曾量波, 鐘智成, 劉桂紅, 梁慶△, 汪友平

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科(廣東廣州 510120)； 2廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科研究所實驗部(廣東廣州 510150)

社區(qū)獲得性肺炎(community-acquired pneumonia，CAP)是引起膿毒癥的最常見原因[1-2]，在其發(fā)病過程中存在過度的炎癥反應(yīng)與宿主的抗炎機制失去平衡，導(dǎo)致多臟器功能障礙。各國研究者尋找在抗生素基礎(chǔ)上的抗炎藥物，包括糖皮質(zhì)激素、他汀類、磷酸二酯酶抑制劑等以抑制或調(diào)節(jié)過度激活的炎癥反應(yīng)，減輕炎癥介導(dǎo)的肺損傷及其他器官損害以降低重癥社區(qū)獲得性肺炎的病死率，但僅糖皮質(zhì)激素被推薦有條件下應(yīng)用[3]。研究表明環(huán)氧化酶-2(COX-2)與各種肺部疾病有密切關(guān)系，在肺炎動物模型和人類肺炎均明顯表達[4-5]。在抗生素基礎(chǔ)上加用特異性COX-2抑制劑能否通過調(diào)節(jié)炎癥平衡，減輕肺部損傷，進而提高存活率尚未明確，目前國內(nèi)鮮見類似研究的報道。肺炎克雷伯桿菌是重癥社區(qū)獲得性肺炎最常見的致病菌之一[6]。2019年3—12月，本研究探討了特異性COX-2抑制劑塞來昔布聯(lián)合莫西沙星對肺炎克雷伯桿菌肺炎大鼠肺部炎癥標志物及肺組織病理學(xué)的影響，可為臨床在抗生素治療基礎(chǔ)上，尋找新的治療途徑有效調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)以改善重癥肺炎預(yù)后提供實驗依據(jù)。本動物實驗獲得廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理會的批準。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康SPF級雄性SD大鼠60只，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供[實驗動物使用許可證號：SYXK(粵)2016-0168，實驗動物使用質(zhì)量合格證：SCXK(粵)2013-0034]，鼠齡為6～8周，體重180～200 g。

1.1.2 病原 肺炎克雷伯桿菌標準株，由本院檢驗科細菌室提供，制備濃度為4個麥氏濁度單位的細菌懸液[7]。

1.1.3 藥物 根據(jù)人和大鼠間按體表面積折算的等效劑量比值0.018進行計算，特異性COX-2抑制劑塞來昔布(Celebrex，美國輝瑞公司)，按20 mg/(kg·d)，溶于20 mL二甲基亞砜(DMSO)；抗生素莫西沙星(Moxifloxacin，拜耳醫(yī)藥保健有限公司)，按42 mg/(kg·d)，溶于20 mL DMSO。

1.1.4 試劑盒 大鼠C反應(yīng)蛋白(CRP)、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β、熱休克蛋白90(HSP90)、血栓素A2(TXA2)、前列腺素I2(PGI2)、前列腺素E2(PGE2)的ELISA檢測試劑盒，均購自深圳市博卡生物技術(shù)有限公司。

1.1.5 實驗室 所有動物實驗在呼吸疾病國家重點實驗室的感染實驗室完成。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 根據(jù)參考文獻[7]，將手術(shù)切開皮膚暴露氣管穿刺插管改為直視下氣管插管，在吸氣相將靜脈留置針套管插入氣道。經(jīng)氣道注入含菌量為4個麥氏濁度單位的細菌混懸液0.35 mL，對照組以相同方法注入等量的無菌生理鹽水。建模成功標準根據(jù)肺組織病理出現(xiàn)典型的滲出、出血、壞死等肺炎病理表現(xiàn)。

1.2.2 分組 按2、4、6 d 3種給藥療程，每個療程20只大鼠，各療程大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為5組，每組4只：空白對照組(control組)、模型組(model組)、COX-2抑制劑塞來昔布治療組(Cox組)：注射細菌混懸液后次日腹腔注射塞來昔布，1次/d，分別連續(xù)注射2、4、6 d；莫西沙星組(Mox組)：注射細菌混懸液后次日腹腔注射莫西沙星，1次/d，分別連續(xù)注射2、4、6 d；塞來昔布+莫西沙星組(Cox+Mox組)：注射細菌混懸液后次日腹腔注射塞來昔布及莫西沙星，1次/d，分別連續(xù)注射2、4、6 d。3種給藥療程大鼠分別于結(jié)束給藥后次日，即第3、5、7天分批處死動物。

