吳仲勝，高譽，杜勇濤，黨頌，何康敏

實驗操作指南

CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)對細胞內(nèi)源蛋白進行熒光標記的實驗操作

吳仲勝1,2，高譽1,2，杜勇濤1,2，黨頌1，何康敏1,2

1. 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，分子發(fā)育生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100101 2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

CRISPR-Cas9是目前廣泛應(yīng)用的基因編輯技術(shù)，可對目的基因進行高效精準編輯，快速實現(xiàn)目的基因的敲除或敲入。Cas9蛋白在sgRNA引導(dǎo)下對靶序列進行剪切并造成DNA雙鏈斷裂，在與剪切位點兩端同源的DNA模板序列存在時，可通過同源重組修復(fù)方式引入外源序列，實現(xiàn)熒光蛋白或其他標簽在基因組上的精準敲入，進而實現(xiàn)對內(nèi)源蛋白進行熒光標簽的融合標記。通過基因編輯技術(shù)對內(nèi)源目的蛋白進行標記，可避免由于過表達造成蛋白質(zhì)定位、動力學(xué)或功能等的潛在影響，可顯著提升細胞成像實驗的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。本文重點介紹了利用CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)對目的蛋白進行熒光蛋白或自標記蛋白標簽標記的方法與操作流程，為構(gòu)建內(nèi)源蛋白熒光標記的哺乳動物細胞系提供參考。

CRISPR-Cas9基因編輯；活細胞；內(nèi)源蛋白；熒光蛋白；自標記蛋白標簽

蛋白質(zhì)的定位與功能密切相關(guān)。通過對各種蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)特別是活細胞內(nèi)的定位、動力學(xué)、分子間互作等進行精準表征和分析，進而研究蛋白質(zhì)的功能和調(diào)控機制等具有重要意義。目前已經(jīng)發(fā)展了多種在活細胞內(nèi)對目的蛋白進行熒光標記的方法，包括熒光蛋白(fluorescent protein)、自標記蛋白標簽(self-labeling protein tag)、熒光共價標記的配體或多肽、非天然氨基酸標記等[1,2]。熒光蛋白標記是最常用的可遺傳編碼的蛋白質(zhì)標記方法，目前已經(jīng)發(fā)展了多種熒光強度和光穩(wěn)定性質(zhì)優(yōu)異的熒光蛋白，其熒光發(fā)射光譜實現(xiàn)了從藍到紅外光譜的覆蓋，可基本滿足激光共聚焦顯微鏡成像、單分子成像和超分辨率成像等不同需求和成像目的[3,4]。HaloTag等自標記蛋白標簽的標記，是另外一種廣泛應(yīng)用的可遺傳編碼的活細胞蛋白標記方法，通過與相應(yīng)熒光染料標記的配體進行共價反應(yīng)，實現(xiàn)對目的蛋白進行特異熒光標記[5,6]。對目的蛋白進行熒光蛋白或自標記蛋白標簽的融合表達，可通過質(zhì)粒瞬時外源過表達、隨機插入基因組的穩(wěn)定過表達或者基因編輯精準插入目的基因等方式實現(xiàn)。CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因編輯體系，通過對目的基因進行精準剪切，在含有熒光蛋白或自標記標簽蛋白cDNA序列的修復(fù)模板的介導(dǎo)下，采用同源重組的方式在目的基因上精準敲入(knock-in)熒光標簽的DNA序列，進而實現(xiàn)對內(nèi)源目的蛋白的熒光標記[7]。通過基因編輯技術(shù)對內(nèi)源蛋白進行熒光標記，可有效避免蛋白質(zhì)過表達可能造成目的蛋白的定位或功能的異常。此外，基因編輯細胞具有更好的均一性和穩(wěn)定性，有效提升了細胞成像實驗的可重復(fù)性，也更有利于對圖像進行定量分析。目前已經(jīng)發(fā)展了多種不同的基因編輯方法和策略，實現(xiàn)對目的蛋白的熒光蛋白或自標記蛋白標簽的標記[8～10]，本文重點闡述了利用CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)，對哺乳動物細胞特定目的蛋白進行熒光蛋白或自標記蛋白標簽標記的方法與操作流程。

