王超 趙鵬 張競美

(青島市胸科醫(yī)院，山東 青島 266043)

肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌引發(fā)的肺部感染性疾病，臨床表現(xiàn)為盜汗、發(fā)熱、月經(jīng)失調(diào)、呼吸困難等癥狀，嚴(yán)重威脅人類的健康〔1〕。結(jié)核分枝桿菌簡稱結(jié)核桿菌，是引起結(jié)核病的病原菌，可侵犯全身器官，其中肺結(jié)核最為多見〔2〕。肺結(jié)核至今仍為重要的傳染病，有報(bào)道顯示，每年約有800萬新病例發(fā)生，至少有300萬人死于該病〔3〕。我國結(jié)核病患病人數(shù)高居世界第2位，肺結(jié)核處于高發(fā)狀態(tài)，因此肺結(jié)核疾病仍是臨床上治療的難題。苦參為豆科愧屬植物苦參的干燥根，是中國歷史悠久的傳統(tǒng)藥物之一〔4〕。苦參屬于清熱燥濕藥，其性味苦寒，有清熱燥濕和利尿的功效〔5,6〕。近些年，國內(nèi)外對苦參的研究重點(diǎn)放在生物堿上，目前已經(jīng)從苦參中分離出27種生物堿?？鄥⑸飰A大多屬于喹諾里西啶類，極少數(shù)為雙哌啶類，以苦參生物堿和氧化苦參堿含量最高，并且苦參堿具有肝細(xì)胞保護(hù)、消炎鎮(zhèn)痛、抑菌抗病毒等多方面的藥理活性〔7,8〕。苦參素膠囊在肺結(jié)核治療中具有良好的保肝作用，因此苦參堿可以制成適宜劑型以便于臨床上更好地治療肺結(jié)核〔9〕。肌醇必需酶(IRE)1是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的跨膜蛋白，哺乳動(dòng)物中存在IRE1α和IRE1β兩種亞型，IRE1α在哺乳動(dòng)物所有的組織細(xì)胞中普遍存在，而IRE1β則存在于呼吸道、胃腸道消化系統(tǒng)的上皮細(xì)胞中〔10〕。IRE1α在不同的組織細(xì)胞中表達(dá)也大不相同，目前還沒有明確報(bào)道證實(shí)IRE1α在肺結(jié)核肺組織中的表達(dá)情況，因此本文建立肺結(jié)核大鼠模型，并給予苦參堿治療干預(yù)，觀察苦參堿對肺結(jié)核大鼠結(jié)核桿菌的抑制作用及其對IRE1信號的表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 大鼠均來中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，共計(jì)60只健康大鼠，體重平均(221.5±1.4)g，正常飼養(yǎng)，保證實(shí)驗(yàn)室清潔，晝夜交換更替，保持實(shí)驗(yàn)室溫度在24℃。

1.2試劑和儀器 苦參堿(上海第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院中西藥研究室)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白試劑盒、一抗二抗去除液(強(qiáng)堿性)、細(xì)胞裂解液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒、IRE1抗體均購自沈陽萬科生物科技有限公司；低溫高速離心機(jī)(湖南湘立科學(xué)儀器有限公司)；成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)；多功能電泳儀購自北京鴻濤基業(yè)科技發(fā)展有限責(zé)任公司。

1.3動(dòng)物分組與模型建立 大鼠隨機(jī)分為正常組、PTB組和Mat組，每組20只。正常組大鼠尾靜脈注射0.2 ml 0.9%氯化鈉注射液。PTB組和Mat組大鼠尾靜脈注射由結(jié)核患者痰液中分離的結(jié)核分枝桿菌，該桿菌已按結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程驗(yàn)證為結(jié)核分枝桿菌，取分裂旺盛的模型菌，用 0.9%氯化鈉溶液溶解，每只大鼠注射0.2 ml細(xì)菌懸液。

造模成功后，正常組和PTB組大鼠給予等量的生理鹽水灌胃干預(yù)；Mat組大鼠給予苦參堿灌胃，每千克大鼠給予30 mg進(jìn)行干預(yù)，3組大鼠給藥干預(yù)1次/d，連續(xù)干預(yù)30 d。

1.4標(biāo)本采集 檢測各組大鼠給藥后第1天、15天和30天體重變化。造模30 d時(shí)，用頸部脫臼法分別處死3組大鼠，留取肺組織，放置在-80℃的冰箱中保存，以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5測定大鼠體重 在給藥后1 d、15 d和30 d時(shí)，分別對正常組、PTB組和Mat組大鼠的體重進(jìn)行測量并比較。

1.6大鼠肺組織結(jié)核分枝桿菌菌落計(jì)數(shù) 取每只大鼠全部左肺組織，加入2 ml 0.9%氯化鈉注射液后研磨成勻漿，再取組織液加等體積4%硫酸消化15 min 后，加入2.5 mol NaOH調(diào)整至pH7.0左右，接種于斜面培養(yǎng)基，置于37℃下培養(yǎng)5 w，計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上結(jié)核分枝桿菌菌落數(shù)。

