操作人員要求較高，缺少?gòu)V泛地適用性。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法電泳分離，也可以半定量不同來(lái)源乳中LF含量[20]，但該方法每次檢測(cè)的樣品數(shù)量有限，操作繁瑣且耗時(shí)長(zhǎng)。因此，目前仍缺少快速、簡(jiǎn)便、高通量、無(wú)需復(fù)雜樣品前處理的，具有普適性的不同來(lái)源乳中的LF含量檢測(cè)方法。

本研究在前期建立的全自動(dòng)高通量毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)牛源乳鐵蛋白（bovine lactoferrin，BLF）的基礎(chǔ)上[21-22]，通過篩選分別能夠與人源乳鐵蛋白（human lactoferrin，HLF）、羊源乳鐵蛋白（goat lactoferrin，GLF）特異性結(jié)合的DNA序列，將方法進(jìn)一步拓展到了HLF、GLF的定性定量檢測(cè)，驗(yàn)證了該方法的普適性，為不同來(lái)源特色乳中LF含量檢測(cè)提供新方案。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

DNA1[23]（5'-TCC ATG ACG TTC CTC TCC ATG ACG TTC CTC TCC ATG ACG TTC TTC CTC-3'）、DNA2[24]（5'-AGG CAG GAC ACC GTA ACC GGT GCA TCT ATG GCT ACT AGC TCT TCC TGC CT-3'）、DNA3[25]（5'-TAG AAG ATC AAA-3'），由上海生工生物工程公司；DL500 bp DNA marker（Takara），100×TE緩沖液以及磷酸鹽緩沖液PBS（Sigma-Aldrich），人源乳鐵蛋白（human lactoferrin，HLF）、免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）、α1-抗胰蛋白酶（α-antitrypsin from human plasma，AAT）、纖維蛋白原（Fibrinogen from human plasma，F(xiàn)ib）、血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、α-乳白蛋白（α-lactabumin，α-Lac）、β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LG）、酪蛋白（Casein），Sigma-Aldrich；羊源乳鐵蛋白（goat lactoferrin，GLF），西安優(yōu)博（YOB IOS）；全自動(dòng)高通量毛細(xì)管凝膠電泳儀器（Qsep1）及卡夾臺(tái)灣光鼎（Bioptic）公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)中所用到的母乳來(lái)源于自愿參加此研究的志愿者，羊奶粉購(gòu)于西安市某超市，液態(tài)乳樣品冰箱4℃儲(chǔ)存待用，奶粉樣品常溫儲(chǔ)存待用。

1.3 檢測(cè)方法

DNA序列處理：實(shí)驗(yàn)中的DNA序列由1×TE緩沖液溶解至100μmol/L，1×PBS稀釋至1μmol/L。為獲得具有功能性的DNA序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，使用前對(duì)DNA序列進(jìn)行95±0.5℃，5 min退火處理，冰箱-20℃下2 min冷卻待用。

選取出的非標(biāo)記-DNA序列（0.5μmol/L）加入濃度梯度（0～150μg/mL）HLF（1 mg/mL），加入1.0μL 20×PBS，加入超純水至最終體系為20μL，混勻孵育30 min后進(jìn)行全自動(dòng)毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)。GLF的樣品檢測(cè)濃度為0～25μg/mL。

全自動(dòng)毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)參數(shù)為：LED激發(fā)光源：480 nm；檢測(cè)器：PMT熒光檢測(cè)器；進(jìn)樣電壓：4 k V；進(jìn)樣時(shí)間：10 s；分離電壓：8 k V；分離時(shí)間：240 s；毛細(xì)管的有效分離長(zhǎng)度為13 cm。

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：樣品中加入2μL SYBR Gold染料（20×）以及3μL上樣緩沖液（6×）后進(jìn)行電泳。電泳參數(shù)：1%的瓊脂糖凝膠，1×TAE電泳緩沖液，電壓為100 V，電泳時(shí)間為30 min。電泳結(jié)束后使用藍(lán)光透射儀觀察電泳結(jié)果。

1.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

實(shí)際樣品前處理：新鮮母乳在4℃，12 000 rcf離心處理10 min，取中間層；嬰幼兒奶粉溶解方式為稱取1 g奶粉用超純水定容至7 mL，4℃，12 000 rcf離心處理10 min，取中間層。

實(shí)際樣品檢測(cè)：用所建立的檢測(cè)HLF、GLF的方法，分別檢測(cè)新鮮母乳（取0.5μL）、嬰幼兒奶粉（取3μL）中LF含量。在實(shí)際樣品中加入LF標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行加標(biāo)回收檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 人源乳鐵蛋白的毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)

在凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)中，選取合適的DNA序列對(duì)LF檢測(cè)的成功實(shí)現(xiàn)至關(guān)重要。在前期LF檢測(cè)中采用的是針對(duì)牛源LF的特異性DNA結(jié)合序列[21,24]，但是由于人LF和牛LF的蛋白質(zhì)氨基酸序列僅具有69%的同源性，因此，DNA序列篩選實(shí)驗(yàn)中增加另外兩種能與HLF特異性結(jié)合的DNA序列（DNA2、DNA3）[23,25]。由于毛細(xì)管凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)中無(wú)法觀察到復(fù)合物的電泳峰[21]，采用瓊脂糖凝膠電泳表征了上述3條DNA序列用于HLF檢測(cè)的可行性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1（a）所示，3條DNA序列在高濃度HLF存在時(shí)，均能夠觀察到明顯的復(fù)合物條帶，但是對(duì)于低濃度HLF，只有DNA1和DNA2能夠出現(xiàn)復(fù)合物條帶，并且DNA2在高濃度HLF時(shí)，觀察到二聚體條帶，影響HLF的準(zhǔn)確定量，因此選用DNA1進(jìn)行HLF的毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)。

由于毛細(xì)管凝膠中已經(jīng)包含了DNA染料，本實(shí)驗(yàn)中直接采用了非標(biāo)記的DNA序列，相比于之前采用的熒光標(biāo)記DNA[21]，顯著降低了檢測(cè)試劑成本。將上述選取的DNA1序列分別和不同濃度的HLF標(biāo)準(zhǔn)品孵育后進(jìn)行毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1（b）所示。不同濃度的HLF與DNA1序列混合的樣品及陰性樣品均出現(xiàn)DNA1序列的峰。由于HLF和DNA1序列特異性結(jié)合，導(dǎo)致體系中剩余的游離DNA1序列減少，含有HLF的樣品的游離DNA信號(hào)和峰面積明顯低于不含HLF的樣品，與前期BLF檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[21]。驗(yàn)證了采用非標(biāo)記DNA序列進(jìn)行HLF定量檢測(cè)的可行性。

當(dāng)增加HLF的濃度時(shí)，觀察到了預(yù)期的游離DNA1電泳峰高降低圖1（b）。以HLF的濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，游離DNA1的峰面積為縱坐標(biāo)繪制工作曲線，線性范圍0～150μg/mL，檢出限11.74μg/mL圖1（c）。特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1（d）所示，只有含HLF的樣品和DNA1序列特異性結(jié)合使得游離DNA1序列的峰面積明顯減少。因此，所建立的毛細(xì)管凝膠電泳方法能夠用于HLF含量的特異性定量檢測(cè)。

圖1 HLF毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)的DNA序列選擇（a）、線性范圍（b）、（c）和特異性（d）

2.2 羊源乳鐵蛋白的毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)

采用同樣的方式驗(yàn)證了GLF的毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)的可行性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。與HLF不同，3條DNA序列中，DNA2對(duì)于低濃度GLF復(fù)合物電泳條帶現(xiàn)象最明顯圖2（a），因此后續(xù)選用DNA2序列用于毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)GLF。隨著GLF濃度的增加，游離DNA2序列峰的面積減少，濃度在0～25μg/m L的范圍內(nèi)均具有良好的線性圖2（c），計(jì)算獲得檢出限3.53μg/m L，低于HLF的11.74μg/mL，表明該方法對(duì)于GLF具有更高的檢測(cè)靈敏度。同時(shí)，該方法也具有良好的特異性圖2（d）。

圖2 GLF毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)的DNA序列篩選（a）、線性范圍（b）、（c）、特異性驗(yàn)證（d）

2.3 實(shí)際乳品樣品檢測(cè)

為驗(yàn)證本研究建立的毛細(xì)管凝膠電泳法檢測(cè)HLF、GLF的實(shí)用性，采用上述建立的方法對(duì)母乳及羊奶粉中的LF含量進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見表1。新鮮母乳中LF的檢測(cè)值為3.25 mg/mL，且加標(biāo)回收率為107.45%，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[10]。羊奶粉中未檢出GLF，分別添加1、3、5μL羊乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（0.1 mg/m L），測(cè)得加標(biāo)回收率為85.5%～114.9%。表明本研究建立的毛細(xì)管凝膠電泳可用于實(shí)際樣品中不同來(lái)源LF的簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確檢測(cè)。為添加LF的嬰幼兒配方奶粉以及特色乳營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)提供一定的技術(shù)參考。

表1 實(shí)際樣品中乳鐵蛋白的檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立的毛細(xì)管凝膠電泳快速檢測(cè)HLF和GLF的方法，可實(shí)現(xiàn)母乳及羊奶粉等實(shí)際樣品中不同來(lái)源LF的定量檢測(cè)，提高了該方法的通用性。實(shí)驗(yàn)中只需簡(jiǎn)單的離心除脂以防止毛細(xì)管發(fā)生堵塞，不需要復(fù)雜的樣品前處理過程，簡(jiǎn)化了操作，同時(shí)減小了樣品前處理過程中引入的誤差；用非標(biāo)記DNA序列取代熒光標(biāo)記的DNA序列，降低了檢測(cè)成本。本方法準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性較好，適合工廠大批生產(chǎn)嬰幼兒配方羊奶粉及其它奶制品等添加LF含量的測(cè)定。同時(shí)，本方法用于多種特色乳源中LF的定量檢測(cè)具有很好的應(yīng)用前景。