1 CRISPR-Cas9基因編輯knock-in實驗設(shè)計

1.1 熒光標簽的選擇

目前已經(jīng)發(fā)展了多種熒光蛋白及變體，包括自身發(fā)光的熒光蛋白如EGFP、拆分熒光蛋白(split fluorescent protein)[11,12]、二聚化依賴熒光蛋白[13]和光激活/光轉(zhuǎn)化熒光蛋白[14]等。常用的自發(fā)光綠色熒光蛋白有EGFP[15]、mEGFP[16]和mNeonGreen[17]，常用的紅色自發(fā)光熒光蛋白有mCherry[18]、TagRFP[19]以及新近發(fā)展的mScarlet/mScarlet-H/ mScarlet-I[20]以及FusionRed-MQV等[21]。其中mNeonGreen、mScarlet-I和FusionRed-MQV等具有較高的量子產(chǎn)率和熒光強度且均為單體，適合于活細胞成像和追蹤。FPbase網(wǎng)站(https://www.fpbase. org/)收錄了目前發(fā)表的各種熒光蛋白的詳細信息，可對各種熒光蛋白的序列、光學(xué)和物理化學(xué)性質(zhì)等進行查詢和比較。

拆分熒光蛋白如拆分GFP (split GFP)是將GFP拆分為GFP11(β-折疊鏈11，殘基215～230)和GFP1-10(β-折疊鏈1～10，殘基1～214)兩個片段，其中GFP11用柔性linker連接到目的蛋白上，GFP1-10單獨表達。GFP11和GFP1-10單獨存在時均不發(fā)光，當共存時會自組裝成為完整可發(fā)光的GFP分子[11]。該系統(tǒng)的優(yōu)勢是GFP11片段較小，降低了對目的蛋白的影響，此外也減少了用于同源重組的模板的長度，使得高通量熒光標記細胞內(nèi)源蛋白成為可能[22]。該系統(tǒng)的另一個優(yōu)勢是降低了背景熒光。

自標記蛋白標簽如HaloTag[23]、SNAP-tag[24,25]和CLIP-tag[26]，是近些年使用逐漸廣泛的一類熒光標記工具。其自身不發(fā)光，但通過與熒光染料標記的配體進行共價反應(yīng)，可對目的蛋白進行熒光染料的標記。新近發(fā)展的Janelia Fluor系列熒光染料，具有亮度高、光穩(wěn)定性高和可穿過細胞膜等優(yōu)異性質(zhì)，適合用于活細胞膜及細胞內(nèi)標簽蛋白的熒光成像和動態(tài)追蹤，也十分適合于活細胞單分子成像和追蹤[27]。此外，通過選擇結(jié)合不同激發(fā)/發(fā)射波長熒光染料的配體，可對目的蛋白進行不同顏色熒光的標記，進而實現(xiàn)多色活細胞成像的目的。

1.2 熒光標簽插入位置以及l(fā)inker的選擇

熒光標簽插入目的蛋白的位置，可位于其N端、C端或中間，具體由該蛋白質(zhì)自身的結(jié)構(gòu)和功能等性質(zhì)決定。通常情況下，通過調(diào)研已發(fā)表文獻或數(shù)據(jù)庫中蛋白結(jié)構(gòu)等，或者在瞬時轉(zhuǎn)染質(zhì)粒上進行多種插入位點嘗試，以確保熒光標簽的插入不會對目的蛋白的定位、動力學(xué)和功能造成影響。此外，為了保證目的蛋白和熒光標簽蛋白的正確折疊以及減少熒光標簽對目的蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響，通常會在目的蛋白和熒光標簽之間插入一段linker蛋白序列，如常用的富含甘氨酸的柔性linker如(GGGGS)3[28]和(GGS)n[29]。在本實驗操作流程中選取(GGS)3作為融合蛋白的linker。

