徐燕, 雷俊平, 尚松, 藺兵虎△

1錦州醫(yī)科大學(xué)湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院研究生聯(lián)合培養(yǎng)基地普外科(湖北襄陽 441000)； 2襄陽市第一人民醫(yī)院普外Ⅲ科(湖北襄陽 441000)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是指結(jié)直腸上皮來源的癌癥，在美國癌癥協(xié)會(huì)公布的最新一期的《2021年度癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告》[1]中，結(jié)直腸癌的發(fā)病率及病死率均位于第三，隨著早癌篩查的普及，病死率有所下降，結(jié)直腸癌經(jīng)確診后主要治療方案為手術(shù)切除及輔助放化療[2]，但結(jié)直腸癌的預(yù)后評(píng)估手段仍不足。在臨床中腫瘤分期、病理分型、脈管癌栓侵襲等多方面都證實(shí)與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后有關(guān)[3]，但這些因素不足以準(zhǔn)確地為臨床預(yù)后進(jìn)行危險(xiǎn)分層；據(jù)相關(guān)研究表明，微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)是腫瘤發(fā)生的重要途徑[4]，其中錯(cuò)配修復(fù)蛋白的表達(dá)與否是決定微衛(wèi)星是否穩(wěn)定的重要因素，即錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)的缺失可導(dǎo)致正常細(xì)胞的異常增殖或腫瘤發(fā)生；在細(xì)胞增殖周期中，除了靜止(G0)期，其余時(shí)期(比如G1期、S期、G2期和分裂期)Ki-67均有表達(dá)[5]，所以在各個(gè)腫瘤的研究中，Ki-67可以被用于評(píng)估腫瘤的惡性程度和預(yù)后情況，也可以作為預(yù)測腫瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移的指標(biāo)[6]。本研究對(duì)切除的結(jié)直腸癌組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組化檢查，觀察4種錯(cuò)配修復(fù)蛋白MLH1、MSH2、MSH6、PMS2及Ki-67在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況，分析其與腫瘤的臨床病理特征和預(yù)后之間的關(guān)系，為結(jié)直腸癌的臨床診療和預(yù)后評(píng)估提供一定的參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年1月1日至2019年12月31日在普外Ⅲ科行手術(shù)治療后病理確診為結(jié)直腸癌患者的臨床數(shù)據(jù)，總納入病例231例，排除18例不符合納入標(biāo)準(zhǔn)病例[9例失訪、8例術(shù)前行新輔助化療、1例意外死亡(燒傷)],最終有213例符合納入標(biāo)準(zhǔn)。每例病理標(biāo)本都由兩位資歷較深的病理醫(yī)師共同閱片。納入研究的所有患者在接受手術(shù)治療前均未發(fā)現(xiàn)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及未行放化療，術(shù)后均按照結(jié)直腸癌的診療規(guī)范行規(guī)律化療。213例中男131例，女82例，年齡27～92歲，平均63.7歲，左半結(jié)腸癌60例，右半結(jié)腸癌40例，直腸癌113例，Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期分別占47例、69例、97例，116例存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，每半年對(duì)參與研究的213例患者進(jìn)行隨訪，收集患者復(fù)查資料，判斷患者經(jīng)手術(shù)治療后的預(yù)后情況，即有無復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。本研究已經(jīng)通過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的認(rèn)可(XYYYE20220055)。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)有完整的臨床資料；(2)經(jīng)病理檢查確診為結(jié)直腸癌；(3)經(jīng)手術(shù)切除原發(fā)病灶者；(4)定期隨訪者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前已經(jīng)實(shí)行放化療者；(2)有其他原發(fā)惡性腫瘤病史；(3)有復(fù)發(fā)或無法徹底切除的晚期病變的患者；(4)失訪者。