1.7肺組織病理學(xué)形態(tài)觀察 分別取出正常組、PTB組和Mat組大鼠的肺組織取出，固定后用石蠟進(jìn)行包埋處理，把包埋后的組織進(jìn)行切片，每個(gè)切片組織均為5 μm，切片組織脫蠟后，用蘇木素-伊紅(HE)染色觀察。用顯微鏡對染色的肺組織進(jìn)行觀察，觀察組織形態(tài)的變化。

1.8Western印跡法檢測肺組織中Ire1α和GRP78蛋白的表達(dá) 3組大鼠的肺組織分別提取100 mg，細(xì)胞進(jìn)行裂解并提取核蛋白，并對核蛋白的濃度進(jìn)行測量，分裝后，保存在-20℃的環(huán)境中。將提取出的蛋白溶液和緩沖溶液進(jìn)行混均，按照4∶1的比例進(jìn)行，為了讓蛋白質(zhì)變性需將蛋白溶液全部進(jìn)行煮沸處置。電泳板孔內(nèi)注入蛋白樣品，50 μg。轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上后加脫脂奶粉，封閉1 h。TTBS洗滌要在加入的1抗前進(jìn)行，每次漂洗10 min，一共進(jìn)行3次漂洗，最后加入2抗對溶液進(jìn)行稀釋，再在常溫的環(huán)境中封閉1 h。取出PVDF膜，TTBS漂洗10 min×3，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色后數(shù)碼相機(jī)照相。

1.9qRT-PCR法檢測肺組織中IRE1α和GRP78 mRNA的表達(dá) 分別取出3組大鼠的肺組織，用Trizol將組織進(jìn)行裂解，對總的DNA進(jìn)行提取，所有的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照說明書進(jìn)行，經(jīng)所得到的cDNA進(jìn)行熒光實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)按照反應(yīng)條件嚴(yán)格進(jìn)行擴(kuò)增，變性30 s 95℃，變性5 s 95℃，退火40 s 60℃，一共45個(gè)循環(huán)。取平均值后得到Ct值，計(jì)算方法用2-△△Ct法進(jìn)行分析，引物序列見表1。

表1 引物序列表

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單組間因素分析。

2 結(jié) 果

2.13組大鼠體重比較 給藥后1 d 3組大鼠的體重變化沒有顯著差異(P>0.05)。給藥后15 d和30 d，與正常組體重相比，PTB、Mat組體重顯著降低(P<0.05)；給藥后15、30 d，Mat組體重明顯高于PTB組(P<0.05)，見表2。

2.23組肺組織結(jié)核分枝桿菌菌落計(jì)數(shù)比較 正常組肺組織中沒有結(jié)核分枝桿菌的菌落出現(xiàn)，和正常組大鼠相比，PTB組大鼠的肺組織中結(jié)核分枝桿菌的菌落數(shù)量顯著增多(P<0.05)；Mat組肺組織中結(jié)核桿菌的菌落數(shù)量顯著低于PTB組(P<0.05)，見表3。

2.3肺組織病理變化比較 正常組肺組織沒有出現(xiàn)明顯的病理變化。與正常組相比較，PTB組大鼠肺臟血管周圍有大量的炎性細(xì)胞浸出，并且出現(xiàn)了大量的肉芽腫樣細(xì)胞聚集；肺間質(zhì)之間出現(xiàn)了大量的水腫，大體解剖可見肺臟表面存在白色栗粒狀結(jié)節(jié)。Mat組肺組織病理情況明顯好于PTB組，見圖1。

表2 3組給藥后1 d、15 d和30 d體重比較

表3 3組肺組織結(jié)核分枝桿菌菌落計(jì)數(shù)及IRE1α、 GRP78蛋白表達(dá)比較

圖1 3組肺組織(HE染色，×100)

2.43組肺組織中IRE1α和GRP78蛋白表達(dá)比較 與正常組相比，PTB組肺組織中IRE1α和GRP78蛋白表達(dá)顯著增多(P<0.05)；Mat組肺組織中IRE1α和GRP78蛋白表達(dá)明顯低于PTB組(P<0.05)，見表3、圖2。

圖2 3組肺組織中IRE1α和GRP78蛋白表達(dá)

2.53組肺組織中IRE1α 和GRP78 mRNA表達(dá)比較 與正常組相比較，PTB組肺組織中IRE1α和GRP78 mRNA表達(dá)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Mat組肺組織中的IRE1α和GRP78 mRNA表達(dá)低于PTB組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 3組肺組織中IRE1α、GRP78 mRNA 表達(dá)比較