1.3 CRISPR-Cas9體系的選擇

在CRISPR-Cas9系統(tǒng)中，Cas9 (SpCas9)蛋白在gRNA (guide RNA)的引導(dǎo)下完成對DNA的定點切割。Cas9蛋白行使功能需crRNA (crispr RNA)與tracrRNA (trans-activating crRNA)共同參與[30]。通過將crRNA和tracrRNA融合形成sgRNA (single guide RNA)，而后在sgRNA的引導(dǎo)下，Cas9酶定位于特定DNA序列上，進行DNA雙鏈切割和對目的基因進行編輯[7]（圖1）。在利用CRISPR-Cas9體系對靶細胞進行knock-in基因編輯時，其體系成分具有多種選擇，但最終目的是將Cas9核酸酶(可為質(zhì)粒、mRNA、重組蛋白、或者已經(jīng)穩(wěn)定表達Cas9的細胞系等)、sgRNA (可為質(zhì)?；虬瑂gRNA的DNA片段等)、同源重組修復(fù)模板(可為質(zhì)粒、單鏈DNA或者雙鏈DNA等)遞送進入細胞內(nèi)[31]。

在本實驗流程中，將以溶酶體的標志分子LAMP1蛋白為例進行實驗設(shè)計和流程介紹。本文分別選擇了紅色熒光蛋白mScarlet-I和HaloTag為熒光標簽，選擇的linker為(GGS)3。編碼mScarlet-I和HaloTag的cDNA長度分別為696 bp和891 bp，將以pUC19 (Addgene plasmid #50005)為載體構(gòu)建同源重組修復(fù)模板(以下稱之為供體質(zhì)粒)[32,33]?？紤]到實驗的簡捷和穩(wěn)定性，本實驗流程利用pSpCas9(BB)-2A-Puro (Addgene plasmid #62988)或pSpCas9(BB)-2A-GFP (Addgene plasmid #48138)質(zhì)粒遞送Cas9和sgRNA。

圖1 利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)進行熒光標簽基因敲入的示意圖

1.4 同源重組供體質(zhì)粒的設(shè)計

供體質(zhì)粒對同源重組的效率具有重要的影響，在實驗過程中需要注意以下幾點：

1.4.1 目的基因的基因組DNA (genomic DNA, gDNA)和CDS (Coding DNA Sequence)序列的查找：根據(jù)目的基因種屬、基因名稱、轉(zhuǎn)錄本(transcript variant)等信息，在Ensembl、NCBI或者其他網(wǎng)站進行查詢。

1.4.2 插入位點的確定：在確定好熒光標簽插入目的蛋白的位置后，還應(yīng)注意DNA雙鏈斷裂處與插入位點之間的距離不應(yīng)超過100 bp，理想的距離是在10 bp以內(nèi)，這樣可以最大限度地提高同源重組修復(fù)的效率[34]。

1.4.3 供體質(zhì)粒的設(shè)計：供體質(zhì)粒內(nèi)包含了三段拼接的DNA序列，分別是(1)目的基因插入位點上游的DNA序列、(2)插入標簽的DNA序列，(3)目的基因插入位點下游的DNA序列。若插入的是熒光蛋白或自標記蛋白標簽，通常選取插入位點上下游長度約為600～800 bp作為兩側(cè)的同源臂序列。以靶細胞的基因組為模板，利用PCR擴增上下游同源臂的序列，亦可直接合成。

在本實驗流程中，通過查閱文獻以及基于瞬時轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的測試結(jié)果，將熒光標簽插入到目的基因的C端。由于熒光蛋白mScarlet-I和自標記蛋白標簽HaloTag的基因片段較長，供體質(zhì)粒包含的同源臂為的gDNA終止密碼子上下游各約800 bp。同源修復(fù)的供體質(zhì)粒設(shè)計如圖2A和2B所示。