參與本研究的所有研究對(duì)象均已經(jīng)取得同意并簽署同意書。

1.3 方法 回顧性分析符合納入標(biāo)準(zhǔn)的213例患者的臨床資料，總結(jié)其病理特征，根據(jù)免疫組化的結(jié)果(圖1)將錯(cuò)配修復(fù)蛋白及Ki-67進(jìn)行分組，錯(cuò)配修復(fù)蛋白(MLH1、PMS2、MSH2、MSH6)分組依據(jù)：4種錯(cuò)配修復(fù)蛋白均不存在缺失分為錯(cuò)配修復(fù)蛋白正常組，一種及一種以上錯(cuò)配修復(fù)蛋白存在缺失分為錯(cuò)配修復(fù)蛋白缺失組；Ki-67分組依據(jù)：經(jīng)過閱讀中外文獻(xiàn)后將Ki-67分為低表達(dá)組(Ki-67<25%)、高表達(dá)組(Ki-67≥25%)；在性別、年齡、腫瘤侵及范圍、腫瘤分期、病理分型、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)后復(fù)發(fā)率等多方面分析兩者之間有無相關(guān)性，定期隨訪患者術(shù)后身體恢復(fù)及有無復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移情況。

1.4 觀察指標(biāo) 分析免疫組化結(jié)果，觀察結(jié)直腸癌患者的4種錯(cuò)配修復(fù)蛋白和Ki-67的表達(dá)情況，首先分別比較4種錯(cuò)配修復(fù)蛋白和Ki-67的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床特征及預(yù)后情況的關(guān)系，再比較不同情況下的結(jié)直腸癌中錯(cuò)配修復(fù)蛋白與Ki-67表達(dá)兩者之間的相關(guān)性。

1.5 隨訪 通過使用電話、門診檢查、住院復(fù)查等多種方式對(duì)參與本研究的患者進(jìn)行隨訪，根據(jù)患者的影像學(xué)表現(xiàn)、細(xì)胞學(xué)和病理學(xué)檢查、抽血檢查結(jié)果等多方面，綜合評(píng)價(jià)患者愈后情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件、Excel處理收集到的數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；計(jì)數(shù)資料由百分比(%)表示；組內(nèi)參數(shù)間比較采用獨(dú)立樣本2檢驗(yàn)；參數(shù)之間的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析；使用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌中4種錯(cuò)配修復(fù)蛋白和Ki-67表達(dá)的結(jié)果分析 根據(jù)213例病理組織的免疫組化檢測結(jié)果，MSI的概率為19.2%，其中4種錯(cuò)配修復(fù)蛋白MLH1、PMS2、MSH2、MSH6缺失率分別11.7%、12.2%、6.6%、6.1%，Ki-67的低表達(dá)率和高表達(dá)率分別為63.8%、36.2%。其中MLH1、PMS2均缺失有17例，MSH2、MSH6均缺失有7例，4種錯(cuò)配修復(fù)蛋白均缺失的有2例。見圖1。

注：A：MLH(+)；B：MLH(-)；C：PMS2(+)；D：PMS2(-)；E：MSH2(+)；F：MSH2(-)；G：MSH6(+)；H：MSH6(+)；I：Ki-67低表達(dá)；J：Ki-67高表達(dá)

2.2 4種錯(cuò)配修復(fù)蛋白和Ki-67表達(dá)與結(jié)直腸癌的臨床指標(biāo)和病理特征的關(guān)系 經(jīng)分析，MLH1、PMS2和腫瘤發(fā)生的病變部位有關(guān)(P<0.05)，與性別、年齡、病理分型、解剖分期、侵及范圍、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管和神經(jīng)侵犯均無關(guān)(P>0.05)，Ki-67與腫瘤發(fā)生的病變部位、脈管內(nèi)侵犯有關(guān)(P<0.05)，與性別、年齡、病理分型、解剖分期、侵及范圍、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯均無關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1 4種錯(cuò)配修復(fù)蛋白及Ki-67的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系 例