1.3 觀察檢測指標

1.3.1 一般情況 (1)行為變化；(2)術(shù)前3 d及術(shù)后每天體重變化。

1.3.2 血細胞分析及CRP測定 腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉后開胸暴露心臟，以5 mL注射器穿刺左心室取血2 mL，使用動物用血細胞分析儀作血細胞分析，ELISA法測定CRP水平。

1.3.3 肺組織病理 完整取下雙側(cè)肺組織，觀察肺組織大體變化情況，稱雙肺濕重，計算肺濕重與體重(L/W)的比值。切取右肺各葉，放入-80℃冰箱待檢測。留取左肺于4%甲醛溶液充分固定24 h后，蘇木精-伊紅(HE)染色后，病理顯微鏡下觀察組織變化。

1.3.4 肺組織炎癥標志物的測定 取出冰凍肺組織按照試劑盒說明制成肺組織勻漿上清液，ELISA法測定：(1)致炎作用的細胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β及抗炎作用的細胞因子IL-10、TGF-β水平；(2)環(huán)氧化酶代謝產(chǎn)物TXA2、PGI2、PGE2水平；(3)HSP90水平。

2 結(jié)果

2.1 一般情況與肺L/W比值

2.1.1 一般情況 造模后當天model組和各藥物干預(yù)組大鼠活動減弱，蜷縮于鼠籠一側(cè)，偶見豎毛，呼吸急促，雙側(cè)胸廓呼吸活動度增強，無發(fā)紺，體重?zé)o明顯下降。造模后次日model組及各治療組大鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡，毛發(fā)失去光澤變稀疏，活動減少，易受驚擾，體重逐漸減輕。

2.1.2 肺L/W的比值 3種給藥療程的各model組L/W均較control組升高(P<0.05)。4 d與6 d的Cox組與Mox組均較control組升高(P<0.05)。3種給藥療程的各Cox+Mox組與control組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但均較model組降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組不同時間L/W的比較

2.2 各種炎癥標記物測定

2.2.1 各藥物干預(yù)組的外周血細胞及CRP的變化 各組血細胞分析顯示白細胞、血紅蛋白及血小板總數(shù)均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2～4。2 d和4 d的model組與3個藥物干預(yù)組CRP均較control組升高(P<0.05)；6 d只有model組與Mox組較control組升高(P<0.05)；4 d和6 d的Cox組、Mox組及Cox+Mox組均較model組降低(P<0.05)。見表5。

表2 塞來昔布及莫西沙星對大鼠外周血白細胞的影響

表3 塞來昔布及莫西沙星對大鼠外周血血紅蛋白的影響

表4 塞來昔布及莫西沙星對大鼠外周血血小板的影響

表5 塞來昔布及莫西沙星對大鼠CRP水平的影響

2.2.2 塞來昔布及莫西沙星對肺組織炎癥標志物水平的影響

2.2.2.1 對炎癥因子的影響 2 d各藥物組的細胞因子組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。4 d的model組、Mox組、Cox+Mox組的TNF-α、IL-6、 IL-1β、TGF-β均較control組升高(P<0.05)；Cox組、Mox組、Cox+Mox組的TNF-α、IL-6、 IL-1β、TGF-β均較model組下降(P<0.05)。6 d的model組的TNF-α、IL-6、IL-1β、TGF-β均較control組明顯升高(P<0.05)；Cox組、Mox組、Cox+Mox組的TNF-α、TGF-β均較model組下降(P<0.05)；Mox組的IL-6較model組下降(P<0.05)；Cox組、Cox+Mox組的IL-1β較model組下降(P<0.05)。見表6～9。

表6 塞來昔布及莫西沙星對大鼠肺部組織TNF-α的影響

表7 塞來昔布及莫西沙星對大鼠肺部組織IL-6的影響

表8 塞來昔布及莫西沙星對大鼠肺部組織IL-1β的影響

表9 塞來昔布及莫西沙星對大鼠肺部組織TGF-β的影響

2 d各藥物組的抗炎細胞因子IL-10均與control組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。4 d和6 d的model組較control組明顯降低(P<0.05)。4 d的Cox組、Cox+Mox組較model組升高(P<0.05)，而6 d只有Cox+Mox組較model組升高(P<0.05)。見表10。

表10 塞來昔布及莫西沙星對大鼠肺部組織IL-10的影響

2.2.2.2 對花生四烯酸代謝產(chǎn)物的影響 2 d各藥物組的PGI2、PGE2、TX-A2均組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。4 d的model組、Mox組、Cox+Mox組的3種代謝產(chǎn)物均較control組升高(P<0.05)，Cox組的PGI2較control組升高(P<0.05)；Cox組、Mox組、Cox+Mox組均較model組下降(P<0.05)。6 d的model組較control組升高(P<0.05)；Cox組、Mox組、Cox+Mox組均較model組下降(P<0.05)；見表11～13。