1.5 sgRNA序列設(shè)計

sgRNA在CRISPR-Cas9系統(tǒng)發(fā)揮著引導(dǎo)作用，對knock-in的特異性和效率至關(guān)重要?？山柚癈RISPOR”[35]和“CRISPick”[36]等網(wǎng)站設(shè)計sgRNA，選取特異性和效率俱佳的序列。sgRNA的靶向序列可以位于正義鏈，也可以位于反義鏈，但sgRNA的靶向序列應(yīng)避免4個以上的T結(jié)尾，以防止形成終止轉(zhuǎn)錄信號，且GC含量最佳為40%～60%。為了盡可能提高實驗效率和減少脫靶效應(yīng)，可挑選切割效率高、特異性好的兩條或以上的sgRNA同時測試和開展后續(xù)實驗。

圖2 利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)將mScarlet-I或HaloTag序列插入至LAMP1基因C端的設(shè)計

A: 基因編輯表達LAMP1-mScarlet-I的序列設(shè)計；B: 基因編輯表達LAMP1-Halo的序列設(shè)計；C: pUC19載體的多克隆位點。

2 試劑與材料

實驗相關(guān)的主要試劑與耗材信息詳見表1。

3 基因編輯相關(guān)質(zhì)粒的構(gòu)建

3.1 供體質(zhì)粒的構(gòu)建

3.1.1 gDNA的提?。簩⑴囵B(yǎng)皿中的細胞消化并收集后，使用TIANamp Genomic DNA試劑盒提取gDNA，保存于4℃或–20℃以備后續(xù)使用。

3.1.2 線性化質(zhì)粒的制備：選擇合適的限制性內(nèi)切酶如I在模板質(zhì)粒pUC19的多克隆位點(圖2C)處進行酶切，膠回收后得到線性化的質(zhì)粒。

3.1.3 三段DNA序列的制備：熒光蛋白的編碼序列以已含有該序列的質(zhì)粒為模板，上下游同源臂的堿基序列可直接合成，也可以3.1.1步驟制備的gDNA為模板，經(jīng)PCR擴增和膠回收處理后得到上下游同源臂的DNA片段。需要注意的是，這三段DNA序列彼此連接的區(qū)域以及與質(zhì)粒連接的區(qū)域存在一個片段大小為18～30 bp的同源臂，該片段是通過設(shè)計相應(yīng)的引物進行PCR擴增后添加的。PCR引物的Tm值以56～65℃為宜。

表1 試劑與耗材信息

3.1.4 線性化質(zhì)粒和DNA片段的連接：利用pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit將3.1.3制備的DNA片段和線性化的pUC19載體進行同源重組，得到包含熒光蛋白的供體質(zhì)粒。建議連接時線性化載體與三個DNA片段加入量的摩爾比≥1∶3，三個DNA片段間的摩爾比為1∶1。分子質(zhì)量摩爾數(shù)的轉(zhuǎn)換可借助在線工具NEBiocalculator (https://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation)進行測算。

3.1.5 轉(zhuǎn)化和克隆篩選：按常規(guī)方法對連接產(chǎn)物進行轉(zhuǎn)化，37℃培養(yǎng)12～14 h后，挑取單個菌落至液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)后，經(jīng)測序鑒定后獲得插入序列正確的供體質(zhì)粒。

3.2 sgRNA質(zhì)粒的構(gòu)建

本實驗流程采用的是美國麻省理工學(xué)院張峰實驗室開發(fā)的pSpCas9(BB)-2A-Puro或pSpCas9(BB)- 2A-GFP載體，引物設(shè)計和詳細操作步驟可參考Target Sequence Cloning Protocol (https://media.addgene.org/data/plasmids/62/62988/62988-attachment_KsK1asO9w4owD8K6wp8.pdf)。

3.2.1 線性載體的制備：用限制性核酸內(nèi)切酶將pSpCas9(BB)-2A-Puro或pSpCas9(BB)-2A-GFP質(zhì)粒進行酶切與去磷酸化，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定和膠回收后得到線性化的質(zhì)粒。

3.2.2 sgRNA寡核苷酸雙鏈的制備：根據(jù)選擇的sgRNA，在引物合成時，正向寡核苷酸的5′端加上粘性末端CACCG，同時在反向寡核苷酸的3′端加上堿基C和5′端加上粘性末端CAAA。引物合成后，上下游引物在T4多聚核苷酸激酶的作用下后經(jīng)梯度降溫后得到sgRNA寡核苷酸雙鏈。