2.3 4種錯(cuò)配修復(fù)蛋白和Ki-67表達(dá)的相關(guān)性 MLH1與PMS2表達(dá)有相關(guān)性(r=0.800，P<0.01)，MSH2與MSH6表達(dá)有相關(guān)性(r=0.724，P<0.01)，Ⅰ期的結(jié)直腸癌和未突破固有肌層的結(jié)直腸癌中Ki-67與MSH6有相關(guān)性(r分別為-0.401、-0.340，P<0.01)；男性的結(jié)直腸癌中Ki-67與MLH1有相關(guān)性(r=0.189，P<0.05)。見表2～4。

表2 MLH1與PMS2、MSH2與MSH6的相關(guān)性

表3 Ki-67與MSH6的相關(guān)性

表4 性別為男性時(shí)Ki-67與MLH1的相關(guān)性

2.4 MSI和Ki-67的表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌患者預(yù)后的影響 213例患者中，Ki-67及MSI表達(dá)情況與結(jié)直腸癌患者預(yù)后有相關(guān)性(r分別為0.150、0.156，P<0.05)，Ki-67低表達(dá)、微衛(wèi)星不穩(wěn)定的患者無病進(jìn)展生存率較Ki-67高表達(dá)、微衛(wèi)星穩(wěn)定的高。見圖2。

注：A：Ki-67的表達(dá)與CRC患者無疾病生存進(jìn)展期的關(guān)系；B:MSI與CRC患者無疾病生存進(jìn)展期的關(guān)系

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)生是一段由息肉轉(zhuǎn)變?yōu)橄倭觯倭鲛D(zhuǎn)變?yōu)榘┌Y的過程[7]，此過程時(shí)間較長，且腫瘤發(fā)生早期癥狀不明顯，隨著腫瘤發(fā)展而逐漸表現(xiàn)出排便習(xí)慣改變、便血等癥狀。經(jīng)過長時(shí)間的研究與分析，結(jié)直腸癌的發(fā)生大多與遺傳因素、生活方式等多方面有關(guān)系，其中遺傳方面的因素主要包括染色體的不穩(wěn)定性和MSI[8]；錯(cuò)配修復(fù)蛋白包括MutS(MSH2、MSH3、MSH6)和MutL(MLH1、MLH3、PMS1、PMS2)兩大家族，其中MLH1、PMS2、MSH2、MSH6是錯(cuò)配修復(fù)基因的主導(dǎo)蛋白[9-10]。錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)缺失可致MSI，而MSI與結(jié)直腸癌的發(fā)生密切相關(guān)[11]；林奇綜合征又稱為遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌，約占結(jié)直腸癌的3%～5%，是由4種錯(cuò)配修復(fù)基因突變引起的一種常染色體顯性遺傳易感性疾病[12]，當(dāng)患者免疫組化結(jié)果顯示為MSH2、MSH6共同缺失時(shí)，有最強(qiáng)烈的林奇綜合征相關(guān)腫瘤家族史[13-14]。本研究結(jié)果顯示，MSI與腫瘤發(fā)生的病變部位、病理分型有關(guān)，與性別、年齡、解剖分期、侵及范圍、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯均無關(guān)；其中MLH1、PMS2共同缺失和MSH2、MSH6共同缺失分別占比為7.9%、3.2%，MLH1、PMS2、MSH2、MSH6的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.800、r=0.724，P<0.01)，這與Hall等[15]研究結(jié)論一致；錯(cuò)配修復(fù)蛋白的缺失多見于中年、性別為男性、發(fā)生于右半結(jié)腸、處于Ⅱ期狀態(tài)、腫瘤突破固有肌層、有脈管內(nèi)癌栓侵犯、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者，這與國內(nèi)外大部分研究結(jié)果一致[7, 14, 16-17]，但是Liang等[8]的研究結(jié)論為女性患者中錯(cuò)配修復(fù)蛋白缺失狀態(tài)更多見，在性別方面錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌的影響存在差異是因?yàn)榉N族差異、隊(duì)列規(guī)模較小，還是確實(shí)存在性別優(yōu)勢導(dǎo)致，這需要進(jìn)一步大樣本研究。