3 討 論

肺結(jié)核屬于慢性呼吸傳染疾病，主要由結(jié)核分枝桿菌感染肺部導(dǎo)致機(jī)體免疫應(yīng)答紊亂引起，患者可通過呼吸及咳嗽產(chǎn)生飛沫或痰液傳播，影響社會健康〔11〕。肺結(jié)核病程長，病理變化復(fù)雜，臨床表現(xiàn)為機(jī)體細(xì)胞因子分泌失衡、腫瘤壞死因子釋放過多等癥狀，導(dǎo)致患者呼吸系統(tǒng)功能異?！?2〕，嚴(yán)重者會導(dǎo)致肺部空洞，故疾病早期予以良好治療意義重大?？鄥A是從中藥苦豆子中分離出來的單體生物堿，具有提高免疫力、抗病毒、抗炎、抗腫瘤等方面的藥性活性和臨床用途〔13〕。有研究結(jié)果證實(shí)，苦參堿在結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)珠H37RV濃度為104CFV/ml時(shí)，MIC值為10 mg/L，和傳統(tǒng)的方法相比效果更為顯著，由此說明苦參堿有抑制結(jié)核桿菌生長的作用〔14〕。IRE1α具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和功能，是目前報(bào)道的蛋白中唯一一個(gè)同時(shí)具有激酶和核酸內(nèi)切酶活性的蛋白〔15〕。有研究發(fā)現(xiàn)，IRE1α能通過多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和參與炎癥反應(yīng)，并且介導(dǎo)著代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展〔16〕，但目前還沒有實(shí)驗(yàn)證明IRE1α在肺結(jié)核中具體表達(dá)，因此本文給予肺結(jié)核大鼠苦參堿進(jìn)行干預(yù)治療，證實(shí)其對肺結(jié)核結(jié)核桿菌的抑制作用，并觀察苦參堿對肺結(jié)核大鼠肺組織中IRE1α蛋白表達(dá)的影響。

本文建立肺結(jié)核大鼠模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)過苦參堿治療后大鼠的體重明顯回升，并且大鼠狀態(tài)也得到了改善，可見苦參堿可有效改善肺結(jié)核大鼠的癥狀。結(jié)核分枝桿菌菌落計(jì)數(shù)可直接反映肺結(jié)核病的嚴(yán)重程度，本研究結(jié)果說明，苦參堿治療以后，患病大鼠的病癥明顯減輕，結(jié)核治療效果明顯?？鄥A有降低DNA含量的功能，這可能是其抑制結(jié)核桿菌生長的作用之一。吳濤等〔17〕研究發(fā)現(xiàn)檢測苦參堿藥物高低濃度時(shí)，有70%在抑菌濃度范圍內(nèi)，還有23%為高低濃度生長菌，可能是結(jié)核桿菌的耐藥株，其對大多數(shù)抗生素有一定抵抗能力，還有2株為高低濃度敏感株，可能比較脆弱的結(jié)核桿菌株存在。連續(xù)培養(yǎng)30 d后發(fā)現(xiàn)高低濃度的生長菌比例明顯上升，說明苦參堿有顯著的抑菌作用，雖然不能殺死全部的結(jié)核桿菌，但能有效減緩細(xì)菌的生長速度。

在治療抗結(jié)核的藥物中均有不同程度的肝細(xì)胞毒性，治療結(jié)合病中經(jīng)常伴隨著肝細(xì)胞的損傷，而肝細(xì)胞的損傷往往伴隨著細(xì)胞的過度凋亡、而細(xì)胞凋亡最主要的途徑就是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，有研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是肺結(jié)核發(fā)生發(fā)展的重要病理機(jī)制。IRE1信號通路是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路中的經(jīng)典通路，被認(rèn)為與慢性疾病引起的細(xì)胞凋亡有關(guān)〔18〕。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP)78的解離促進(jìn)了IRE1α的激活，驅(qū)動(dòng)多種未折疊的蛋白應(yīng)答相關(guān)的基因表達(dá)，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡〔19〕。GRP78又稱為免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)對受到刺激的細(xì)胞最先進(jìn)行保護(hù)，被稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑的關(guān)鍵標(biāo)志性因子。本研究結(jié)果提示，苦參堿能有效抑制肺結(jié)核肺組織中IRE1α和GRP78的表達(dá)。有研究者把肺結(jié)核患者隨機(jī)分為治療組和對照組，治療組患者給予苦參素膠囊干預(yù)，結(jié)果顯示治療組患者均未出現(xiàn)肝功能損傷，而對照組有1/3患者肝功能受到嚴(yán)重?fù)p傷〔20〕，說明苦參素膠囊在肺結(jié)核化療中同時(shí)具有較高的保肝效果，因此苦參堿可以制成適宜劑型以便于臨床上更好的治療肺結(jié)核。王捷等〔21〕通過對肺動(dòng)脈損傷的大鼠研究證實(shí)，在模型組大鼠肺組織中IRE1信號通路中關(guān)鍵因子IRE1α和GRP78均顯著升高，藥物治療后發(fā)現(xiàn)其表達(dá)得到了顯著的抑制，進(jìn)而降低肺動(dòng)脈的壓力，為肺動(dòng)脈損傷的靶向治療提供新的途徑。

綜上，苦參堿可有效抑制肺結(jié)核結(jié)核桿菌的生長，同時(shí)對肺組織中IRE1α信號通路進(jìn)行抑制，進(jìn)而對肺組織進(jìn)行保護(hù)。