3.2.3 sgRNA寡核苷酸雙鏈和線性化質(zhì)粒的連接：將得到的sgRNA寡核苷酸雙鏈加入3.2.1步驟制備的線性化質(zhì)粒中，在連接酶的作用下得到包含sgRNA的重組質(zhì)粒。按常規(guī)方法對連接產(chǎn)物進行轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)，挑取單個菌落至液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)后，經(jīng)測序鑒定后得到含有正確sgRNA序列的質(zhì)粒。

3.3 質(zhì)粒提取

建議使用可有效去除內(nèi)毒素的質(zhì)粒提取試劑盒提取供體質(zhì)粒和sgRNA質(zhì)粒，如利用NucleoBond Xtra Midi Plus試劑盒進行質(zhì)粒提取。

4 細胞轉(zhuǎn)染、分選和鑒定

在本實驗流程中，使用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)對內(nèi)源蛋白進行熒光標記的實驗主要包括以下三個步驟：(1)細胞轉(zhuǎn)染、(2)陽性細胞分選和富集、(3)單克隆細胞的鑒定(圖3)。

圖3 基因編輯細胞系構(gòu)建的實驗流程

4.1 細胞轉(zhuǎn)染

細胞復(fù)蘇傳代一次后，轉(zhuǎn)染前16～24 h將細胞種在6孔培養(yǎng)板中，以轉(zhuǎn)染時細胞密度為70%～80%為宜。按照Lipofectamine? 3000試劑說明書，加入適量供體質(zhì)粒和sgRNA質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染(每孔推薦質(zhì)粒各600～800 ng)。8 h后更換新鮮培養(yǎng)基，24 h后傳代至T75培養(yǎng)瓶中進行擴大培養(yǎng)。

4.2 細胞分選和富集

4.2.1 基因編輯陽性細胞的篩選方式：通常使用熒光(如熒光蛋白和熒光標記后的自標記蛋白標簽)或利用嘌呤霉素(puromycin)等藥物等對基因編輯的陽性細胞進行篩選和富集。若使用的供體質(zhì)粒帶有熒光蛋白或自標記蛋白標簽，則在轉(zhuǎn)染后5～7天，利用流式細胞儀分選并富集帶有熒光的陽性細胞；若供體質(zhì)粒不攜帶熒光標簽，但sgRNA質(zhì)粒帶有熒光標簽時，則在轉(zhuǎn)染24 h后，利用流式細胞儀分選并富集帶有熒光的陽性細胞。對于本實驗流程中構(gòu)建的基因編輯細胞系，其供體質(zhì)粒包含有紅色熒光蛋白mScarlet-I或者HaloTag，因此采用流式細胞儀對表達了mScarlet-I或者經(jīng)熒光標記HaloTag配體染色后的細胞進行富集。

4.2.2 細胞分選樣品準備：將轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)了5～7天的細胞進行消化并離心收集，而后加入適量無酚紅的基礎(chǔ)培養(yǎng)基如a-MEM進行重懸，經(jīng)過45 μm孔徑的細胞篩過濾后(去除細胞團)收集于流式管中。對于轉(zhuǎn)染了LAMP1-HaloTag供體質(zhì)粒的細胞，則需要在胰酶消化前進行染色。例如可使用Janelia Fluor 549 HaloTag配體對細胞進行10～20 min染色(終濃度10～20 nmol/L)，使用PBS洗3遍后，再對其進行消化并離心收集等上述步驟。

4.2.3 陽性細胞分選和富集: 在利用流式細胞儀進行陽性細胞分選時，首先利用未轉(zhuǎn)染的細胞設(shè)置熒光陰性的對照區(qū)域，以此為基礎(chǔ)判斷熒光信號陽性區(qū)域。根據(jù)目的蛋白的不同，首次經(jīng)過流式細胞儀篩選的基因編輯細胞系，陽性率約為0.5%～5%左右，每次收集的陽性細胞數(shù)量可在20,000～50,000左右，隨后將收集于流式管中的陽性細胞轉(zhuǎn)移到48孔板中進行培養(yǎng)，當細胞密度達到95%～100%后傳代至6孔板中進行擴大培養(yǎng)。

