孫秀紅, 李小芬, 萬均輝, 王紅英△

廣州市婦女兒童醫(yī)療中心 1超聲科, 2婦科(廣東廣州 510623)

目前研究認(rèn)為，多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)是環(huán)境因素和遺傳易感性共同作用的一種復(fù)雜性疾病，遺傳因素在其發(fā)病機制和預(yù)后評價中也發(fā)揮著重要作用[1]。長鏈非編碼RNA(long non coding RNA, lncRNA)也是一類小型RNA分子，一般轉(zhuǎn)錄本長度>200個核苷酸，lncRNA相對微小RNA(microRNA, miRNA)較長，包含的信息量更多，功能更多樣復(fù)雜[2]，近年來備受研究者青睞。H19位于人類染色體11p15.5，全長2.3 kb，是最早發(fā)現(xiàn)的lncRNA，它不編碼蛋白質(zhì)，通過表觀遺傳學(xué)機制參與基因的調(diào)控。H19在胚胎期主要表達于中胚層和內(nèi)胚層來源的組織，出生后則主要在心肌、骨骼肌、乳腺、子宮、卵巢和睪丸中表達[3]。研究表明H19在女性生殖系統(tǒng)相關(guān)疾病如卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)[4-9]等中發(fā)揮著重要作用。鑒于以上研究結(jié)果，結(jié)合PCOS的主要病理特點，即高雄激素、高胰島素血癥或胰島素抵抗，提出以下假設(shè)：PCOS中是否也存在H19的表達異常？H19是否與PCOS的臨床特征如胰島素和雄激素代謝紊亂相關(guān)？本研究針對上述假設(shè)進行部分驗證。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年6月至2020年6月就診于廣州市婦女兒童醫(yī)療中心首次確診為PCOS的患者20例作為病例組，PCOS的診斷標(biāo)準(zhǔn)采用鹿特丹歐洲人類生殖與胚胎學(xué)會/美國生殖醫(yī)學(xué)學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)(2003)。選取同期入院就診因男方無精或弱精癥擬行人工授精的正常育齡期婦女20例作為對照組，兩組年齡(歲)均衡可比(29.50±3.7vs.31.70±4.5,P>0.05)。所有研究對象在采血前的3個月內(nèi)均無服用過干擾血清激素水平的藥物，無吸煙史。本研究通過了醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的審批(穗婦兒 科倫 通字[2021]第322B00號)，所有研究對象簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 基本信息的采集和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的測量 采集包括姓名、年齡、月經(jīng)婚育史、既往病史、家族及遺傳病史等基本信息填入患者基本信息表格。由經(jīng)過統(tǒng)一培訓(xùn)的研究人員使用相同的測量儀器來測量研究對象的身高和體重。根據(jù)體質(zhì)指數(shù)(BMI)的計算公式：BMI=體重(kg)/身高(m)2，計算BMI。

1.2.2 血樣采集及相關(guān)檢測 病例組和對照組均于月經(jīng)周期的第2～5天，空腹至少8 h后來院采集血樣。所有受試者需完成相關(guān)內(nèi)分泌代謝指標(biāo)測量：采用免疫化學(xué)發(fā)光法檢測血清激素，包括睪酮(T)、孕酮(P)、雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)；采用葡萄糖氧化酶法檢測空腹葡萄糖(FPG)與空腹胰島素(FINS)；采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測抗苗勒管素(AMH)和抑制素B(INHB)。胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)的計算公式如下：HOMA-IR=FINS(μIu/mL)×FPG (mmol/L)/22.5。我們采用的胰島素抵抗判定標(biāo)準(zhǔn)(cut-off值)采用文獻報道的HOMA-IR>2.69[10]。

1.2.3 外周血白細(xì)胞的分離、總RNA的提取 將EDTA管中的血樣加入等體積的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)稀釋約5 mL，采用Ficoll-Paque密度梯度離心方法分離白細(xì)胞，將每個樣品在4℃下以800g離心30 min。 離心后，獲得含有單核細(xì)胞的中間層，用PBS洗滌2次以除去Ficoll和血漿。將樣品儲存在-80℃下以等待進一步的實驗。按RNAISO PLUS(大連Takara公司，日本)的說明書進行外周血白細(xì)胞總RNA的提取。

1.2.4 H19逆轉(zhuǎn)錄與PCR反應(yīng) 在NCBI網(wǎng)站上的GeneBank數(shù)據(jù)庫中檢索H19基因和GAPDH的基因序列。利用primer 5.0軟件設(shè)計引物，交由廣州維伯鑫生物公司合成，其序列見表1。使用Bio-Rad公司的Thermal Cycler DiceTMReal Time System Ⅱ 擴增儀和Takara公司的SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒分別進行定量PCR反應(yīng)。