表11 塞來昔布對大鼠肺部組織PGI2的影響

表12 塞來昔布對大鼠肺部組織PGE2的影響

表13 塞來昔布對大鼠肺部組織TX-A2的影響

2.2.2.3 塞來昔布及莫西沙星對HSP90的影響 2 d各藥物組的HSP90組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。4 d的model組、Mox組、Cox+Mox組均較control組升高(P<0.05)；Cox組、Mox組、Cox+Mox組均較model組下降(P<0.05)。6 d的model組較control組明顯升高(P<0.05)；Cox組、Mox組、Cox+Mox組均較model組下降(P<0.05)。見表14。

表14 塞來昔布對大鼠肺部組織HSP90水平的的影響

2.3 塞來昔布對肺部組織病理學(xué)的影響

2.3.1 大體標本 3種給藥療程的control組肺組織外觀淡白色，各model組和藥物干預(yù)組肺腫脹，彈性差，局部見深紅色、結(jié)節(jié)樣病灶。

2.3.2 肺組織病理 3種給藥療程的control組肺泡間隔正常，無或僅見極少量炎癥細胞；2 d model組細支氣管旁肺泡間隔增寬，間隔內(nèi)炎癥細胞及紅細胞滲出；2 d Cox組炎癥細胞較model減少，但比control組增多；2 d Cox+Mox組炎癥細胞較model組及Mox組減少，但比control組增多。4 d model組肺實變，可見大量淋巴細胞，中性粒細胞；4 d Cox組炎癥細胞較model組減少，與control組無差異；4 d Mox組及Cox+Mox組可見單核細胞、巨噬細胞、淋巴細胞，少量中性粒細胞，較model組減少。6 d model組機化物形成，機化性肺炎，少許中性粒細胞；6 d Cox組肺泡間隔內(nèi)炎癥細胞及紅細胞滲出較model組減少，無機化物的形成；6 d Mox組及 Cox+Mox組肺泡間隔內(nèi)炎癥細胞及紅細胞滲出較model組減少，無機化物的形成。見圖1。

3 討論

非甾體抗炎藥(nonsteroidal antinflammatory drugs，NSAIDs)通過抑制環(huán)氧化酶(COX)，從而抑制前列腺素的合成而產(chǎn)生解熱、抗炎作用，在肺炎的治療中主要用于緩解肺炎伴隨的發(fā)熱、疼痛癥狀。國內(nèi)外指南尚未對NSAIDs在社區(qū)獲得性肺炎的抗炎方面作出明確建議[8-9]。對過度激活的炎癥反應(yīng)進行調(diào)節(jié)是目前研究的熱點問題，但除激素外對其他藥物尚無明顯進展。本研究從NSAIDs家族中的特異性COX-2抑制劑塞來昔布聯(lián)合抗生素莫西沙星對肺部炎癥標志物和病理學(xué)角度探討其對減輕肺炎炎癥有無協(xié)同作用，為臨床通過干預(yù)COX-2途徑對炎癥反應(yīng)進行調(diào)節(jié),以減輕肺損傷及改善重癥肺炎預(yù)后提供實驗依據(jù)，國內(nèi)類似研究報道不多。本實驗結(jié)果顯示塞來昔布單獨及聯(lián)合莫西沙星對大鼠肺炎克雷伯桿菌肺炎肺部炎癥因子，前列腺素代謝產(chǎn)物及肺組織病理學(xué)均產(chǎn)生影響。

肺炎時局部與全身性炎癥因子升高，且與病情有密切關(guān)系，而其血清的水平在重癥肺炎時明顯升高[10]。肺泡灌洗液的IL-6、IL-8和INF-γ的水平均明顯升高，但與病情嚴重性無相關(guān)性[11]。本研究顯示大鼠肺炎克雷伯肺炎模型肺組織的致炎細胞因子水平明顯升高，塞來昔布、莫西沙星單獨及兩藥合用均降低致炎細胞因子水平，但兩者聯(lián)合并未顯示優(yōu)于塞來昔布或莫西沙星單獨使用。本研究顯示有抗炎作用的細胞因子IL-10隨造模時間延長而降低，塞來昔布單獨及與莫西沙星合用均提高IL-10水平，提示塞來昔布對改善致炎與抗炎因子的平衡有益。