注意：在傳代過程中可將少許細胞接種在成像皿中，進行首次成像鑒定，判斷基因編輯細胞的陽性率以及目的蛋白的表達和分布是否正確。若陽性率低于10%，可對陽性細胞擴大培養(yǎng)后進行再次的分選富集；若陽性率較高且目的蛋白的表達和分布正確，可將單細胞分選至96孔板進行培養(yǎng)；若首次成像鑒定發(fā)現(xiàn)目的蛋白的表達和定位異常，則停止分選并調(diào)整實驗設(shè)計。

4.2.4 單克隆細胞分選：根據(jù)實驗需求，可選擇構(gòu)建單克隆細胞，也可通過多次分選獲得高陽性率的細胞群。單克隆細胞系具有單一和穩(wěn)定的優(yōu)點，而對于某些特殊的不適合單克隆生長的細胞系，可通過分選收集陽性細胞群。在本實驗流程介紹中，希望獲得基因編輯單克隆細胞系，因此對熒光標記的LAMP1細胞系進行了單克隆分選。在分選時，流式細胞儀中mScarlet-I陽性細胞的信號區(qū)域分為高、中和低信號區(qū)域，分別代表了mScarlet-I純和敲入、雜合敲入以及未敲入的細胞群。為獲得mScarlet-I純和敲入的細胞系，將高信號區(qū)的陽性細胞，利用流式細胞儀的單細胞分選方式分選至96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)(圖4)。

圖4 利用流式細胞儀分選富集基因編輯表達LAMP1-mScarlet-I的細胞

5 單克隆細胞系的鑒定

5.1 單克隆細胞的初步篩選

分選在96孔板中的單克隆細胞，經(jīng)過2～3周的培養(yǎng)后，在普通倒置顯微鏡的4倍物鏡下可看到明顯的細胞團。選擇生長面積已經(jīng)占據(jù)孔面積1/3及以上的單個細胞團，經(jīng)胰酶消化和培養(yǎng)基中和后，對每個孔中的細胞進行吹打混勻并將其中1/2至2/3細胞傳代至48孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，其余細胞轉(zhuǎn)移至96孔PCR板中相應(yīng)位置，離心(2000×, 室溫10 min)后甩去液體，并倒扣于吸水紙上5 s以除去殘留液體，隨后每孔中加入10 μL QuickExtract DNA提取試劑并上下吹打30次重懸細胞，蓋上膠膜后置于PCR儀中進行細胞裂解和gDNA獲取，反應(yīng)結(jié)束后將gDNA置于4 ℃或者–20 ℃長期保存。

5.2 PCR鑒定純合和雜合單克隆細胞系

5.2.1 基因型鑒定引物設(shè)計：本流程示例中使用的人乳腺癌細胞系SUM159為二倍體細胞，因此對目的基因的熒光標簽敲入會得到純合和雜合兩種類型。由于本示例中是將mScarlet-I插入到目的基因的C端，因此在目的基因的gDNA的終止密碼子處上下游各選取400～500 bp左右的序列(不包含熒光蛋白)，將這段約800～1000 bp的gDNA序列復(fù)制并粘貼至NCBI-Blast-Primer-blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)，按照設(shè)置(PCR片段大小：350～700 bp；Database：Refseg representative genomes)并生成引物，挑選其中特異性較好的2對引物進行后續(xù)測試。

5.2.2 基因型鑒定引物的PCR條件測試：由于需要單克隆鑒定的樣品數(shù)量一般較多，同時對gDNA進行PCR有一定的失敗率，因此可先對PCR引物和條件進行測試。對基因鑒定引物的退火溫度進行梯度溫度測試，同時設(shè)置陰性對照和陽性對照。PCR后進行凝膠電泳，根據(jù)條帶的大小位置以及特異性等特征選擇合適的引物和退火溫度。