表1 引物名稱和引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，PCOS患者和對照組數(shù)據(jù)，正態(tài)分布的連續(xù)變量使用t檢驗；非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用Mann-WhitneyU檢驗。根據(jù)我們的實驗結(jié)果，按照H19的表達水平將實驗組分成2個亞組：H19水平<0.170 6定義為低表達組，而H19水平≥0.170 6定義為高表達組。計算Pearson或Spearman相關(guān)系數(shù)評估H19的表達量和患者臨床或生化數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病例組和對照組血清學(xué)臨床指標(biāo)比較 與對照組相比，病例組的BMI、T、LH、LH/FSH、AMH、FINS、FPG、HOMA-IR水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩組之間年齡、FSH、E2、P、INHB水平則差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 PCOS患者和對照組的血清學(xué)臨床數(shù)據(jù)對照表

2.2 H19在外周血白細(xì)胞中的表達水平 病例組外周血白細(xì)胞中H19表達水平(1.59±0.30)，顯著高于對照組(0.17±0.02),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 H19在兩組外周血白細(xì)胞中的表達(經(jīng)2-ΔΔCt轉(zhuǎn)換后)

2.3 lncRNA H19表達水平和PCOS患病風(fēng)險的相關(guān)性 根據(jù)對照組外周血白細(xì)胞中的H19的表達水平，對正態(tài)分布的數(shù)據(jù)計算平均數(shù)作為截斷值，為0.170 6，即H19表達量>0.170 6為高表達，反之為低表達。據(jù)此把病例組和對照組女性各分成2個亞組。病例組：低表達1例，高表達19例；對照組：低表達15例，高表達5例。通過logistic 回歸模型分析發(fā)現(xiàn)外周血白細(xì)胞高表達H19的個體患PCOS的風(fēng)險更高，見表3。

表3 外周血白細(xì)胞中H19的表達高低和PCOS患病的風(fēng)險

2.4 外周血白細(xì)胞中H19的表達和臨床數(shù)據(jù)的相關(guān)性 把H19的表達量作為因變量，各血清學(xué)臨床數(shù)據(jù)作為自變量，發(fā)現(xiàn)H19的表達和各血清學(xué)臨床指標(biāo)之間無明顯相關(guān)性。見表4。

3 討論

PCOS具有高度異質(zhì)性，體現(xiàn)在其臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，實驗室檢查及其他輔助檢查差異很大，但其主要特點鮮明[11]。其主要特點為高雄激素、高胰島素血癥或胰島素抵抗、卵巢多囊樣聲像改變。PCOS不能被治愈，隨著時間推移病程進行性發(fā)展。近年來，我們課題組從遺傳學(xué)角度進一步探究PCOS的發(fā)病機制，尋求診療新角度。本研究中我們檢測了PCOS患者外周血白細(xì)胞中 H19 的表達量，評估了H19 與 PCOS 之間關(guān)聯(lián)。我們的實驗結(jié)果顯示PCOS女性的 H19 表達水平顯著高于健康對照組，H19 表達水平高的女性罹患PCOS的風(fēng)險顯著高于表達水平較低的女性。這些結(jié)果提示 H19 可能部分參與了PCOS的發(fā)生和發(fā)展。

表4 H19的表達和臨床數(shù)據(jù)的相關(guān)性

H19 已被證明在一系列疾病的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，H19 涉及一系列廣泛的生理和病理過程，包括基因轉(zhuǎn)錄、RNA 代謝、表觀遺傳學(xué)修飾和腫瘤的發(fā)展等，既往關(guān)于H19的研究多集中在生長發(fā)育、糖代謝和腫瘤轉(zhuǎn)移等方面[12-14]。Sanchez-Parra等[15]證明H19 在胰島中的表達下調(diào)，可能是胰島功能紊亂和超微結(jié)構(gòu)受損的潛在機制。Ozgur等[16]研究表明，H19 與雄激素依賴性神經(jīng)內(nèi)分泌前列腺癌的發(fā)病有關(guān)，在前列腺癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染H19 siRNA后，細(xì)胞生長和糖代謝能力均顯著下降，H19 在調(diào)節(jié)雄激素水平和糖代謝中發(fā)揮作用。以上研究結(jié)果說明H19與胰島素代謝和雄激素高表達相關(guān)。且現(xiàn)有研究表明H19在生殖系統(tǒng)相關(guān)疾病如卵巢癌[17-18]、子宮內(nèi)膜癌[19-20])、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)[21]等疾病中也發(fā)揮了重要作用。結(jié)合本實驗結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)與對照組相比， PCOS 患者外周血白細(xì)胞中H19 表達的顯著上調(diào)，與之前學(xué)者的研究結(jié)論一致[22]。最新的一項研究利用PCOS患者的血清樣本和卵丘細(xì)胞，均證實PCOS患者循環(huán)和卵巢局部H19水平較對照組顯著升高[23]。根據(jù)我們的結(jié)果，H19表達量的高低似乎與PCOS患病風(fēng)險相關(guān)，即H19 高表達個體相對于低表達個體具有更高的疾病風(fēng)險，低表達H19的個體患PCOS的風(fēng)險則相對更低。目前H19 表達的組織特異性已被作為一些疾病如胃癌、乳腺癌[12]的潛在遺傳生物標(biāo)志物，血清或卵丘細(xì)胞中H19表達量是否可作為PCOS的生物遺傳標(biāo)記物值得進一步研究。然而，結(jié)合我們的實驗結(jié)果，并不是所有的PCOS患者血清H19水平均高于對照組，PCOS合并H19低表達與PCOS合并H19高表達是由何種內(nèi)在機制引起的也值得我們進一步探討。