Ki-67是一種核蛋白，與RNA轉(zhuǎn)錄及細(xì)胞增殖相關(guān)[18]，可反映細(xì)胞分裂增殖程度，該蛋白在細(xì)胞分裂增殖活躍階段(G1期、S期、G2期和分裂期)表達(dá)水平較高，但在靜止期細(xì)胞(G0期)中缺失，這個(gè)特點(diǎn)可用于標(biāo)記處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞，所以Ki-67蛋白的過度表達(dá)可能表明細(xì)胞正常的增殖機(jī)制遭到破壞，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[19]；許多研究表明，Ki-67蛋白的表達(dá)在各種惡性腫瘤中有預(yù)測作用，包括乳腺癌、胃腸道間質(zhì)瘤、胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌瘤等[20]，該蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，術(shù)前接受過放化療患者的腫瘤組織中檢測到Ki-67蛋白表達(dá)相對(duì)更低；多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，Ki-67蛋白的表達(dá)在結(jié)直腸癌中存在臨床意義，可作為結(jié)直腸癌獨(dú)立預(yù)后的生物標(biāo)志物，但意見不一，多項(xiàng)研究結(jié)果表明[21-23]，與Ki-67蛋白低表達(dá)患者相比，Ki-67蛋白高表達(dá)患者的無病生存期較短且復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移概率較大，對(duì)患者的預(yù)后是一個(gè)不利因素；但在其他研究中[24-25]，與Ki-67蛋白低表達(dá)患者相比，Ki-67蛋白高表達(dá)患者降低了腫瘤的復(fù)發(fā)率、提高了生存率, 對(duì)患者的預(yù)后是一個(gè)有利因素；在本研究中，Ki-67和腫瘤發(fā)生的病變部位、脈管內(nèi)侵犯有關(guān)，與性別、年齡、病理分型、解剖分期、侵及范圍、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯均無關(guān)，Ki-67蛋白高表達(dá)患者的腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率較高；此外在諸多研究中，Ki-67蛋白表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌預(yù)后方面的影響存在差異，可能是因?yàn)閲H上并未對(duì)結(jié)直腸癌中的Ki-67蛋白表達(dá)分組臨界值作詳細(xì)規(guī)定，不同研究出現(xiàn)的不同結(jié)果可能是由于所采取的分界值不同而產(chǎn)生的。

經(jīng)分析，本研究發(fā)現(xiàn)在Ⅰ期的結(jié)直腸癌和未突破固有肌層的結(jié)直腸癌中Ki-67與MSH6有負(fù)相關(guān)性，即MSH6表達(dá)缺失時(shí)Ki-67蛋白為低表達(dá)，其結(jié)直腸癌患者的腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率低，在男性的結(jié)直腸癌中，Ki-67與MLH1呈正相關(guān)，即MLH1表達(dá)缺失時(shí)Ki-67蛋白為高表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致患者的腫瘤復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率高。本研究局限性及待解決問題：樣本量不大，后續(xù)應(yīng)加大樣本量；隨訪時(shí)間較短，后續(xù)應(yīng)長期隨訪符合納入標(biāo)準(zhǔn)的病例，做進(jìn)一步分析。

綜上所述，4種錯(cuò)配修復(fù)蛋白和Ki-67的表達(dá)在結(jié)直腸癌中存在臨床意義，且在Ⅰ期、未突破固有肌層、性別為男性的結(jié)直腸癌患者中兩者之間存在相關(guān)性，表明聯(lián)合檢測錯(cuò)配修復(fù)蛋白和Ki-67可以提高結(jié)直腸癌的診斷及預(yù)后評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性，在臨床上可以為其提供一定的指導(dǎo)意義。

利益相關(guān)聲明：本文作者聲明不存任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明：徐燕：設(shè)計(jì)及實(shí)施研究，收集及分析數(shù)據(jù)，論文撰寫及修改；雷俊平：提供研究思路，臨床資料收集；尚松：課題經(jīng)費(fèi)支持，分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)；藺兵虎：設(shè)計(jì)研究方案，論文審核；所有作者都已閱讀并批準(zhǔn)了論文的內(nèi)容。