5.2.3 基因鑒定結(jié)果分析：利用預(yù)實驗中得到的合適的PCR引物和條件，對挑選在96孔PCR板中的gDNA使用GoTaq酶進行PCR鑒定。以在SUM159細胞上基因編輯表達LAMP1-mScarlet-I為例，通常會得到三種PCR結(jié)果(圖5A)：(1)未實現(xiàn)基因編輯的單克隆的PCR產(chǎn)物，只有分子量較小的一條帶(設(shè)計大小為403 bp)；(2)單等位基因敲入(雜合)單克隆的PCR產(chǎn)物有兩條帶，其中一條分子量小(設(shè)計大小為403 bp)的條帶為未插入mScarlet-I序列的PCR產(chǎn)物，另一條分子量較大的條帶為插入了mScarlet-I序列的PCR產(chǎn)物(設(shè)計大小為1126 bp)；(3)雙等位基因敲入(純和)只有一條分子量較大的條帶(設(shè)計大小為1126 bp)。

5.3 PCR鑒定熒光標簽插入位點的準確性

對于5.2得到的陽性克隆(純合或者雜合單克隆細胞系)，還需要判斷熒光標簽的cDNA是否插入了目的基因的正確位置。通常會設(shè)計檢測插入位置的引物進行PCR鑒定，其中一條引物位于熒光蛋白的N或者C端，另外一條引物位于插入位置900～ 1200 bp之外的gDNA上(位于同源重組模板序列之外)。在本示例中，正向引物位于mScarlet-I的序列的C末端附近，而反向引物位于在終止密碼子的下游約900～1200 bp。經(jīng)過PCR擴增和凝膠電泳后，判斷是否有條帶以及得到的電泳條帶片段與預(yù)期大小是否相符。若擴增出電泳條帶且片段大小符合預(yù)期，則可初步判定插入的熒光標簽序列的位置位于目的基因的相應(yīng)位置(圖5B)，對這些克隆可進一步測序鑒定插入是否準確。

圖5 利用PCR鑒定基因編輯表達LAMP1-mScarlet- I的單克隆細胞的基因型

A：利用PCR鑒定純合和雜合單克隆細胞系的引物設(shè)計和瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；B：利用PCR鑒定基因插入位點的引物設(shè)計和瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。

5.4 單克隆細胞生長和形態(tài)觀察

對于上述步驟鑒定出的陽性克隆，需要在普通光學(xué)顯微鏡下進行觀察和鑒定。與野生型的細胞相比，選擇細胞大小、形態(tài)、生長速度等相似的基因編輯細胞克隆并做好標記以備下一步鑒定，舍棄細胞形態(tài)等明顯異常的基因編輯細胞克隆。

5.5 單克隆細胞蛋白表達鑒定

本步驟的目的是在蛋白水平上驗證基因編輯的準確性以及檢測基因編輯細胞系中目的蛋白的表達是否受到影響。通過BCA法測量每個樣品的蛋白濃度并校準上樣量后，采用Westen blot檢測特定抗體結(jié)合的蛋白條帶大小和條帶的灰度值，進而判定基因編輯細胞系中目的蛋白是否與熒光蛋白標簽融合表達，以及基因編輯后目的蛋白的表達水平是否發(fā)生變化。本文中mScarlet-I標記LAMP1的不同基因型的陽性克隆Westen blot鑒定結(jié)果如圖6A。

此外，根據(jù)目的蛋白的不同，還可進行進一步的相應(yīng)功能鑒定，以確?；蚓庉嫽驘晒鈽撕灥牟迦雽δ康牡鞍椎墓δ芪丛斐捎绊?。

5.6 單克隆細胞的成像鑒定和測序驗證

將5.5步驟中挑選出的細胞克隆經(jīng)胰酶消化后，將大部分細胞傳代到6孔板進行培養(yǎng)以備凍存；另傳代少許陽性細胞系克隆至成像皿上，16～24 h后在顯微鏡上進行熒光成像鑒定分析(圖6B)。同時取少許細胞于PCR管中，進行第二次基因型和插入位點準確性的鑒定，操作流程同5.2和5.3。