COX-2主要存在于炎癥部位，在外界刺激因子的作用下促使炎癥介質(zhì)前列腺素的合成并引起炎癥反應(yīng)。各種前列腺素代謝產(chǎn)物的作用不一樣，TXA2是強有力的血小板聚集物，血管收縮劑，PGI2是血管舒張劑和血小板聚集抑制劑，PGE2具有舒張血管、抗炎和免疫抑制作用。COX-2基因敲除大鼠對銅綠假單胞菌的清除能力增強，認為與COX-2的產(chǎn)物PGE2抑制巨噬細胞產(chǎn)生超氧化物的生成有關(guān)[12]。感染類鼻疽伯克菌小鼠迅速誘導(dǎo)巨噬細胞產(chǎn)生PGE2，PGE2有利于細菌在細胞內(nèi)生長[13]。cAMP是細胞內(nèi)第二信使，能上調(diào)或抑制細胞因子生成，但也有抑制細胞吞噬，吞噬體酸化，溶酶體酶釋放等，研究發(fā)現(xiàn)抑制前列腺素產(chǎn)物能降低cAMP水平，增強宿主殺菌能力[14]。上述研究提示抑制COX-2影響其代謝產(chǎn)物而增強宿主抗菌能力。本研究顯示塞來昔布及與抗生素合用均使前列腺素代謝產(chǎn)物水平降低，可能有利于細菌的清除。

既往有研究顯示H7N9感染的重癥肺炎小鼠在抗病毒藥物基礎(chǔ)上加用塞來昔布能減輕肺部炎癥，降低病死率[15]。最近也有研究顯示低劑量雙氯芬酸能使MRSA對β-內(nèi)酰胺類藥物敏感性重新增加，抑制MRSA相關(guān)生物膜的形成[16]。新冠病毒肺炎流行期間雖然出現(xiàn)了使用布洛芬可能惡化肺炎病情的爭議[17]，但也有學(xué)者認為抑制環(huán)氧化酶可為COVID-19的輔助治療提供選擇[18]。本研究對肺組織病理觀察顯示特異性COX-2抑制劑塞來昔布單獨或與抗生素合用均有助于減輕肺組織損傷，但塞來昔布與莫西沙星合用在降低部分細胞因子水平及改善肺組織作用未顯示出明顯優(yōu)于單獨塞來昔布的作用，需要排除塞來昔布與不同抗生素可能存在相互作用，樣本量及觀察時間不足以及評價指標的局限性等因素的影響。目前尚缺乏特異性COX-2抑制劑與抗生素合用有無協(xié)同作用的文獻報道。

NSAIDs不能代替抗生素，早期肺炎在沒有應(yīng)用抗生素下單獨應(yīng)用NSAIDs可能對機體免疫功能產(chǎn)生影響[19-22]，但確切機制未明。研究顯示小鼠體溫升高(38.5℃)及以上時，HSP90快速產(chǎn)生，激活免疫細胞表面的α4整合素，使血液循環(huán)中的α4整合素介導(dǎo)的T淋巴細胞高效、快速遷移到淋巴結(jié)和炎癥感染部位清除病原體[23]。本研究顯示肺炎克雷伯桿菌肺炎模型肺組織HSP90水平明顯升高，塞來昔布單獨及與抗生素合用均使其水平降低。熱休克蛋白的重要生理作用是參與免疫應(yīng)答，早期單獨應(yīng)用COX抑制劑降低HSP90是否影響T淋巴細胞的遷移與清除病原體能力有待深入研究。

本研究的不足之處是未檢測外周循環(huán)兩類細胞因子及其他炎癥標志物的水平，未進行肺組織菌落記數(shù)以評價肺清除細菌能力。另外，塞來昔布與抗生素合用有沒有協(xié)同作用還需要更多實驗評價。特異性COX-2抑制劑在肺炎早期減輕機體炎癥反應(yīng)的同時對細胞免疫功能有無影響及其機制也需要今后進一步研究。

綜上所述，本研究顯示特異性COX-2抑制劑塞來昔布可降低大鼠肺炎克雷伯桿菌肺炎肺組織TNF-α、IL-6、IL-1β等致炎細胞因子和TXA2、PGI2、PGE2等前列腺素代謝產(chǎn)物水平，提高抗炎因子IL-10水平，減輕肺組織炎癥細胞浸潤、肺泡間質(zhì)出血；與單用塞來昔布及莫西沙星相比，塞來昔布聯(lián)合莫西沙星在降低致炎細胞因子水平及改善肺組織病變作用方面并無顯著優(yōu)勢。

利益相關(guān)聲明：所有作者均聲明不存在任何利益沖突。

作者貢獻說明：曾量波負責(zé)實驗設(shè)計、數(shù)據(jù)分析、論文撰寫；鐘智成負責(zé)動物實驗、數(shù)據(jù)分析；劉桂紅、汪友平負責(zé)實驗；梁慶負責(zé)技術(shù)指導(dǎo)。