我們繼續(xù)分析了PCOS患者高表達的H19與各項臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示H19的表達量和臨床指標(biāo)無顯著相關(guān)性(r<0.5，P>0.05)。因此，無法根據(jù)H19水平推測PCOS患者是否具有高雄激素血癥、胰島素抵抗等臨床特點。結(jié)合我們的結(jié)果，我們認(rèn)為H19與PCOS高雄激素血癥、胰島素抵抗之間未顯示明顯的相關(guān)性，似乎并不能反映PCOS的嚴(yán)重程度，也無法通過H19來推測PCOS的臨床表型。這與之前我們課題組成員的研究結(jié)論并不完全一致，之前課題組成員Qin等[22]認(rèn)為PCOS組高表達的H19與空腹血糖值(FPG)呈正相關(guān)，并在一定程度上反映了PCOS患者的代謝水平。Chen等[23]制作了H19基因敲除小鼠，檢測卵巢組織中的Cyp17水平和血清睪酮水平，發(fā)現(xiàn)H19的缺失可能通過Cyp17介導(dǎo)的機制破壞雄激素的產(chǎn)生，據(jù)此推測過量的H19可能與PCOS高雄激素血癥相關(guān)。這些在我們的結(jié)果中均未得以驗證，可能本實驗樣本量有限且實驗設(shè)計之初并沒有根據(jù)PCOS患者不同的臨床表型進行亞分類，造成實驗結(jié)果和結(jié)論都有所偏倚。

同時，H19基因和人胰島素樣生長因子2(insulin-like growth factor-2，IGF2)基因作為經(jīng)典的交互印記基因，目前諸多研究證明其在生殖發(fā)育及生殖領(lǐng)域相關(guān)疾病中也發(fā)揮著重要作用[24]。IGF2和H19基因均位于人類染色體11p15.5，兩者定位相近，距離僅70 kb，交互印記，擁有同一調(diào)控系統(tǒng)，共同調(diào)控著人體的生長發(fā)育。IGF2是母源性印記基因，父方表達，IGF2是胚胎性生長因子，是一種分泌的小蛋白質(zhì)，可促進多種細(xì)胞的增殖和分化。而H19基因?qū)儆诟冈葱杂∮浕?，母源表達，只在mRNA水平發(fā)揮調(diào)控作用，最終產(chǎn)物是內(nèi)源性交互印跡基因RNA，不能表達成蛋白質(zhì)，H19基因作為一種生長調(diào)控基因，在細(xì)胞增殖和分化中具有雙重作用[25]。然而，H19/IGF2這一組交互印記基因在PCOS的發(fā)生、發(fā)展中的作用機制目前研究甚少。PCOS是否存在H19/IGF2交互印記的異常，其印記異常是否是PCOS胰島素和雄激素代謝異常的關(guān)鍵所在，這些值得我們繼續(xù)深入探討。

綜上所述，我們的研究確定了PCOS患者外周血白細(xì)胞中H19的呈高表達水平，但H19的表達量與各臨床指標(biāo)無顯著相關(guān)性，雖然部分實驗結(jié)果與現(xiàn)有報道并不完全符合，但H19 可能至少部分的參與并促進了 PCOS 的發(fā)生和發(fā)展。本研究存在局限性。首先，外周血標(biāo)本易于收集，可反映機體的整體狀態(tài)，但同時復(fù)雜的血液背景使得難以識別PCOS患者外周血樣本中l(wèi)ncRNA的細(xì)胞起源和組織表達模式，亦不能準(zhǔn)確反映卵巢局部的內(nèi)分泌狀況及卵泡發(fā)育情況。其次，樣本量小，僅包含20例PCOS患者和20例正常對照。雖然我們的研究只是小樣本的PCOS患者與 H19 表達相關(guān)的數(shù)據(jù)，但我們的研究提供對了從表觀遺傳學(xué)角度認(rèn)識PCOS的新角度和新見解。

利益相關(guān)聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻說明：孫秀紅負(fù)責(zé)設(shè)計實驗、采集分析數(shù)據(jù)及論文撰寫；李小芬、萬鈞輝參與數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計分析；王紅英審閱和修訂論文。