6 結(jié)語

利用基因編輯技術(shù)，對內(nèi)源目的蛋白進行快速準確的熒光標記，為研究蛋白質(zhì)的定位、動力學(xué)和互作等提供了重要工具。例如，通過基因編輯技術(shù)技術(shù)對網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞過程中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)分子進行熒光蛋白標記，結(jié)合活細胞單分子熒光成像，揭示了網(wǎng)格蛋白包被內(nèi)吞囊泡組裝、剪切和脫包被等過程中相關(guān)分子的動力學(xué)特征和機制[37,38]。本文對利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，對目的蛋白進行熒光蛋白或自適應(yīng)蛋白標簽進行標記的實驗設(shè)計和實驗流程進行了梳理和介紹?；诒緦嶒炇以诨蚓庉嫾毎禈?gòu)建中總結(jié)的經(jīng)驗，對細胞篩選富集和單克隆鑒定部分進行了詳細介紹，以期為其他團隊在哺乳動物細胞中進行基因編輯細胞系的構(gòu)建提供參考，提高基因編輯細胞系構(gòu)建的效率。本文介紹的CRISPR-Cas9基因編輯實驗流程，也適用于構(gòu)建如APEX2和Flag等標簽敲入的細胞系。與此同時，多種其他的用于蛋白標簽knock-in的基因編輯技術(shù)，例如利用Cas9D10A切口酶、CRISPR-Cpf1和非同源重組方法等[10,31,39]，也展現(xiàn)出了在特定應(yīng)用場景下的優(yōu)勢，研究者可根據(jù)研究的需要選取最合適的工具。

圖6 Western blot和共聚焦成像鑒定基因編輯表達LAMP1-mScarlet-I的單克隆細胞

A：利用Western Blot鑒定純合和雜合的單克隆細胞系；B：利用轉(zhuǎn)盤式共聚焦顯微鏡對基因編輯表達LAMP1-mScarlet-I的單克隆細胞的中間層進行成像。標尺10 μm。

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The protocol of tagging endogenous proteins with fluorescent tags using CRISPR-Cas9 genome editing

Zhongsheng Wu1,2, Yu Gao1,2, Yongtao Du1,2, Song Dang1, Kangmin He1,2

The currently widely used CRISPR-Cas9 genome editing technology enables the editing of target genes (knock-out or knock-in) with high accuracy and efficiency. Guided by the small guide RNA, the Cas9 nuclease induces a DNA double-strand break at the targeted genomic locus. The DNA double-strand break can be repaired by the homology-directed repair pathway in the presence of a repair template. With the repair template containing the coding sequence of a fluorescent tag, the targeted gene can be inserted with the sequence of a fluorescent tag at the designed position. The genome editing mediated labeling of endogenous proteins with fluorescent tags avoids the potential artifacts caused by gene overexpression and substantially improves the reproductivity of imaging experiments. This protocol focuses on creating mammalian cell lines with endogenous proteins tagged with fluorescent proteins or self-labeling protein tags using CRISPR-Cas9 genome editing.

CRISPR-Cas9 genome editing; live cell; endogenous protein; fluorescent protein; self-labeling protein tag

2022-12-02;

2023-01-06;

2023-01-09

國家自然科學(xué)基金項目(編號：91957106，31970659)和國家重點研發(fā)計劃(編號：2021YFA0804802，2022YFA1304500)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 91957106, 31970659), and the Ministry of Science and Technology of the People’s Republic of China (Nos. 2021YFA0804802, 2022YFA1304500)]

吳仲勝，博士研究生，專業(yè)方向：細胞脂質(zhì)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。E-mail: zswu@genetics.ac.cn

高譽，博士研究生，專業(yè)方向：細胞脂質(zhì)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。E-mail: gaoyu@genetics.ac.cn

杜勇濤，博士研究生，專業(yè)方向：細胞囊泡運輸。E-mail: duyongtao@genetics.ac.cn

吳仲勝、高譽和杜勇濤并列第一作者。

何康敏，博士，研究員，研究方向：細胞囊泡運輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。E-mail: kmhe@genetics.ac.cn

10.16288/j.yczz.22-395

(責任編委: 史岸冰)